CN102020724B - 从含有透明质酸的发酵液中提取透明质酸钠的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从含有透明质酸的发酵液中提取透明质酸钠的方法，其是将含有透明质酸的发酵液稀释后脱色除菌体，过滤后，向滤液中加入CTAB，离心分离后，向沉淀中加入氯化钠溶液进行解离，解离液过阴离子交换柱DEAE-52层析柱后，过柱液用乙醇沉淀，离心干燥后得到粉末状透明质酸钠固体。采用该方法提取透明质酸钠的优点在于：提取收率高，产品纯度高，蛋白含量极低，工艺简单，操作简便。

Description

从含有透明质酸的发酵液中提取透明质酸钠的方法

技术领域

本发明涉及生物化工领域，具体地说，涉及一种从含有透明质酸的发酵液中提取透明质酸钠的方法。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，简称HA)是一类酸性黏多糖类物质，由葡糖醛酸-N-乙酰氨基葡糖为双糖单位组成的直链高分子多糖，双糖单位数为300-1100对，分子量范围10⁵-10⁷Da。

HA溶于水，不溶于醇、酮、乙醚等有机溶剂。由于其溶液具有超强的持水性、粘弹性和生物易吸收性，被广泛用于眼科手术、腹腔手术中预防粘连、关节炎以及化妆品等领域。透明质酸通常以其钠盐形式存在。国内外对HA的性质、生物活性、生产工艺、临床应用等方面都进行了广泛深入的研究，目前主要应用于医药和化妆品方面，是当今文献中公认的最佳保湿产品。

目前大都采用发酵法来生产HA，早在1983年日本资生堂采用链球菌发酵生产透明质酸。随后发酵法生产透明质酸的研究越来越广泛，如日本专利No.58-566922、美国专利No.60-500997、韩国专利No.10-250573等。由于发酵液中含有菌体、蛋白质以及核酸等物质，从发酵液中提取HA的方法主要有以下几种：A.大量稀释膜滤法，由于发酵液中菌体等杂质较多，极易造成膜孔堵塞，且大量稀释易形成操作体积过大；B.高速离心法，除去菌体时对设备的要求很高；C.氯仿法，菌体沉淀中夹带较多的HA，HA的回收率低，且氯仿对环境污染；D.乙醇沉淀法，是一种较为常用的方法，但由于该法操作时所用设备及车间均必须防爆，这势必增加了操作的危险性和生产成本。

发明内容

本发明旨在克服现有技术中存在的制得的透明质酸钠产品形态较硬，不易溶解，蛋白含量高且含有其他粗多糖杂质，分子量较低等不足，提供一种低成本、快速高效制备高纯度透明质酸钠的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种从含有透明质酸的发酵液中提取透明质酸钠的方法，其是将含有透明质酸的发酵液稀释后脱色除菌体，过滤后，向滤液中加入CTAB，离心分离后，向沉淀中加入氯化钠溶液进行解离，解离液过阴离子交换柱DEAE-52层析柱后，过柱液用乙醇沉淀，离心干燥后得到粉末状透明质酸钠固体。

具体地，本发明采用以下的技术方案实现。依据本发明提供的一种从含有透明质酸的发酵液中提取透明质酸钠的方法，其包括步骤：

1)将含有透明质酸的发酵液加水稀释，向稀释液中加入硅藻土和活性炭，搅拌后过滤，收集滤液；

2)向滤液中加入10％的CTAB，搅拌后离心分离，用水洗涤固体沉淀；

3)向步骤2)所得沉淀中加入0.1～3M的氯化钠溶液，搅拌至固体沉淀完全溶解；

4)将步骤3)的溶液以1～3BV/h过层析柱后，收集过柱液，向所得溶液中缓慢流加1～3倍体积的95％乙醇，离心后干燥得到粉末状沉淀。

更具体地，本发明采用以下的技术方案实现。依据本发明提供的一种从含有透明质酸的发酵液中提取透明质酸钠的方法，其包括步骤：

1)将含有透明质酸的发酵液加水稀释至发酵液体积的1～10倍，向稀释液中加入发酵液体积0.5～3％的硅藻土和0.2～2％的活性炭，30～60℃保温搅拌后过滤，收集滤液；

2)向滤液中加入10％的CTAB，搅拌后离心分离，用水洗涤固体沉淀；

其中，10％的CTAB溶液质量与透明质酸发酵液的质量比为1～3∶1；

3)向步骤2)所得沉淀中加入1～3倍发酵液体积的0.1～3M氯化钠溶液，搅拌至固体沉淀完全溶解；

4)将步骤3)的溶液以1～3BV/h过层析柱后，收集过柱液，向所得溶液中缓慢流加1～3倍体积的95％乙醇，离心后收集沉淀；

5)将步骤4)的上清液抽滤，然后流加0.3～2倍体积的无水乙醇，离心后收集沉淀；

6)合并步骤4)和步骤5)所得沉淀，真空干燥5～20h。

前述的方法，所述层析柱为阴离子交换柱DEAE-52。

本发明采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)络合法及过阴离子交换柱DEAE-52法提取发酵液中的透明质酸钠，由于HA的聚阴离子与表面活性物质十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)形成络合物，这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，高子强度时溶解，采用过柱法除去蛋白质，从而得到一种快速高效的提取透明质酸钠的新方法，符合大量生产要求，且能低成本制得高纯度的透明质酸钠，所得葡糖醛酸纯度在44％以上，HA得率在90％以上，分子量损失率低于13％，蛋白含量低于0.05％。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1)取500ml发酵液，含HA 2g，分子量为2.38Mda。发酵液用去离子水稀释2倍。

2)在溶解液中加入3g/L的硅藻土和2g/L的活性炭，搅拌两小时后，过滤，得到滤液。

3)向滤液中加入10％CTAB，加入量为HA∶CTAB＝1∶2.0(g/g)，搅拌络合后，过滤得到络合物。

4)加入0.6M的氯化钠溶液至原发酵液体积，200rpm下搅拌解离24h。

5)将解离液以1.5BV/h过阴离子交换柱DEAE-52层析柱后，收集过柱液。

6)向滤液中流加95％乙醇1000ml，加入量为HA溶液∶乙醇＝1∶2(v/v)，同时以150rpm搅拌，流加15～20％(质量百分比)氯化钠溶液，直至有白色小絮状物出现，离心干燥后得到粉末状透明质酸钠固体。

所得HA干粉1.2g，葡糖醛酸纯度约45.5％，HA得率为92.5％，分子量为2.07MDa，分子量损失率为10％，蛋白/HA(g/g)为0.05％。

实施例2

1)取500ml发酵液，含HA2g，分子量为2.38Mda，发酵液用去离子水稀释2.5倍。

2)在溶解液中加入3g/L的硅藻土和2g/L的活性炭，搅拌两小时后，过滤，得到滤液。

3)向滤液中加入10％CTAB，加入量为HA∶CTAB＝1∶2.5(g/g)，搅拌络合后，过滤得到络合物。

4)加入0.8M的氯化钠溶液至原发酵液体积，200rpm下搅拌解离24h。

5)将解离液以2.0BV/h过层析柱后，收集过柱液。

6)向滤液中流加95％乙醇1500ml，加量为HA溶液∶乙醇＝1∶3(v/v)，同时以150rpm搅拌，流加15～20％(质量百分比)氯化钠溶液，直至有白色小絮状物出现，离心干燥后得到粉末状透明质酸钠固体。

所得HA干粉1.1g，葡糖醛酸纯度约46.7％，HA得率为90.3％，分子量为2.31MDa，分子量损失率为12％，蛋白/HA(g/g)为0.04％。

实施例3

1)取500ml发酵液，含HA2g，分子量为2.38Mda，发酵液用去离子水稀释3倍。

2)在溶解液中加入3g/L的硅藻土和2g/L的活性炭，搅拌两小时后，过滤，得到滤液。

3)向滤液中加入10％CTAB，加入量为HA∶CTAB＝1∶3.0(g/g)，搅拌络合后，过滤得到络合物。

4)加入0.8M的氯化钠溶液至原发酵液体积，200rpm下搅拌解离24h。

5)将解离液以2.5BV/h过层析柱后，收集过柱液。

6)向滤液中流加95％乙醇1500ml，加量为HA溶液∶乙醇＝1∶3(v/v)，同时以150rpm搅拌，流加15～20％(质量百分比)氯化钠溶液，直至有白色小絮状物出现，离心干燥后得到粉末状透明质酸钠固体。

所得HA干粉1.23g，葡糖醛酸纯度约46.1％，HA得率为91.8％，分子量为2.13MDa，分子量损失率为11％，蛋白/HA(g/g)为0.05％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种从含有透明质酸的发酵液中提取透明质酸钠的方法，其特征在于，其是将含有透明质酸的发酵液稀释后脱色除菌体，过滤后，向滤液中加入十六烷基三甲基溴化铵，离心分离后，向沉淀中加入氯化钠溶液进行解离，解离液用乙醇沉淀，离心干燥后得到粉末状透明质酸钠固体；

具体步骤如下：

1)将含有透明质酸的发酵液加水稀释至发酵液体积的1～10倍，向稀释液中加入发酵液体积0.5～3％的硅藻土和0.2～2％的活性炭，30～60℃保温搅拌后过滤，收集滤液；

2)向滤液中加入10％的十六烷基三甲基溴化铵，搅拌后离心分离，用水洗涤固体沉淀；

其中，10％的十六烷基三甲基溴化铵溶液质量与透明质酸发酵液的质量比为1～3∶1；

3)向步骤2)所得沉淀中加入1～3倍发酵液体积的0.1～3M氯化钠溶液，搅拌至固体沉淀完全溶解；

4)将步骤3)的溶液以1～3BV/h过层析柱后，收集过柱液，向所得溶液中缓慢流加1～3倍体积的95％乙醇，离心后收集沉淀；

5)将步骤4)的上清液抽滤，然后流加0.3～2倍体积的无水乙醇，离心后收集沉淀；

6)合并步骤4)和步骤5)所得沉淀，真空干燥5～20h；

其中，所述层析柱为阴离子交换柱DEAE-52。