CN109651525B - 一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法，属于生物工程领域。在热凝胶发酵液中，微生物菌体包裹在不溶性的热凝胶内，很难将两者分离开来。为在工业规模下获得低含氮量的高品质热凝胶产品，需分离去除微生物菌体。本发明对热凝胶发酵液进行第一次压滤后的固形物进行处理，将之溶解于碱性溶液中，进而采用均质法使内含的不溶性胶质物完全溶解，采用中性红和苯胺蓝进行染色和显微镜观察和检验，确保碱溶后不含有不溶性胶质物，能够显著提高后续压滤速率和除菌率，从而有益于工业规模下提高热凝胶最终产品的品质。

Description

一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法，属于生物工程领域。

背景技术

热凝胶(Curdlan)又称凝胶多糖、可德兰胶、可得然胶等，是一种由微生物产生的胞外多糖，是以β-1,3-糖苷键连接而成的直链大分子，分子式为(C₆H₁₀O₅)_n。由于热凝胶独特的胶凝性质及其安全性，热凝胶在食品、工业、农业、药物等领域均具有大量的应用。热凝胶应用在食品方面可以作为增稠剂、稳定剂和胶凝剂等，同时还可以改善食品的口感和品质。

热凝胶一般通过土壤杆菌或产碱杆菌通风发酵获得，以葡萄糖、蔗糖和糖蜜等为发酵碳源。热凝胶合成是典型的非耦联发酵过程，当培养基中的氮源耗尽时，微生物才开始合成热凝胶，发酵过程中控制合适的pH、碳源、氮源浓度有利于获得高浓度的热凝胶，因此已开发了补料发酵生产工艺，制备得到的热凝胶浓度为30-70g·L^-1，而其中的菌体浓度为7-25g·L^-1，除此之外外，热熔胶发酵液中还有一些残糖、有机酸、色素和无机盐等复杂成分。

在大规模的热凝胶提取过程中，目前国内生产企业的提取工艺较为低效，其工艺流程如图1所示。热凝胶发酵液经压滤I处理后，得到的固形物中含有热凝胶、菌体和发酵液残留成分，加入净水后进行搅拌分散，进行压滤III，以去除部分游离的微生物菌体、无机盐和小分子物质，所得的滤饼中主要含有热凝胶和菌体，再加入乙醇后进行压滤IV，以进一步脱除色素、小分子物质和水分，减少固形物体积，最后得到的滤饼进行切割成小颗粒，进入到真空干燥机中干燥，最终得到热凝胶产品。由于整个流程中未进行专门的除菌操作，所得到的热凝胶品中仍含有大量的菌体，而残存的菌体是影响热凝胶产品品质的重要指标之一。在当前的热凝胶工业提取过程中，仅分离去除部分微生物菌体，能符合热凝胶产品的中国国家标准，但热凝胶品质与国际优质产品仍有不少差距，很难获得高品质的热凝胶产品，如何在工业规模下将微生物菌体从热凝胶发酵液中高效去除，是分离和纯化获得高品质热凝胶的关键技术。

目前国内现有的热凝胶工业提取工艺过程中，没有独立的去除菌体单元，因此国内热凝胶产品(GB 28304-2012)中的含氮量(≤1.5％)远高于联合国粮农组织和世界卫生组织下的JECFA标准(Curdlan INS No.424)的含氮量(≤0.3％)。发酵过程中培养基的氮源耗尽时才能开始合成热凝胶，因此热凝胶发酵液中的含氮物质只有菌体物质，产品中的含氮物质是由残留的菌体细胞所组成的。由于热凝胶不溶于水，因此需要先将热凝胶溶于碱液或溶剂中，再实施固-液分离过程。在实验室规模下，热凝胶常见的提取方式为碱溶-离心法，可以在实验室规模下提取得到较纯的热凝胶，但由于热凝胶的碱溶胶具有很高黏度，同等的离心效果远非工业离心设备所能达到的，因此很难在工业规模下实现高效地分离去除微生物菌体。

在工业规模下，从热凝胶发酵液中去除菌体细胞之所以难以有所突破，是因为其中存在着几个关键性的问题：(1)热凝胶不溶于水，直接去除菌体细胞属于固-固分离，为此我们需要利用热凝胶溶于碱的性质，将分离转化为固-液分离；(2)热凝胶的碱溶胶黏度高，流动性差，所以碱溶胶的流变学规律直接影响响着固-液分离的难易程度；(3)在压滤时，滤布容易被凝胶性物质堵塞，压滤速度下降严重，因此需要对影响压滤的因素进行分析和技术突破。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是去除热凝胶发酵液中的菌体细胞。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：对热凝胶发酵液进行压滤处理，在压滤后得到的固形物中加入碱性化合物溶液，充分搅拌混合后，再进行均质处理得到热凝胶碱溶胶，待确认热凝胶碱溶胶中无不溶性胶质物后，再进行第二次压滤处理，去除发酵液中的微生物菌体，以获得含氮量小于0.3％的热凝胶碱溶胶滤出液。

在本发明的一种实施方式中，所述确认热凝胶碱溶胶中无不溶性胶质物的方法为显微镜镜检。

在本发明的一种实施方式中，所述显微镜镜检方法为：取一滴热凝胶碱溶胶样品，经染色剂染色后再利用光学显微镜观察是否有不溶性胶质物存在，所述染色剂染色为中性红和苯胺蓝的混合染色剂。

在本发明的一种实施方式中，所述显微镜镜检的放大倍数为40～400倍。

在本发明的一种实施方式中，所述碱性化合物溶液为NaOH溶液、KOH溶液、Na₃PO₄溶液、K₃PO₄溶液或Na₂CO₃溶液中的任一种。

在本发明的一种实施方式中，所述碱性化合物溶液的终浓度为0.2-0.8mol·L^-1。

在本发明的一种实施方式中，所述热凝胶碱溶胶中热凝胶的含量为1.0wt％-5.0wt％。

在本发明的一种实施方式中，所述的均质处理为中、高压均质机处理或高速破碎剪切机处理中的任一种。

在本发明的一种实施方式中，所述中、高压均质机处理的均质压力为10-50MPa，连续处理，处理流速取决于均质机设备的规格和处理能力；所述高速破碎剪切机处理的转速为3000-5000r·min^-1，处理时间为1-5h。

在本发明的一种实施方式中，所述压滤处理所用的设备为厢式板框压滤机或隔膜式板框压滤机。

在本发明的一种实施方式中，所述第二次压滤处理中的过滤压力为0.8-2.5MPa，过滤前在热凝胶碱溶胶中添加过滤前在热凝胶碱溶胶中添加2-20g·L^-1助滤剂，所述助滤剂为珍珠岩、硅藻土、凹凸棒土中的任一种或几种。

在本发明的一种实施方式中，在第二次压滤处理步骤前，在碱性化合物水溶液中添加2-20g·L^-1助滤剂，配制成不含热凝胶的悬浊液，预涂压滤机的滤布，以利于后续压滤的有效进行。

在本发明的一种实施方式中，所述方法获得无菌体或菌体量显著减少的热凝胶碱溶胶滤出液后，还包括中和、水洗涤、乙醇洗涤脱水脱盐、切粒、真空干燥、粉碎和包装，即可获得热凝胶产品。

本发明取得的有益效果：

(1)本发明方法利用均质搅拌使得热凝胶碱溶胶中的不溶性胶质物的完全溶解，使得第二次压滤处理(压滤II)的过滤速度可达到20-60L·m^-2·min^-1，比未经均质处理的过滤速度提升了10-15倍，处理效率得到了极大的提升；

(2)本发明在压滤前设置了凝胶颗粒的镜检步骤，是为了确保不溶性胶质物的完全去除，在本发明中，通过采用中性红和苯胺蓝的混合物对热凝胶碱溶胶进行染色，使得不溶性胶质物能够在显微镜下被发现，从而有助于确认其是否能够全部去除，这是本发明中压滤法去除菌体细胞的前提和关键步骤之一，而常规的压滤工艺，由于没有镜检这一步骤，不易察觉严重影响压滤速率的关键因素，因此常规的压滤工艺过滤速度较低，严重的降低了生产效率；

(3)本发明方法在进行压滤之前，需要对压滤机进行NaOH溶液对压滤机进行循环清洗，同时使得压滤机和滤布处于碱性环境，使得其后续的压滤更容易进行；

(4)利用本发明方法进行去除热凝胶发酵液中菌体细胞，菌体细胞的去除率高达80％，得到热凝胶的含氮量小于0.3wt％，能够获得高品质的热凝胶产品，能够实现高品质的热凝胶产品的工业化生产。

附图说明

图1：现有工业生产技术中的热凝胶提取工艺。

图2：本发明的热凝胶去除菌体细胞工艺。

图3：本发明中压滤II中去除菌体细胞工艺的实验结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

生物量(菌体量)、热凝胶含量及不溶物的测定：干重法，参考AppliedBiochemistry&Microbiology,2014,50(1):35-42。

菌体去除率计算：(V₀X₀-V₁X₁)/V₀X₀，式中V₀和X₀是压滤II前热凝胶碱溶胶的体积和菌体浓度，X₁是压滤II后滤出液中热凝胶碱溶胶的体积和菌体浓度。

热凝胶回收率计算：V₁P₁/V₀P₀，式中V₀和P₀分别是操作处理前热凝胶的体积和浓度，V₁和P₁是操作处理后滤出液中热凝胶的体积和浓度。

凝胶强度的测试方法：取5g热凝胶湿胶置于烘干至恒重的锡箔纸上，105℃烘至恒重后称量，分别计算出湿胶与干胶重量，分析其含水率。取15g热凝胶湿胶，根据其含水率补充或高速离心去除部分水使其热凝胶浓度为20g·L^-1，按照国家标准GB 28304—2012所述方法测定热凝胶的凝胶强度。采用MD-NJ-5凝胶强度测定仪分析凝胶强度，探头为圆柱形探头，平末端面积1cm²。样品截面积大于探头面积，穿刺模式，测试前速度1mm·s^-1，测试时速度为1mm·s^-1，测试后速度为1mm·s^-1，得到破裂曲线，根据负荷-时间曲线计算凝胶强度，凝胶强度的计算公式为：W＝F/A，式中W为凝胶强度，单位g·cm^-2；F为凝胶破裂时曲线急剧下降拐点的力，单位克力(g)；A为探头末端平面面积，单位cm²。

热凝胶中含氮量的分析方法：GB/T 609-2018。在热凝胶发酵液及其产品中，菌体量与含氮量基本符合以下关系：1.0g-菌体量≈0.10-0.12g-N。

压滤机的预处理方法：如果用水清洗压滤机及其滤布后，那么当热凝胶碱溶胶进入到压滤机内后，溶解的热凝胶遇水后将会很快析出不溶性的热凝胶胶质物，从而堵塞在滤布上，导致压滤过程无法持续进行，为了避免堵塞情况对实验结果造成干扰，在每次实验之前，先采用0.5mol·L^-1NaOH溶液对压滤机进行循环清洗1h，同时使得压滤机和滤布处于碱性环境，以便于后续实验的进行。

显微镜镜检方法：在酸性和中性条件下，苯胺蓝可与热凝胶特异性结合而染色，但在碱性环境下，苯胺蓝难以着色；碱性染料中性红可以在碱性条件下对热凝胶进行着色，因此用10g·L^-1苯胺蓝和10g·L^-1中性红混合染色液对热凝胶进行染色镜检观察；取10mL20g·L^-1的热凝胶碱溶样品，滴加数滴混合染色液，混匀染色3min，通过光学显微镜观察热凝胶在碱溶过程中的形态，已确定是否存在不溶性胶质物，若不存在，则直接进行压滤，若存在，则继续进行均质等处理，并再次进行镜检，直至无不溶性胶质物存在再进行压滤。

实施例1

按照图2所示的工艺，压滤去除菌体细胞的方法：收集7.5L发酵所得热凝胶发酵液(热凝胶含量为40g·L^-1)进行板框压滤，去除滤液，得到热凝胶和菌体的湿混物；将所得的湿混物溶解在30L 0.5mol·L^-1的NaOH溶液中，热凝胶终浓度为10g·L^-1，采用机械搅拌器在600r·min^-1的搅拌速度下搅拌1h，再采用GEANiro高压均质机对得到的混合后碱溶胶进行均质，均质压力为50MPa，流量为3L·min^-1，利用显微镜镜检的方法检测发现碱溶胶中无不溶性胶质物，完全溶解后得到的碱溶胶用于压滤实验，向均质后得到的30L碱溶胶中添加400g快速型珍珠岩，充分混合搅拌悬浮。先用0.5mol·L^-1的NaOH溶液循环清洗压滤机和滤布0.5h；另取100g快速型珍珠岩与10L 0.5mol·L^-1的NaOH溶液混合作为预涂珍珠岩，预涂珍珠岩的过程中，滤出的液液循环流回到预涂罐，从而对压滤机在碱性条件下预处理，使得滤腔中形成预涂滤饼，热凝胶碱溶胶以0.8MPa的压力进料，进行压滤实验，压滤初始阶段，滤出液较为浑浊，含有少量助滤剂，干扰对热凝胶不溶物去除率的计算，因此将初始收集的10L滤出液倒回储液桶，进行循环压滤；持续收集滤出液，并记录滤出液体积和过滤时间的对应关系，得到过滤曲线，如图3所示。同时在压滤过程中对收集的滤出液进行取样分析，测定其热凝胶回收率、菌体去除率和凝胶强度。

由图3可知，本发明方法通过对热凝胶碱溶胶进行均质处理，在确保没有不溶性胶质物存在的条件下，进行压滤，使得热凝胶碱溶胶中的不溶性胶质物的完全溶解，使得第二次压滤处理(压滤II)的过滤速度可达到20-63L·m^-2·min^-1，比未经均质处理的过滤速度提升了10-15倍，处理效率得到了极大的提升。

测定热凝胶的回收率、菌体去除率和凝胶强度分别为82％、80％和750g·cm^-2，最终得到的热凝胶产品含氮量为0.26％，达到JECFA标准中含氮量的相关指标。传统方法由于未进行均质处理，采用了简单的加水漂洗方法，菌体去除率仅为32％左右，而采用本发明后，菌体去除率提升了2.5倍。

实施例2

压滤去除菌体细胞的方法：收集1000L发酵所得热凝胶发酵液(热凝胶含量为60g·L^-1)进行隔膜板框压滤，去除滤液，得到热凝胶和菌体的湿混物，溶解在3000L0.7mol·L^-1的KOH溶液中，热凝胶终浓度为20g·L^-1，采用机械搅拌器在100r·min^-1的搅拌速度下搅拌1h，再采用高压均质机进行均质，均质压力为40MP，流量为10m³·h^-1，利用显微镜镜检的方法检测发现碱溶胶中无不溶性胶质物，溶解后得到的碱溶胶用于压滤，向均质后得到的3000L热凝胶碱溶胶中添加30kg硅藻土，充分混合搅拌悬浮；另取10kg硅藻土与1000L 0.7mol·L^-1的KOH溶液混合作为预涂硅藻土，压滤机预处理后，将预涂硅藻土预涂，使得滤腔中形成预涂滤饼，热凝胶碱溶胶以1.0MPa的压力进料，进行压滤，持续收集滤出液，再利用高压水对滤饼进行压榨(压榨压力为2.0MPa)，在压滤过程中对收集的滤出液进行取样分析，测定其热凝胶回收率、菌体去除率和凝胶强度。

测定热凝胶的回收率、菌体去除率和凝胶强度分别为83％、78％和720g·cm^-2，过滤速度在18-65L·m^-2·min^-1范围内，最终得到的热凝胶产品含氮量为0.25％。

实施例3：

收集10m³发酵所得热凝胶发酵液(热凝胶含量为55g·L^-1)进行隔膜板框压滤，去除滤液，得到热凝胶和菌体的湿混物，溶解在30m³ 0.5mol·L^-1的NaOH溶液中，热凝胶终浓度为18.3g·L^-1，采用机械搅拌器在100r·min^-1的搅拌速度下搅拌1h，再采用高压均质机进行均质，均质压力为40MP，流量为10m³·h^-1，利用显微镜镜检的方法检测发现碱溶胶中无不溶性胶质物，溶解后得到的碱溶胶用于压滤，向均质后得到的30m³碱溶胶中添加300kg硅藻土，充分混合搅拌悬浮；另取20kg硅藻土与2000L 0.5mol·L^-1的NaOH溶液混合作为预涂硅藻土，压滤机预处理后，将预涂硅藻土预涂，使得滤腔中形成预涂滤饼，热凝胶碱溶胶以1.0MPa的压力进料，进行压滤，持续收集滤出液，再利用高压水对滤饼进行压榨(压榨压力为2.0MPa)，在压滤过程中对收集的滤出液进行取样分析，测定其热凝胶回收率、菌体去除率和凝胶强度。

测定热凝胶的回收率、菌体去除率和凝胶强度分别为80％、81％和700g·cm^-2。过滤速度在15-60L·m^-2·min^-1范围内，最终得到的热凝胶产品含氮量为0.28％。

对比例1：

未进行均质和压滤II操作，实施过程和操作步骤如图1所示。收集1000L发酵所得热凝胶发酵液(热凝胶含量为60g·L^-1)进行隔膜板框压滤(压滤I)，去除滤液，得到热凝胶和菌体的湿混物，加入净水定容至6000L，使热凝胶终浓度为10g·L^-1，采用机械搅拌器在100r·min^-1的搅拌速度下搅拌1h使热凝胶颗粒物分散，所得的悬浊液以1.0MPa的压力进料，进行压滤(压滤III)，弃除滤出液，再利用高压水对滤饼进行压榨(压榨压力为2.0MPa)，收集滤饼，分析滤饼中的热凝胶含量、菌体量和凝胶强度。测定热凝胶的回收率、菌体去除率和凝胶强度分别为87％、32％和750g·cm^-2，最终得到的热凝胶产品含氮量为1.3％。

对比例2：

未对热凝胶碱溶胶进行均质处理，采用机械搅拌器在600r·min^-1的搅拌速度下搅拌2h，无明显不溶性胶质存在，肉眼判断热熔胶溶解完全，取10mL此时的热凝胶碱溶胶待进行显微镜镜检，其它操作和步骤同实施例1。如图3(实心圈和空心圈数据)所示，未进行均质处理时，第二次压滤处理(压滤II)的过滤速度仅为0.2-4.0L·m^-2·min^-1。压滤刚开始时滤布即受到堵塞，压滤过程无法持续进行下去，所得滤液仅为3.0L。

测定热凝胶的回收率、菌体去除率和凝胶强度分别为8.0％、10％和700g·cm^-2。通过显微镜镜检发现，肉眼判断溶解完全的热熔胶碱溶胶中仍存在大量的不溶性胶质存在，这些凝胶性的颗粒物会堆积在滤布附近，阻止过滤的持续进行，从而显著影响过滤速度和除菌体的效果。

因此，可见，肉眼判断的热凝胶的溶解完全并不正确，尤其是在工业放大规模下，这是因为在工业放大的过程中，存在操作的限制，例如高速离心无法实现，使得工业放大出现问题，本发明通过结合均质处理和显微镜镜检相结合的方式，能够精准的判断热凝胶碱溶胶的溶解状态，从而能够使得工业放大过程中过滤速率显著增大，且能够除去80％以上的菌体，得到的热凝胶的质量符合国际JECFA标准，制备得到高质量的热凝胶产品。

对比例3

未用0.5mol·L^-1NaOH溶液对压滤机进行循环清洗，将预涂的珍珠岩悬浮于10L净水中并进行预涂操作，其余操作和步骤同实施例1。压滤刚开始时滤布即受到堵塞，压滤过程无法持续进行下去，所得滤液仅为10L。测定热凝胶的回收率、菌体去除率和凝胶强度分别为20％、32％和710g·cm^-2。可见碱预涂能够极大的促进热凝胶碱溶液的过滤，因此是必不可少的操作。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法，其特征在于，所述方法为：对热凝胶发酵液进行压滤处理，在压滤后得到的固形物中加入碱性化合物溶液，充分搅拌混合后，再进行均质处理得到热凝胶碱溶胶，待确认热凝胶碱溶胶中无不溶性胶质物后，再进行第二次压滤处理，去除发酵液中的微生物菌体，以获得含氮量小于0.3%的热凝胶碱溶胶滤出液；

所述确认热凝胶碱溶胶中无不溶性胶质物的方法为显微镜镜检；

所述显微镜镜检为：将热凝胶碱溶胶经染色剂染色后再利用光学显微镜观察是否有不溶性胶质物存在，所述染色剂染色为采用中性红和苯胺蓝的混合染色剂对热凝胶碱溶胶进行染色；

所述第二次压滤处理前，在碱性化合物水溶液中添加2-20 g·L^-1助滤剂，配制成不含热凝胶的碱性悬浊液，预涂压滤机滤布，以利于后续压滤的有效进行。

2.根据权利要求1所述的一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法，其特征在于，所述碱性化合物溶液为NaOH溶液、KOH溶液、Na₃PO₄溶液、K₃PO₄溶液或Na₂CO₃溶液中的任一种，所述碱性化合物溶液的终浓度为0.2-0.8 mol·L^-1。

3.根据权利要求1所述的一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法，其特征在于，所述热凝胶碱溶胶中热凝胶的含量为1.0wt%-5.0wt%。

4.根据权利要求2所述的一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法，其特征在于，所述热凝胶碱溶胶中热凝胶的含量为1.0wt%-5.0wt%。

5.根据权利要求1-4任一所述的一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法，其特征在于，所述均质处理为中、高压均质机处理或高速破碎剪切机处理中的任一种。

6.根据权利要求5所述的一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法，其特征在于，所述中、高压均质机处理的均质压力为10-50 MPa；所述高速破碎剪切机处理的转速为3000-5000 r·min^-1。

7.根据权利要求1-4或6任一所述的一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法，其特征在于，所述第二次压滤处理中的过滤压力为0.8-2.5 MPa，过滤前在热凝胶碱溶胶中添加2-20 g·L^-1助滤剂，所述助滤剂为珍珠岩、硅藻土、凹凸棒土中的任一种或几种。

8.根据权利要求5所述的一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法，其特征在于，所述第二次压滤处理中的过滤压力为0.8-2.5 MPa，过滤前在热凝胶碱溶胶中添加2-20 g·L^-1助滤剂，所述助滤剂为珍珠岩、硅藻土、凹凸棒土中的任一种或几种。

9.权利要求1-8任一所述的一种去除热凝胶发酵液中菌体细胞的方法在从热凝胶发酵液中纯化获得热凝胶中的应用。

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