CN111606958A - 一种高纯度n-乙酰神经氨酸固体的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高纯度N‑乙酰神经氨酸固体的制备工艺，属于N‑乙酰神经氨酸的纯化技术领域，解决传统冰醋酸结晶法制得的N‑乙酰神经氨酸产品纯度达不到99.5％以上、颜色发黄的技术问题。解决方案为：本发明通过工业色谱法制得N‑乙酰神经氨酸粗品溶液，再经过调pH值、浓缩、结晶、溶剂洗涤、干燥，制得N‑乙酰神经氨酸固体的纯度可达到99.5％以上，白度99以上，满足医药上对高纯度N‑乙酰神经氨酸的要求，采用本发明制得N‑乙酰神经氨酸可直接用作标准品使用。
Description
技术领域
本发明属于N-乙酰神经氨酸的纯化技术领域，具体涉及一种高纯度N-乙酰神经氨酸固体的制备工艺。
背景技术
N-乙酰神经氨酸又称唾液酸，是一系列含9个碳原子的羧基化单糖酰化衍生物的统称，其系统命名为5-氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。目前N-乙酰神经氨酸的制备方法主要有化学合成法、酶合成法、天然产物提取法和微生物发酵法等。
现有技术中，N-乙酰神经氨酸的纯化常用的方法是冰醋酸结晶法。该法制备N-乙酰神经氨酸收率低，而且杂质脱除不彻底。通过此法得到的精制品，据报道纯度达不到99.5％以上，且颜色发黄，白度在90左右，影响在医药上的推广应用。
工业色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离，实现产品的纯化。
发明内容
为了克服现有技术的不足，解决传统冰醋酸结晶法制得的N-乙酰神经氨酸产品纯度达不到99.5％以上、颜色发黄的技术问题，本发明提供一种高纯度N-乙酰神经氨酸固体的制备工艺。
本发明的设计构思为：采用工业色谱法结合改进的结晶工艺制备N-乙酰神经氨酸。
目前用色谱法只是对唾液酸进行检测，流动相通常使用乙腈、甲醇等物质，本发明通过对色谱法进行创造性改进，把流动相改为pH＝3的乙酸或者磷酸溶液，1.减少了废溶剂的排放，客服了现有色谱的缺点，适合工业化。2.避免了N-乙酰神经氨酸在后续生产过程中颜色加深的问题，利于得到高白度的N-乙酰神经氨酸。3.与唾液酸的结晶溶剂一致，避免了引入新的杂质。
如果只用色谱分离，而没有后续的连续结晶工艺，也无法得到高纯度高白度的N-乙酰神经氨酸的固体。故本发明采用工业色谱和改进结晶相结合的办法。
改进的结晶工艺主要有：浓缩前用食品级氢氧化钠对收集的馏分进行调pH值，调pH的原因是增强唾液酸的稳定性，避免在浓缩的过程中颜色加深导致后续酸洗的难度；第一次溶剂洗涤每加入500升的乙酸加入2升的纯化水，洗涤溶剂中加入纯化水是为了能洗去少量溶于纯化水中的杂质，进一步提高结晶的纯度，这都是制备高纯度高白度的必要技术特征。
本发明通过以下技术方案予以实现。
一种高纯度N-乙酰神经氨酸固体的制备工艺，包括以下步骤：
S1、将N-乙酰神经氨酸水解后进行脱色处理，然后对脱色处理后的N-乙酰神经氨酸进行工业色谱分离，采用色谱仪收集馏分4.5-6.5min的馏分，去除N-乙酰神经氨酸中的杂质分，制得N-乙酰神经氨酸粗品溶液；
所述工业色谱分离的条件如下：
色谱柱：TYS，10um，4.6*250mm，填料3g，
流动相：100％乙酸或者磷酸水溶液，流动相的pH值为3.0；
流速：0.6mL/min；
柱温：室温；
检测波长：210nm；
进样量：200uL/20mg；
S2、调pH值：使用食品级氢氧化钠调节N-乙酰神经氨酸粗品溶液的pH值为3-3.5，制得浓缩液；
S3、浓缩：浓缩温度为40-50℃；
S4、结晶：结晶溶剂为99％乙酸结晶，结晶溶剂的体积为浓缩液体积6-8倍；
S5、醇洗：对步骤S4制得的结晶抽滤，然后对结晶进行至少两次酸洗，酸洗的洗涤溶剂为乙酸溶液，首次酸洗时添加的洗涤溶剂的体积为浓缩液体积的3倍，并且每加入500L乙酸溶液加入2升纯化水，直至滤出液无色为止；洗涤溶剂酸洗好以后采用浓度为99％的乙醇溶液对结晶进行最后一次洗涤；
S6、真空干燥：将醇洗后的结晶放入烘箱中真空干燥，干燥温度为55～60℃，干燥8～12小时，制得N-乙酰神经氨酸固体。
进一步地，所述工业色谱分离的步骤为：(1)过滤除去水中不溶性杂质；(2)取流动相进行工业色谱分离。
进一步地，所述色谱仪收集馏分4.7-6.1min的馏分。
进一步地，所述步骤S6制得N-乙酰神经氨酸固体的纯度为99.5％，白度99以上。
与现有技术相比本发明的有益效果为：
本发明提供的一种高纯度N-乙酰神经氨酸固体的制备工艺，通过工业色谱法制得N-乙酰神经氨酸粗品溶液，再经过调pH值、浓缩、结晶、溶剂洗涤、干燥，制得N-乙酰神经氨酸固体的纯度可达到99.5％以上，白度99以上，满足医药上对高纯度N-乙酰神经氨酸的要求，采用本发明制得N-乙酰神经氨酸可直接用作标准品使用。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。另外，对于本领域技术人员而言，在不偏离本发明的实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
实施例一
一种高纯度N-乙酰神经氨酸固体的制备工艺，包括以下步骤：
S1、将N-乙酰神经氨酸水解后进行脱色处理，透光T340＞80％；然后对脱色处理后的N-乙酰神经氨酸进行工业色谱分离，采用色谱仪收集馏分4.5-6.5min的馏分，去除N-乙酰神经氨酸中的杂质分，制得N-乙酰神经氨酸粗品溶液；
所述工业色谱分离的条件如下：
色谱柱：TYS，10um，4.6*250mm，填料3g，
流动相：100％磷酸水溶液，流动相的pH值为3.0；
流速：0.6mL/min；
柱温：室温；
检测波长：210nm；
进样量：200uL/20mg；
S2、调pH值：使用食品级氢氧化钠调节N-乙酰神经氨酸粗品溶液的pH值为3-3.5，制得浓缩液；
S3、浓缩：浓缩温度为40-50℃，将浓缩液低温真空浓缩到浓度为350g/L；
S4、结晶：结晶溶剂为浓度为99％的乙酸溶液，结晶溶剂的体积为浓缩液体积6倍，低温结晶12小时；
S5、醇洗：对步骤S4制得的结晶抽滤，然后对结晶进行两次酸洗，首次酸洗时添加的洗涤溶剂为100L乙酸溶液，洗涤过程中加入0.4L的纯化水，搅拌0.5小时以上，第二次酸洗时添加首次洗涤后3倍体积的乙醇溶液再次进行洗涤，直至滤出液无色为止；洗涤溶剂酸洗好以后采用浓度为99％的乙醇溶液对结晶进行最后一次洗涤；
S6、真空干燥：将醇洗后的结晶放入烘箱中真空干燥，干燥温度为55℃，干燥12小时，制得N-乙酰神经氨酸固体。
实施例二
一种高纯度N-乙酰神经氨酸固体的制备工艺，包括以下步骤：
S1、将N-乙酰神经氨酸水解后进行脱色处理，透光T340＞80％；然后对脱色处理后的N-乙酰神经氨酸进行工业色谱分离，采用色谱仪收集馏分4.5-6.5min的馏分，去除N-乙酰神经氨酸中的杂质分，制得N-乙酰神经氨酸粗品溶液；
所述工业色谱分离的条件如下：
色谱柱：TYS，10um，4.6*250mm，填料3g，
流动相：100％磷酸水溶液，流动相的pH值为3.0；
流速：0.6mL/min；
柱温：室温；
检测波长：210nm；
进样量：200uL/20mg；
S2、调pH值：使用食品级氢氧化钠调节N-乙酰神经氨酸粗品溶液的pH值为3-3.5，制得浓缩液；
S3、浓缩：浓缩温度为40-50℃，将浓缩液低温真空浓缩到浓度为400g/L；
S4、结晶：结晶溶剂为浓度为99％的乙酸溶液，结晶溶剂的体积为浓缩液体积8倍，低温结晶12小时；
S5、醇洗：对步骤S4制得的结晶抽滤，然后对结晶进行三次酸洗，首次酸洗时添加的洗涤溶剂为100L乙酸溶液，洗涤过程中加入0.4L的纯化水，搅拌0.5小时以上，第二及以上次酸洗时添加前一次洗涤后3倍体积的乙醇溶液再次进行洗涤，直至滤出液无色为止；洗涤溶剂酸洗好以后采用浓度为99％的乙醇溶液对结晶进行最后一次洗涤；
S6、真空干燥：将醇洗后的结晶放入烘箱中真空干燥，干燥温度为60℃，干燥8小时，制得N-乙酰神经氨酸固体。
实施例三
一种高纯度N-乙酰神经氨酸固体的制备工艺，包括以下步骤：
S1、将N-乙酰神经氨酸水解后进行脱色处理，透光T340＞80％；然后对脱色处理后的N-乙酰神经氨酸进行工业色谱分离，采用色谱仪收集馏分4.5-6.5min的馏分，去除N-乙酰神经氨酸中的杂质分，制得N-乙酰神经氨酸粗品溶液；
所述工业色谱分离的条件如下：
色谱柱：TYS，10um，4.6*250mm，填料3g，
流动相：100％乙酸水溶液，流动相的pH值为3.0；
流速：0.6mL/min；
柱温：室温；
检测波长：210nm；
进样量：200uL/20mg；
S2、调pH值：使用食品级氢氧化钠调节N-乙酰神经氨酸粗品溶液的pH值为3-3.5，制得浓缩液；
S3、浓缩：浓缩温度为40-50℃，将浓缩液低温真空浓缩到浓度为350g/L；
S4、结晶：结晶溶剂为浓度为99％的乙酸溶液，结晶溶剂的体积为浓缩液体积8倍，低温结晶12小时；
S5、醇洗：对步骤S4制得的结晶抽滤，然后对结晶进行三次酸洗，首次酸洗时添加的洗涤溶剂为100L乙酸溶液，洗涤过程中加入0.4L的纯化水，搅拌0.5小时以上，第二及以上次酸洗时添加前一次洗涤后3倍体积的乙醇溶液再次进行洗涤，直至滤出液无色为止；洗涤溶剂酸洗好以后采用浓度为99％的乙醇溶液对结晶进行最后一次洗涤；
S6、真空干燥：将醇洗后的结晶放入烘箱中真空干燥，干燥温度为55℃，干燥12小时，制得N-乙酰神经氨酸固体。
对实施例一至实施例三制备的N-乙酰神经氨酸固体产品进行高效液相色谱检测，实施例一和实施例二都可以得到纯度99.5％以上的N-乙酰神经氨酸，实施例三制备的N-乙酰神经氨酸固体产品的纯度也可达到99％以上，但实施例1的收率为93.1％，实施例3的回收率是97.5％，由于实施例3收集的范围更宽，相应的N-乙酰神经氨酸的回收率比实施例1和实施例2更高。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (4)
1.一种高纯度N-乙酰神经氨酸固体的制备工艺，其特征在于包括以下步骤：
S1、将N-乙酰神经氨酸水解后进行脱色处理，然后对脱色处理后的N-乙酰神经氨酸进行工业色谱分离，采用色谱仪收集馏分4.5-6.5min的馏分，去除N-乙酰神经氨酸中的杂质分，制得N-乙酰神经氨酸粗品溶液；
所述工业色谱分离的条件如下：
色谱柱：TYS，10um，4.6*250mm，填料3g，
流动相：100％乙酸或者磷酸水溶液，流动相的pH值为3.0；
流速：0.6mL/min；
柱温：室温；
检测波长：210nm；
进样量：200uL/20mg；
S2、调pH值：使用食品级氢氧化钠调节N-乙酰神经氨酸粗品溶液的pH值为3-3.5，制得浓缩液；
S3、浓缩：浓缩温度为40-50℃；
S4、结晶：结晶溶剂为99％乙酸结晶，结晶溶剂的体积为浓缩液体积6-8倍；
S5、醇洗：对步骤S4制得的结晶抽滤，然后对结晶进行至少两次酸洗，酸洗的洗涤溶剂为乙酸溶液，首次酸洗时添加的洗涤溶剂的体积为浓缩液体积的3倍，并且每加入500L乙酸溶液加入2升纯化水，直至滤出液无色为止；洗涤溶剂酸洗好以后采用浓度为99％的乙醇溶液对结晶进行最后一次洗涤；
S6、真空干燥：将醇洗后的结晶放入烘箱中真空干燥，干燥温度为55～60℃，干燥8～12小时，制得N-乙酰神经氨酸固体。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度N-乙酰神经氨酸固体的制备工艺，其特征在于：所述工业色谱分离的步骤为：(1)过滤除去水中不溶性杂质；(2)取流动相进行工业色谱分离。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度N-乙酰神经氨酸固体的制备工艺，其特征在于：所述色谱仪收集馏分4.7-6.1min的馏分。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度N-乙酰神经氨酸固体的制备工艺，其特征在于：所述步骤S6制得N-乙酰神经氨酸固体的纯度为99.5％，白度99以上。
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