CN109535217B - 一种奥贝胆酸的精制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种奥贝胆酸的精制方法，包括将奥贝胆酸粗品溶解，加入环糊精混合一定时间后分离环糊精，精制得到奥贝胆酸。本发明方法利用成本低廉的环糊精对奥贝胆酸进行精制，能够有效地除去奥贝胆酸成品异构体杂质等杂质。相比于传统的奥贝胆酸精制方法，本发明的方法反应条件温和，步骤简单，得到的合格成品纯度高，简化的步骤的同时提高了产品收率。

Description

一种奥贝胆酸的精制方法

技术领域

本发明涉及奥贝胆酸的精制方法，特别涉及使用环糊精精制奥贝胆酸的方法。

背景技术

奥贝胆酸（Obeticholic Acid，CAS：459789-99-2），商品名Ocalive，化学名3α,α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸，具有特定的立体结构，其结构式如下式所示：

奥贝胆酸是美国英特赛普特（Intercept）公司研制的一种治疗原发性胆汁性肝硬化（PBC）的新型药物，先后于2016年5月27日和2016年12月12日获美国食品药品管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准上市。原发性胆汁性肝硬化（PBC），是一种慢性，进展性的自身免疫性疾病，90%发生于女性（多为40-60岁女性）。最终的结论是肝硬化及肝功能衰竭，这时就要进行肝脏移植，是女性进行肝脏移植的第二大因素。目前治疗此类适应症的首选用药是熊去氧胆酸（UDCA），然而有40%的PBC患者对UCDA反应不佳，甚至10%患者将死亡或者需要肝脏移植。而奥贝胆酸（曾被FDA授予快速通道和孤儿药）则用于治疗对于UDCA反应不足或不耐性的成人患者，是应对此类适应症的最后一道屏障。

目前制备奥贝胆酸及其杂质的国内外文献路线主要有以下几种：

US71390B2/CN101203526B/CN104781272A公开了奥贝胆酸的合成步骤，如式1所示：

该专利中以7-酮鹅去氧胆酸（1）为起始物，经过酯化、两步烯醇硅醚化、羟醛缩合、水解、催 化氢化，硼氢化钠还原共7步得到奥贝胆酸，总收率24%。

文献 WO2013192097、US20130345188A1 报道了奥贝胆酸的合成方法，工艺路线如式2所示：

该专 利中以A为起始物，经过经钯碳还原得到化合物 B，再经过四氢硼钠还原制备得到C。

根据结构可知，该化合物含有多个手性中心，尤其是6位乙基，7位羟基的手性均在合成过程中引入。在化合物C制备过程中存在构型转化的步骤，在四氢硼钠进行还原的过程中，引入7位手性羟基。尽管上述反应立体选择性良好，但是由于反应过程复杂，构型转化不完全等因素，导致奥贝胆酸中潜在奥贝胆酸异构体。尤其是在化合物B的制备过程中，根据文献提高的方案，即采用氢氧化钠水溶液为溶剂，100℃反应，并进行转构型，研究发现，构型转化不完全，潜在的引入了手性杂质。

CN105294801A报道了奥贝胆酸杂质的生成原因，其原理如式3所示：

化合物1在 较低温下经催化加氢还原生成6β化合物2；再经过硼氢化钠还原得6β,7α化合物 5；化合物2 在高温的碱溶液生成6α化合物3，经过金属钠还原得到6α,7β化合物3。

从以上奥贝胆酸合成路线可以看出，奥贝胆酸杂质谱中含有多个异构体杂质，其理化性质与成品非常相近，除去这些杂质较困难。经详尽的文献检索，我们发现有大多文献是对与奥贝胆酸合成路线的论述，而关于奥贝胆酸精制方法的报道较少。CN104781272A中提到以乙酸丁酯重结晶及“碱溶酸析”的处理方法，经乙酸丁酯重结晶的奥贝胆酸成品纯度可达到不低于98 .5％，此方法存在所用溶剂乙酸丁酯沸点较高后处理困难的缺点，且传统的“碱溶酸析”精制方法对异构体杂质并无明显除杂效果。

环糊精(Cyclodextrin，简称CD)是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有6～12个D-吡喃葡萄糖单元。由于环糊精的外缘亲水而内腔疏水，因而它能够像酶一样提供一环糊精个疏水的结合部位，作为主体包络各种适当的客体，如有机分子、无机离子以及气体分子等。其内腔疏水而外部亲水的特性使其可依据范德华力、疏水相互作用力、主客体分子间的匹配作用等与许多有机和无机分子形成包合物及分子组装体系，成为化学和化工研究者感兴趣的研究对象。这种选择性的包络作用即通常所说的分子识别，其结果是形成主客体包络物。α、β、γ-环糊精分别是6，7，8个D(+)-吡喃型葡萄糖组成的环状低聚物，其分子呈上宽下窄、两端开口、中空的筒状物，腔内部呈相对疏水性，而所有羟基则在分子外部。

环糊精可以与一些活性药物组分(API)形成包合络合物，由于天然环糊精在水中的溶解度很低，不能有效地提高难溶药物在水中的溶解度，许多β-CD与药物的包合络合物在水中的溶解度比β-CD本身的水溶度还低，正因为如此，限制了环糊精在药物上的应用。但是对环糊精分子洞(空腔)外表面的醇化基进行醚化、酯化、氧其溶解度较天然环糊精有显著提高，且仍然无毒，用它来包络药物，改善药性，效果更佳。未有研究表明环糊精可以用来精制奥贝胆酸。

开发出一种低成本、高效去除奥贝胆酸中杂质的方法，具有非常现实的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种低成本、高效去除奥贝胆酸中杂质的方法。

本发明所采取的技术方案是：

发明人在研究过程中意外发现，环糊精，如α-环糊精、β-环糊精、ϒ-环糊精、羟烷基修饰的α-环糊精，β-环糊精，ϒ-环糊精等可以很好地去除奥贝胆酸粗品中的杂质，特别是可以有效去除结构与奥贝胆酸极其结构的杂质。其操作简单，纯化效果佳。

一种奥贝胆酸的精制方法，包括如下步骤：

1)将奥贝胆酸粗品溶解于碱性溶液中，得奥贝胆酸溶液；

2)在奥贝胆酸溶液中加入环糊精，搅拌溶解，得到环糊精混合溶液；

3)调节环糊精混合溶液的pH值至中性或酸性，析出奥贝胆酸湿品；

4)将奥贝胆酸湿品过滤，洗涤、干燥得到奥贝胆酸精品。

作为上述精制方法的进一步改进，奥贝胆酸溶液经活性炭脱色后再加入环糊精。

作为上述精制方法的进一步改进，活性炭用量为奥贝胆酸的质量的1%～10%。

作为上述精制方法的进一步改进，环糊精的添加量为奥贝胆酸的摩尔量的0.05%～50%。进一步的，环糊精的添加量为奥贝胆酸的摩尔量的1%～20%、2～15%、5～12%。

作为上述精制方法的进一步改进，环糊精为α-环糊精、β-环糊精、ϒ-环糊精、羟烷基修饰的α-环糊精，β-环糊精，ϒ-环糊精中的至少一种。羟烷基修饰为环糊精6位羟基被羟烷氧基取代，羟烷氧基的结构通式为-O（CnH₂n）OH，n=1～6。进一步的，环糊精为羟丙基-β-环糊精和ϒ -环糊精的混合物。特别的，环糊精为羟丙基-β-环糊精：ϒ -环糊精=1：1（摩尔比）的混合物。

作为上述精制方法的进一步改进，碱性溶液中的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、C1-C6胺中的至少一种。

作为上述精制方法的进一步改进，碱性溶液中的溶剂为水或含水的混合溶剂。

作为上述精制方法的进一步改进，pH值为0～7；优选的，pH为 1～7； pH为3～7；pH为5～7。

一种奥贝胆酸的精制方法，包括以下步骤：

1）将20质量份奥贝胆酸粗品和2质量份氢氧化钠溶解于水中；

2）加入活性炭，充分搅拌脱色后过滤，收集滤液；

3）在滤液中入3.7质量份 羟丙基β-环糊精和3质量份 ϒ-环糊精充分搅拌；

4）在上述溶液中，滴加盐酸溶液，调整溶液pH值为酸性，使奥贝胆酸析出；

5）过滤，固体分别经正庚烷和水洗涤，干燥得奥贝胆酸精品。

本发明的有益效果是：

本发明方法利用成本低廉的环糊精对奥贝胆酸进行精制，能够出人意料地有效除去奥贝胆酸中成品异构体杂质等杂质。相比于传统的奥贝胆酸精制方法，本发明的方法反应条件温和，步骤简单，得到的合格成品纯度高，简化的步骤的同时提高了产品收率。

附图说明

图1是实施例1中奥贝胆酸精品的HPLC图。

具体实施方式

环糊精作为奥贝胆酸纯化剂中的应用，进一步的，环糊精为α-环糊精、β-环糊精、ϒ-环糊精、羟烷基修饰的α-环糊精，β-环糊精，ϒ-环糊精中的至少一种；更进一步的，环糊精为羟丙基-β-环糊精和ϒ -环糊精的混合物；再进一步的，环糊精为羟丙基-β-环糊精：ϒ-环糊精=1：1（摩尔比）的混合物。

一种奥贝胆酸的精制方法，包括如下步骤：

1)将奥贝胆酸粗品溶解于碱性溶液中，得奥贝胆酸溶液；

2)在奥贝胆酸溶液中加入环糊精，搅拌溶解，得到环糊精混合溶液；

3)调节环糊精混合溶液的pH值至中性或酸性，析出奥贝胆酸湿品；

4)将奥贝胆酸湿品过滤，洗涤、干燥得到奥贝胆酸精品。

作为上述精制方法的进一步改进，奥贝胆酸溶液经活性炭脱色后再加入环糊精。

作为上述精制方法的进一步改进，活性炭用量为奥贝胆酸的质量的1%～10%。

活性炭的作用在于脱色，其用量可以根据粗品的色度进行相应的调整，其对精制（纯化）结果并无显著影响。其具体的用量可以根据奥贝胆酸溶液的色度进行调整，一般而言，溶液的颜色越深，需要加入的活性炭就越多。

奥贝胆酸粗品中的杂质量较多时，则相应的需要提高环糊精的用量；反之，当奥贝胆酸粗品中的杂质量较少时，则可以适当减少环糊精的用量。作为上述精制方法的进一步改进，环糊精的添加量为奥贝胆酸的摩尔量的0.05%～50%。进一步的，环糊精的添加量为奥贝胆酸的摩尔量的1%～20%、2～15%、5～12%。环糊精的用量可以根据具体的纯化效果进行相应的调整。

作为上述精制方法的进一步改进，环糊精为α-环糊精、β-环糊精、ϒ-环糊精、羟烷基修饰的α-环糊精，β-环糊精，ϒ-环糊精中的至少一种。羟烷基修饰为环糊精6位羟基被羟烷氧基取代，羟烷氧基的结构通式为-O（CnH₂n）OH，n=1～6。精制结果表明，ϒ-环糊精具有更好的精制结果。加入环糊精混合的时间可以根据杂质的去除情况、环糊精的用量、粗品的纯度等进行相应的调整。环糊精的添加量可以根据粗品的杂质量来确定，或基于精制奥贝胆酸中杂质的量进行相应的调整。避免因添加量过少而导致杂质去除不完全；过量添加造成环糊精的浪费和/或导致奥贝胆酸的收率下降。

作为上述精制方法的进一步改进，碱性溶液中的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、C1-C6胺中的至少一种。碱的作用于使奥贝胆酸形成水溶性的羧酸盐，方便其纯化。实验数据显示碱的种类对纯化结果无显著影响。

作为上述精制方法的进一步改进，碱性溶液中的溶剂为水或含水的混合溶剂。这样可以方法地将奥贝胆酸溶清。

奥贝胆酸在酸性或中性条件下溶解度低，易于析出。为使其可以更好地析出，作为上述精制方法的进一步改进，pH值为0～7。出于生产成本考虑，pH优选 1～7，3～7、5～7。具体的pH可以根据奥贝胆酸的析出情况进行相应的调整。

为提高奥贝胆酸的溶解度，减少溶剂的用量，可以适当提高溶解时的温度，20～80℃都是可行的。具体的温度可以根据具体的情况进行相应调整。

下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。

实施例1：

1)将20g奥贝胆酸粗品（HPLC纯度97.8%）和2g氢氧化钠溶解于300ml水中，升温至80℃；

2)加入活性炭2g，保温搅拌1h，保温80℃过滤，收集滤液；

3)将滤液加热至40℃，加入6g ϒ-环糊精搅拌6h；

4)在上述溶液中，缓慢滴加盐酸溶液，调整溶液pH值到1；

5)过滤，固体分别经20ml正庚烷和10ml水洗涤，于40℃真空干燥12小时，得奥贝胆酸。

经检测，奥贝胆酸精品的HPLC纯度99.8%，收率97.3%，与精制前的相比，HPLC纯度提高了2.0%。图1为实施例1经过ϒ-环糊精纯化后的效果图，从图中可看出相对于传统的重结晶与柱层析方式，利用本工艺，可以得到单杂在0.15%以下，纯度在99.5%以上的奥贝胆酸。

实施例2：

1)将20g奥贝胆酸粗品（HPLC纯度97.8%）和2g氢氧化钠溶解于300ml水中，升温至60℃；

2)加入活性炭2g，保温搅拌1h，保温60℃过滤，收集滤液；

3)将滤液加热至55℃，加入5.25g β-环糊精搅拌4h；

4)在上述溶液中，缓慢滴加硫酸溶液，调整溶液pH值到6；

5)过滤，固体经20ml正庚烷和10ml水洗涤，于40℃真空干燥12小时，得奥贝胆酸。

经检测，奥贝胆酸精品的HPLC纯度99.5%，收率95.7%，与精制前的相比，HPLC纯度提高了1.7%。

实施例3：

1)将20g奥贝胆酸粗品（HPLC纯度97.8%）和2g氢氧化钠溶解于300ml水中，升温至70℃；

2)加入活性炭2g，保温搅拌1h，保温70℃过滤，收集滤液；

3)将滤液加热至60℃，加入6.76g α-环糊精搅拌5.5h；

4)在上述溶液中，缓慢滴加乙酸溶液，调整溶液pH值到7；

5)过滤，固体经20ml正庚烷和10ml水洗涤，于40℃真空干燥12小时，得奥贝胆酸。

经检测，奥贝胆酸精品的HPLC纯度99.4%，收率97.0%，与精制前的相比，HPLC纯度提高了1.6%。

实施例4：

1)将20g奥贝胆酸粗品（HPLC纯度97.8%）和2g氢氧化钠溶解于300ml水中，升温至65℃；

2)加入活性炭2g，保温搅拌1h，保温65℃过滤，收集滤液；

3)将滤液加热至45℃，加入7.4g 羟丙基β-环糊精搅拌6h；

4)在上述溶液中，缓慢滴加磷酸溶液，调整溶液pH值到3；

5)过滤，固体经20ml正庚烷和10ml水洗涤，于40℃真空干燥12小时，得奥贝胆酸。

经检测，奥贝胆酸精品的HPLC纯度99.7%，收率97.8%，与精制前的相比，HPLC纯度提高了1.9%。

实施例5：

1)将20g奥贝胆酸粗品（HPLC纯度97.8%）和2g氢氧化钠溶解于300ml水中，升温至60℃；

2)加入活性炭2g，保温搅拌1h，保温60℃过滤，收集滤液；

3)将滤液加热至40℃，加入3.7g 羟丙基β-环糊精和3g ϒ-环糊精，搅拌使其溶解；

4)在上述溶液中，缓慢滴加盐酸溶液，调整溶液pH值到6；

5)过滤，固体经20ml正庚烷和10ml水洗涤，于40℃真空干燥12小时，得奥贝胆酸。

经检测，奥贝胆酸精品的HPLC纯度99.9%，收率98.1%，与精制前的相比，HPLC纯度提高了2.1%。

实施例6：

1)将20g奥贝胆酸粗品（HPLC纯度97.8%）和2g氢氧化钠溶解于300ml水中，升温至60℃；

2)加入活性炭2g，保温搅拌1h，保温60℃过滤，收集滤液；

3)将滤液加热至40℃，加入5.1g 羟丙基β-环糊精和4.8g ϒ-环糊精，搅拌使其溶解；

4)在上述溶液中，缓慢滴加盐酸溶液，调整溶液pH值到6；

5)过滤，固体经20ml正庚烷和10ml水洗涤，于40℃真空干燥12小时，得奥贝胆酸。

经检测，奥贝胆酸精品的HPLC纯度99.9%，收率97.5%，与精制前的相比，HPLC纯度提高了2.1%。

实施例7：

1)将20g奥贝胆酸粗品（HPLC纯度97.8%）和2g氢氧化钠溶解于300ml水中，升温至80℃；

2)加入活性炭2g，保温搅拌1h，保温80℃过滤，收集滤液；

3)将滤液加热至40℃，加入8.2g ϒ-环糊精搅拌6h；

4)在上述溶液中，缓慢滴加盐酸溶液，调整溶液pH值到1；

5)过滤，固体分别经20ml正庚烷和10ml水洗涤，于40℃真空干燥12小时，得奥贝胆酸。

经检测，奥贝胆酸精品的HPLC纯度99.8%，收率96.8%，与精制前的相比，HPLC纯度提高了2.0%。

实施例8：

同实施例1，不同之处在于环糊精为等摩尔量的β-环糊精。

实施例9：

同实施例1，不同之处在于环糊精为等摩尔量的α-环糊精。

实施例10：

同实施例1，不同之处在于环糊精为等摩尔量的羟丙基β-环糊精。

上述实施例中，只要能将奥贝胆酸粗品溶清，不同的溶剂对精制结果没有根本性的影响；不使用活性炭对精制结果并无影响，但是所得的奥贝胆酸颜色呈微黄。

根据文献和专利所述路线及其收率，与本发明数据进行对比：

对比例1：CN104781272A公开的奥贝胆酸的制备方法。

不同奥贝胆酸制备方法的比较情况如表1所示：

分析数据可知：

1)通过对比实施例1、实施例8、实施例9和实施例10的数据可知，不同环糊精对于奥贝胆酸的精制均有效果，从数据对比可知，纯化效果：α-环糊精<β-环糊精< 羟丙基-β-环糊精<ϒ -环糊精；收率： β-环糊精<α-环糊精< ϒ -环糊精<羟丙基-β-环糊精；

2)由数据比较可知ϒ-环糊精具有更好地精制效果；并且意外发现通过将收率最优的羟丙基-β-环糊精与纯化效果最好的ϒ -环糊精（摩尔比1:1，实施例5）混合进行精制，精制后奥贝胆酸的杂质含量由精制前的2.2%降至0.1%，杂质的去除率高达95.45%，同时总收率亦高达98.1%，其产率与纯化效果均优于其他单一的环糊精。

3)通过比较实施例1，实施例5，实施例6，实施例7的数据可知，其他条件不变，随着环糊精用量的增加，纯度不变，但是产率降低。

可见，通过本方法进行奥贝胆酸的精制，不仅操作步骤简单，精制纯化条件温和，并且能够将单杂控制在0.15%以下，并且其纯度在99.5%以上，相对于传统的重结晶与柱层析方式，本工艺一次处理量大，成本低，污染小，操作简单，产率以及纯度高。

综上所述，使用本发明的工艺参数实施反应可以简化奥贝胆酸的精制难度，该精制过程反应条件温和，操作步骤简单，极大地降低了奥贝胆酸的纯化成本。

Claims (21)

1.环糊精作为奥贝胆酸纯化剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：环糊精为α-环糊精、β-环糊精、ϒ-环糊精、羟烷基修饰的α-环糊精，β-环糊精，ϒ-环糊精中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：环糊精为羟丙基-β-环糊精和ϒ -环糊精的混合物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：环糊精为羟丙基-β-环糊精：ϒ -环糊精摩尔比=1：1的混合物。

5.一种奥贝胆酸的精制方法，包括如下步骤：

1)将奥贝胆酸粗品溶解于碱性溶液中，得奥贝胆酸溶液；

2)在奥贝胆酸溶液中加入环糊精，搅拌溶解，得到环糊精混合溶液；

3)调节环糊精混合溶液的pH值至中性或酸性，析出奥贝胆酸湿品；

4)将奥贝胆酸湿品过滤，洗涤、干燥得到奥贝胆酸精品。

6.根据权利要求5所述的精制方法，其特征在于：碱性溶液中的溶剂为水或含水的混合溶剂。

7.根据权利要求5或6所述的精制方法，其特征在于：环糊精的添加量为奥贝胆酸的摩尔量的0.05%～50%。

8.根据权利要求7所述的精制方法，其特征在于：环糊精的添加量为奥贝胆酸的摩尔量的1%～20%。

9.根据权利要求8所述的精制方法，其特征在于：环糊精的添加量为奥贝胆酸的摩尔量的2～15%。

10.根据权利要求8所述的精制方法，其特征在于：环糊精的添加量为奥贝胆酸的摩尔量的5～12%。

11.根据权利要求5或6所述的精制方法，其特征在于：环糊精为α-环糊精、β-环糊精、ϒ-环糊精、羟烷基修饰的α-环糊精，β-环糊精，ϒ-环糊精中的至少一种。

12.根据权利要求5或6所述的精制方法，其特征在于：环糊精为羟丙基-β-环糊精和ϒ-环糊精的混合物。

13.根据权利要求5或6所述的精制方法，其特征在于：环糊精为羟丙基-β-环糊精：ϒ -环糊精摩尔比=1：1的混合物。

14.根据权利要求11所述的精制方法，其特征在于：所述羟烷基修饰为环糊精6位羟基被羟烷氧基取代，所述羟烷氧基的结构通式为-O（CnH₂n）OH，n=1～6。

15.根据权利要求5或6所述的精制方法，其特征在于：pH值为0～7。

16.根据权利要求15所述的精制方法，其特征在于：pH为 1～7。

17.根据权利要求16所述的精制方法，其特征在于：pH为3～7。

18.根据权利要求17所述的精制方法，其特征在于：pH为5～7。

19.根据权利要求5或6所述的精制方法，其特征在于：奥贝胆酸溶液经活性炭脱色后再加入环糊精。

20.根据权利要求19所述的精制方法，其特征在于：活性炭用量为奥贝胆酸的质量的1%～10%。

21.一种奥贝胆酸的精制方法，包括以下步骤：

1）将20质量份奥贝胆酸粗品和2质量份氢氧化钠溶解于水中；

2）加入活性炭，充分搅拌脱色后过滤，收集滤液；

3）在滤液中入3.7质量份 羟丙基β-环糊精和3质量份 ϒ-环糊精充分搅拌；

4）在上述溶液中，滴加盐酸溶液，调整溶液pH值为酸性，使奥贝胆酸析出；

5）过滤，固体分别经正庚烷和水洗涤，干燥得奥贝胆酸精品。

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