CN101550199A - 一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法，属于化学工艺制备领域，发酵液直接经过乙醇沉淀、彻底脱水、溶解液中选择性加入活性炭过滤、超滤、乙醇沉淀、洗涤脱水干燥、成品包装而制得透明质酸钠，本发明具有步骤简单，成本较低，尤其是超滤技术适合大规模的工业化生产。

Description

一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法

技术领域

本发明涉及一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法，尤其是从透明质酸发酵液中制备高分子量、低蛋白质含量的透明质酸钠。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)，又名透明酸或玻璃酸，是一种大分子粘多糖，广泛存在于生物体的结缔组织中。在不同组织中HA的生理作用有所不同，如在皮肤中主要表现为保水作用；在关节滑液中主要为润滑作用；在血管壁中主要是调节通透性。另外，HA作为聚阴离子电解质，分子上所带的大量负电荷，可调节周围正负离子的浓度，抑制多种酶的活性，广泛应用于眼科粘性手术、治疗关节病、软组织修复和作为药物载体等，特别是在预防和减少外科手术后组织粘连中取得了较大的进展。

提取HA不但要求高的提取率和其分子不发生解聚，而且要求高的产品纯度，而从发酵液中提取HA的工艺过程会直接影响着HA的产量、质量和生产成本。微生物发酵生产HA不仅降低了HA的生产成本，而且具有较高的质量和良好的品质，故采用微生物发酵法生产透明质酸，大大拓宽了HA的来源，推动了HA的研究和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用透明质酸发酵液制备高品质、高得率透明质酸钠的方法，该工艺操作简便、高效、费用低廉、成品纯度高、环境污染小、易于工业化。

本发明的具体技术方案为：

一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法，其工艺流程为将透明质酸发酵液经处理通过过滤，去除杂质得清液，向清液中加入氯化钠，经乙醇沉淀，脱水即得。

其具体步骤为：(1)乙醇沉淀：向透明质酸发酵液中加入乙醇，沉淀至终点酒精度数为50％～65％，充分搅拌，静置，得沉淀物透明质酸；

(2)彻底脱水：取出沉淀物透明质酸，用乙醇将沉淀彻底脱水；

(3)沉淀溶解：将已经脱水的透明质酸搅拌溶解成0.1％-0.2％浓度，加入0.1％-2％的硅藻土，搅匀，过滤得滤液；

(4)去除杂质：在0.5MPa以下、用截留分子量为30,000～50,000的超滤膜对滤液进行超滤，去除金属离子和小分子的有色物质；

(5)乙醇沉淀：将超滤后的溶液加入0.5-1.0M的氯化钠，待完全溶解后加入乙醇，沉淀至终点酒精度数为50％～65％，充分搅拌，静置沉淀，取出沉淀物透明质酸钠；

(6)洗涤脱水干燥：将透明质酸钠沉淀物用乙醇洗涤、脱水后真空干燥，即得透明质酸钠成品。

上述步骤(3)为：将已经脱水的透明质酸搅拌溶解成0.1％-0.2％浓度，加入0.1％-2％活性炭搅拌2～5h，加入0.1％-2％的硅藻土，搅匀，过滤得滤液。

本发明工艺也可以省去上述步骤(1)、(2)和(3)，直接把透明质酸发酵液加热至65-75℃过滤得滤液，其他操作同上述步骤。

上述去除杂质步骤也可以直接用氯化十六烷基吡啶(CPC)络合沉淀去除金属离子和小分子的有色物质，而不必用超滤步骤。

本发明工艺采用活性炭目的是去除热源、核酸、有色物质；使用超滤或者氯化十六烷基吡啶(CPC)络合沉淀目的是彻底去除蛋白、金属离子、热源及核酸和小分子有色物质；使用硅藻土目的助滤。

本发明的有益效果：本发明从发酵液中制备医药级透明质酸钠的操作工序，大大简化了生产工艺流程，不仅可以在实验室中方便实施，而且极易在工业生产中运用；采用对发酵液乙醇沉淀，大大减少了乙醇的用量；使用适用于工业化规模的超滤技术可有效去除小分子的金属离子和有色物质，步骤简单，成本较低，尤其是超滤技术适合大规模的工业化生产。

具体实施方式

实施例1：

发酵得到的透明质酸发酵液中透明质酸含量5～9g/L，取上述发酵液2L，缓慢加入4L95％乙醇，并搅拌，静置沉淀2～3h；取出沉淀物透明质酸，加入乙醇充分脱水，然后将沉淀溶成0.1％浓度，待沉淀完全溶解后加入1％的硅藻土搅拌均匀，用预铺有硅藻土的板框压滤至澄清，按照下列条件：0.2MPa、截留分子量为50,000的螺旋卷式超滤膜进行超滤，去除金属离子和小分子的有色物质。将超滤后的浓缩液加入0.8M氯化钠，再用乙醇沉淀至终点为52％，取出沉淀物透明质酸钠。然后用80％乙醇洗涤两次，再用无水乙醇脱水两次后烘干即得透明质酸钠。

实施例2

实施例1中待沉淀完全溶解后，加入1％活性炭搅拌3h，其它操作同实施例1。

实施例3

对发酵液加热至70℃过滤得清液，其它操作如超滤、第二次乙醇沉淀、洗涤脱水同实施例一。

实施例4

用氯化十六烷基吡啶(CPC)络合沉淀去除金属离子和热源而不使用超滤，其它操作同实施例一。

对比实施例5

采用乙醇沉淀代替超滤步骤，其它操作同实施例一。

实验例检验方法及结果：

1、透明质酸的产率：通过改进的咔唑法测定透明质酸的产量，并对初始数量和最终数量进行比较。

2、发热物质的测量：将透明质酸及其盐溶于含有等于或小于0.001lu/ml发热物质的水中使其密度变为1.5g/L，然后使用从Charles Ri Ver End0s afe购得的LAL(鲎试弃0，Limu 1us Amebocvt eLysate)按照该产品所附手册进行分析。分析值以每毫克透明质酸中存在的内毒素单位(lu)表示。

3、纯度试验：通过咔唑法(Ana 1.Biochem.，4，330(1962))进行纯度试验。

4、蛋白质含量：通过劳拉法(LOwry method)测量蛋白质的含量。

5、核酸含量：将透明质酸及其盐溶于盐水溶液中使其浓度为1％，然后在260nm测量其吸光度。

下表是利用本发明工艺得出的产品与对比实施例得出产品的检验结果

测量项目	实施例	实施例二	实施例三	实施例四	对比实施例五
						产量(％)	99.8	99.6	99.9	99.5	99.6
纯度(％)	101.2	101.5	97.3	102.2	95.6
						发热物质(EU/mg)	小于0.005	小于0.005	小于0.05	小于0.005	0.1
蛋白质(％)	小于0.1	小于0.1	小于0.2	小于0.1	0.4
						核酸	0.22	0.16	0.27	0.10	0.44
分子量(百万Da)	2.4	2.4	2.4	2.1	1.9
						铁离子(ppm)	小于80	小于80	小于80	小于80	小于80

从上表中可以看出，由实施例1-4纯化的透明质酸及其盐纯度高达99.5％，而对比实施例5纯化的透明质酸纯度仅为95.6％，此外，实施例1、2、4的透明质酸及其盐中发热物质、蛋白质和核酸的含量比对比实施例低很多。

Claims (5)

1、一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法，其特征在于将透明质酸发酵液经处理通过过滤，去除杂质得清液，向清液中加入氯化钠，经乙醇沉淀，脱水即得。

2、根据权利要求1所述的制备透明质酸钠的方法，其特征在于其具体步骤为：(1)乙醇沉淀：向透明质酸发酵液中加入乙醇，沉淀至终点酒精度数为50％～65％，充分搅拌，静置，得沉淀物透明质酸；

(2)彻底脱水：取出沉淀物透明质酸，用乙醇将沉淀彻底脱水；

(3)沉淀溶解：将已经脱水的透明质酸搅拌溶解成0.1％-0.2％浓度，加入0.1％-2％的硅藻土，搅匀，过滤得滤液；

(4)去除杂质：在0.5MPa以下、用截留分子量为30,000～50,000的超滤膜对滤液进行超滤，去除金属离子和小分子的有色物质；

(5)乙醇沉淀：将超滤后的溶液加入0.5-1.0M的氯化钠，待完全溶解后加入乙醇，沉淀至终点酒精度数为50％～65％，充分搅拌，静置沉淀，取出沉淀物透明质酸钠；

(6)洗涤脱水干燥：将透明质酸钠沉淀物用乙醇洗涤、脱水后真空干燥，即得透明质酸钠成品。

3、根据权利要求2所述的制备透明质酸钠的方法，其特征在于步骤(3)为沉淀溶解：将已经脱水的透明质酸搅拌溶解成0.1％-0.2％浓度，加入0.1％-2％活性炭搅拌2～5h，加入0.1％-2％的硅藻土，搅匀，过滤得滤液。

4、根据权利要求1所述的制备透明质酸钠的方法，其特征在于其具体步骤为：(1)将透明质酸发酵液加热至65-75℃过滤得滤液；

(2)去除杂质：在0.5MPa以下、用截留分子量为30,000～50,000的超滤膜对滤液进行超滤，去除金属离子和小分子的有色物质；

(3)乙醇沉淀：将超滤后的溶液加入0.5-1.0M的氯化钠，待完全溶解后加入乙醇，沉淀至终点酒精度数为50％～65％，充分搅拌，静置沉淀，取出沉淀物透明质酸钠；

(4)洗涤脱水干燥：将透明质酸钠沉淀物用乙醇洗涤、脱水后真空干燥，即得透明质酸钠成品。

5、根据权利要求2或者4所述的制备透明质酸钠的方法，其特征在于去除杂质步骤为：用氯化十六烷基吡啶(CPC)络合沉淀去除金属离子和小分子的有色物质。