CN108059686B

CN108059686B - 一种以化橘红为基础制备多糖的方法

Info

Publication number: CN108059686B
Application number: CN201810113883.5A
Authority: CN
Inventors: 孔繁晟; 陈钊圣
Original assignee: Guangdong Meihua Agricultural Biotechnology Co ltd; Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Guangdong Meihua Agricultural Biotechnology Co ltd; Guangdong Pharmaceutical University
Priority date: 2018-02-05
Filing date: 2018-02-05
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2038-02-05
Also published as: CN108059686A

Abstract

本发明公开了一种以化橘红为基础，制备化橘红多糖的方法。具体方法如下：将化橘红干果在50～60℃下低温烘干,粉碎，过筛,得到化橘红粉末，经石油醚脱脂，80％乙醇弃除单糖和苷类后，将化橘红粉末置于热水中浸提，经过滤，浓缩，醇沉，脱蛋白后得到化橘红粗多糖，然后由季铵盐十六烷基三甲基溴化铵纯化得到酸性多糖，中性多糖，碱性多糖。本发明具有工艺简单，操作方便，纯度、收率高，可工业化的特点。此外，所得的化橘红多糖可广泛用抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂、医药生产原料等领域。

Description

一种以化橘红为基础制备多糖的方法

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及一种以化橘红为基础制备多糖的方法及其应用。

背景技术

多糖是除了蛋白质和核酸除外的一类重要的生物高分子化合物。现代药理研究表明多糖具有多种生理活性，包括抗氧化，抗病毒，抗肿瘤，降血糖血脂，保护心脑血管，增强免疫功能等。因大多数植物来源的多糖均无不良反应物质，不会对机体产生较大的副作用，因此，从植物中提取分离的多糖在生物医药界引起了极大的关注。目前已对百余种植物多糖进行了相关活性的研究报道，现已确证糖类作为信息分子在受精、发生、发育、分化、神经系统和免疫系统衡态的维持等方面的重要作用。炎症和自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常增殖和转换、病原体感染、植物和病原体相互作用、植物与根瘤菌共生等生理和病理过程都有糖类的介导。随着研究的不断深入，多糖作为食品，保健品，医药等领域的研究热点，具有良好的开发研究的前景。

化橘红(Exocarpium citri grandis)又称化州橘红，是芸香科植柑橘属(Citrus)植物化州柚(Citrus grandis Osbeek)或柚(C.grandis Osbeek)的未成熟或成熟的干燥外层果皮。目前，已知化橘红果皮的提取物具有抗氧化、抗过敏、降血压及抗肿瘤等生物活性。而现有的化橘红产品主要为三种，第一种是摘取前期细嫩小果制成成药。可以用配成药方，也可以泡饮。第二种是化橘红制剂，主要功效为化痰止咳。这类产品很多，如止咳橘红胶囊、止咳橘红口服液、橘红颗粒及橘红痰咳液等产品。第三种是化橘红工艺品，其生产的品种有瓶、罐、盒、烟斗等。但是目前对化橘红多糖的研究报道较为稀少，相关的专利报道也几乎没有。大多数天然活性多糖是无毒作用的天然绿色产品，随着研究的不断深入，需求亦会越来越大。

发明内容

本发明的目的是针对化橘红深加工利用的不足，提供一种以化橘红为原料制备化橘红粗多糖和精制多糖的方法，具有方法简便，可工业化，纯品收率、纯度高的特点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1.一种以化橘红为基础制备多糖的方法，其特征在于，包括如步骤：

步骤一、预处理：将化橘红干果，在低温烘干,粉碎，过40-50目筛，得到黄化橘红粉末，加入石油醚，浸泡过夜，过滤，弃除石油醚，粉末挥干溶剂，加入体积分数为80％乙醇于80℃下水浴浸泡1h，弃除单糖和苷类，过滤，得到滤液与滤渣，滤液可用于制备柚皮苷，滤渣挥干溶剂，备用；

步骤二、提取：以水为溶剂，将预处理后的化橘红粉末置于水浴中浸泡提取，过滤，得滤液；

步骤三、浓缩：用真空旋转蒸发浓缩滤液；

步骤四、醇沉：上述所得浓缩液中加入95％食用酒精，静置过夜，过滤，滤饼依次用无水乙醇，丙酮洗涤两遍，于60℃下真空干燥；

步骤五、脱蛋白：将步骤四干燥后所得固体用水溶解，加入三氯乙酸，搅拌，室温下静置30min，然后离心取上清液，用氢氧化钠溶液调节至中性，加入95％食用酒精，静置过夜，过滤，洗涤，于60℃下真空干燥，得到粗多糖；

步骤六、纯化：取粗多糖加水溶解，加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，置过夜，4000r/min离心15min，得到沉淀和上清液；

步骤七、酸性多糖的制备：将步骤六所得的沉淀加入NaCl溶液使其溶解，然后加入95％的食用酒精，静置过夜，过滤，沉淀用蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析，冻干，得化橘红酸性多糖；

步骤八、中性多糖的制备：将步骤六所得的上清液用硼酸(H₃BO₃)调成pH＝6.0～7.0，然后滴加NaOH溶液调节pH＝10～12，析出沉淀后，离心分离沉淀、上清液；上清液备用，沉淀用NaCl溶液溶解后，用乙酸调至中性，加入95％食用酒精沉淀，静置过夜，过滤，沉淀用蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析24h，冻干，得到化橘红中性多糖；

步骤九、碱性多糖的制备：取步骤八所得的上清液，用乙酸调pH＝3～4，加入95％食用酒精，静置过夜，过滤，沉淀用蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析24h，冻干，得到化橘红碱性多糖。

进一步地，所述步骤一的低温为50-60℃，粉碎用机械粉碎，加入石油醚与化橘红粉末的料液比为1:6g/mL；加入80％乙醇与化橘红粉末的比为1:6g/mL。

进一步地，所述步骤二的提取过程按温度为85～100℃，料液比为1:20～1:40g/mL，时间为2.5～3.5h的条件提取一次，过滤得滤液。

进一步地，所述步骤三的浓缩温度为60～70℃。

进一步地，所述步骤四中加入95％食用酒精的量为浓缩液的3～4倍体积。

进一步地，所述步骤五中具体为将步骤四所得样品溶解，得到浓度为10～20mg/mL的溶液，按体积比8:1～10:1的量加入质量分数为5～8％的三氯乙酸溶液，搅拌均匀后静置30min，离心取上清液，用2mol/L NaOH的将上清液调至中性。加入3～4倍体积的95％食用酒精，静置过夜，过滤得沉淀，60℃真空干燥，得到粗多糖。

进一步地，所述步骤六中将粗多糖加入溶解，得到浓度为15～30mg/mL的粗多糖溶液，按体积比3:1～1:1的量加入质量分数为1～3％的CTAB溶液，搅拌均匀后静置过夜，4000r/min离心15min，得沉淀和上清液。

进一步地，所述步骤七中往步骤六所得的沉淀中加入少量5～10％NaCl溶液使其溶解，加入3～4倍体积的95％食用酒精，静置过夜，过滤，沉淀用蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析24h，冷冻干燥，得化橘红酸性多糖。

进一步地，所述步骤八中将步骤六所得的上清液用1％H₃BO₃调pH至6.0～7.0，然后用2mol/L NaOH溶液调节pH至10～12，析出沉淀后，离心分离沉淀、上清液；沉淀用5～10％NaCl溶液溶解后，用2％乙酸调至中性，加入3～4倍体积的95％食用酒精，静置过夜，过滤，沉淀用蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析24h，冷冻干燥，得化橘红中性多糖。

进一步地，所述步骤九中将步骤八所得的上清液，用2％乙酸调pH至3～4，浓缩，加入3～4倍体积的95％食用酒精，静置过夜，过滤，沉淀用蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析24h，冷冻干燥，得化橘红碱性多糖。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

1、本发明以化橘红为原料制备多糖，以水为溶剂提取，三氯乙酸脱蛋白，季铵盐纯化，不仅绿色环保无环境污染，且制备条件温和，不易破坏物质生物活性；

2、本发明的步骤简便，有利于减少多糖的损失和降低劳动生产的成本，通过此方法可分别得到粗多糖，酸性多糖，中性多糖，碱性多糖；

3、本发明所得多糖纯度高，收率好，外观色泽好，工艺可工业化。

附图说明

图1为本发明的实施流程图。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。

实施例1

一种以化橘红为基础制备多糖的方法，其具体工艺步骤如下：

粗多糖的制备：取已干燥过筛的化橘红粉末100g，加入石油醚600mL，搅拌均匀后静置过夜，过滤，去除石油醚，粉末挥干溶剂后，加入600mL体积分数为80％的食用酒精，80℃热水浴提取1h，过滤，得滤液和滤渣，滤液用于制备柚皮苷，滤渣挥干溶剂用于制备化橘红多糖。往滤渣中加入4000mL水，沸水浴下提取3h，过滤，得滤液。将所得的滤液在温度为65-70℃，真空度为0.05～0.1MPa的条件下浓缩至原体积的1/10，得到化橘红提取浓缩液；然后往浓缩液中边搅拌边加入4倍体积的95％食用酒精，静置过夜，过滤沉淀。沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤两次，60℃真空干燥；然后用水将干燥得到的固体溶解到15mg/mL，加入体积比为10:1，质量分数为8％的三氯乙酸溶液，搅拌均匀后静置30min，离心取上清液，用2mol/L NaOH的将上清液调至中性，再加入4倍体积的95％食用酒精，静置过夜，过滤得沉淀，60℃真空干燥，得到粗多糖，收率为10.1％，纯度为66.5％。

酸性多糖的制备：取粗多糖10.0g，用水溶解得到浓度为20mg/mL的粗多糖溶液，按体积比2:1的量加入质量分数为1％CTAB溶液，搅拌均匀后静置过夜，4000r/min离心15min，得沉淀和上清液1。上清液1备用，沉淀加入10％NaCl溶液使其溶解，然后加入4倍体积的95％的食用酒精，静置过夜，过滤的沉淀，沉淀用少量蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析24h，冻干，得化橘红酸性多糖，收率为56.0％，纯度为55.6％。

中性多糖的制备：将上述所得的上清液1用1％硼酸(H₃BO₃)调成pH＝6.0，然后滴加2mol/L NaOH溶液调节pH＝11.0，析出沉淀后，4000r/min离心15min，得到沉淀、上清液2；上清液2备用，沉淀用少量的10％NaCl溶液溶解后，用2％乙酸调至中性，加入4倍体积的95％食用酒精沉淀，静置过夜，过滤，沉淀用少量蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析24h，冻干，得到化橘红中性多糖，收率为26.0％，纯度为72.5％。

碱性多糖的制备：将上述所的上清液2用2％乙酸调pH至3～4，浓缩，加入4倍体积的95％食用酒精，静置过夜，过滤，沉淀用少量蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析24h，冷冻干燥，得化橘红碱性多糖，收率为10.1％，纯度为90.6％。

实施例2

一种以化橘红为基础制备柚皮苷的方法，其具体工艺步骤如下：

粗多糖的制备：取已干燥过筛的化橘红粉末100.5g，加入石油醚600mL，搅拌均匀后静置过夜，过滤，去除石油醚，粉末挥干溶剂后，加入600mL体积分数为80％的食用酒精，80℃热水浴提取1h，过滤，得滤液和滤渣，滤液用于制备柚皮苷，滤渣挥干溶剂用于制备化橘红多糖。往滤渣中加入4000mL水，沸水浴下提取3h，过滤，得滤液。将所得的滤液在温度为65-70℃，真空度为0.05～0.1MPa的条件下浓缩至原体积的1/10，得到化橘红提取浓缩液；然后往浓缩液中边搅拌边加入4倍体积的95％食用酒精，静置过夜，过滤的沉淀。沉淀依次用无水乙醇，丙酮洗涤两次，60℃真空干燥；然后用水将干燥得到的固体溶解到15mg/mL，加入体积比为10:1，质量分数为8％的三氯乙酸溶液，搅拌均匀后静置30min，离心取上清液，用2mol/L NaOH的将上清液调至中性，再加入4倍体积的95％食用酒精，静置过夜，过滤得沉淀，60℃真空干燥，得到粗多糖，收率为10.5％，纯度为66.2％。

酸性多糖的制备：取粗多糖10.0g，用水溶解得到浓度为20mg/mL的粗多糖溶液，按体积比2:1的量加入质量分数为1％CTAB溶液，搅拌均匀后静置过夜，4000r/min离心15min，得沉淀和上清液1。上清液1备用，沉淀加入10％NaCl溶液使其溶解，然后加入4倍体积的95％的食用酒精，静置过夜，过滤的沉淀，沉淀用少量蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析24h，冻干，得化橘红酸性多糖，收率为56.3％，纯度为55.7％。

中性多糖的制备：将上述所得的上清液1用1％硼酸(H₃BO₃)调成pH＝6.0，然后滴加2mol/L NaOH溶液调节pH＝11.0，析出沉淀后，4000r/min离心15min，得到沉淀、上清液2；上清液2备用，沉淀用少量的10％NaCl溶液溶解后，用2％乙酸调至中性，加入4倍体积的95％食用酒精沉淀，静置过夜，过滤，沉淀用少量蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析24h，冻干，得到化橘红中性多糖，收率为26.2％，纯度为72.9％。

碱性多糖的制备：将上述所的上清液2用2％乙酸调pH至3～4，浓缩，加入4倍体积的95％食用酒精，静置过夜，过滤，沉淀用少量蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析24h，冷冻干燥，得化橘红碱性多糖，收率为10.7％，纯度为90.0％。

实施例3

粗多糖的制备：取已干燥过筛的化橘红粉末100.2g，加入石油醚600mL，搅拌均匀后静置过夜，过滤，去除石油醚，粉末挥干溶剂后，加入600mL体积分数为80％的食用酒精，80℃热水浴提取1h，过滤，得滤液和滤渣，滤液用于制备柚皮苷，滤渣挥干溶剂用于制备化橘红多糖。往滤渣中加入4000mL水，沸水浴下提取3h，过滤，得滤液。将所得的滤液在温度为65-70℃，真空度为0.05～0.1MPa的条件下浓缩至原体积的1/10，得到化橘红提取浓缩液；然后往浓缩液中边搅拌边加入4倍体积的95％食用酒精，静置过夜，过滤的沉淀。沉淀依次用无水乙醇，丙酮洗涤两次，60℃真空干燥；然后用水将干燥得到的固体溶解到15mg/mL，加入体积比为10:1，质量分数为8％的三氯乙酸溶液，搅拌均匀后静置30min，离心取上清液，用2mol/L NaOH的将上清液调至中性，再加入4倍体积的95％食用酒精，静置过夜，过滤得沉淀，60℃真空干燥，得到粗多糖，收率为10.2％，纯度为66.3％。

酸性多糖的制备：取粗多糖10.0g，用水溶解得到浓度为20mg/mL的粗多糖溶液，按体积比2:1的量加入质量分数为1％CTAB溶液，搅拌均匀后静置过夜，4000r/min离心15min，得沉淀和上清液1。上清液1备用，沉淀加入10％NaCl溶液使其溶解，然后加入4倍体积的95％的食用酒精，静置过夜，过滤的沉淀，沉淀用少量蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析24h，冻干，得化橘红酸性多糖，收率为56.4％，纯度为55.7％。

中性多糖的制备：将上述所得的上清液1用1％硼酸(H₃BO₃)调成pH＝6.0，然后滴加2mol/L NaOH溶液调节pH＝11.0，析出沉淀后，4000r/min离心15min，得到沉淀、上清液2；上清液2备用，沉淀用少量的10％NaCl溶液溶解后，用2％乙酸调至中性，加入4倍体积的95％食用酒精沉淀，静置过夜，过滤，沉淀用少量蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析24h，冻干，得到化橘红中性多糖，收率为26.3％，纯度为72.2％。

碱性多糖的制备：将上述所的上清液2用2％乙酸调pH至3～4，浓缩，加入4倍体积的95％食用酒精，静置过夜，过滤，沉淀用少量蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析24h，冷冻干燥，得化橘红碱性多糖，收率为10.1％，纯度为90.3％。

Claims

1.一种以化橘红为基础制备多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、预处理：将化橘红干果，低温烘干，粉碎，过40-50目筛，得到黄化橘红粉末，加入石油醚，浸泡过夜，过滤，弃除石油醚，粉末挥干溶剂，加入体积分数为80％乙醇于80℃下水浴浸泡1h，弃除单糖和苷类，过滤，得到滤液与滤渣，滤液可用于制备柚皮苷，滤渣挥干溶剂，备用；

所述步骤一的低温为50-60℃，粉碎为机械粉碎；所述石油醚与化橘红粉末的料液比为1:6g/mL；所述80％乙醇与化橘红粉末的料液比为1:6g/mL；

步骤三、浓缩：用真空旋转蒸发浓缩滤液；

步骤九、碱性多糖的制备：取步骤八所得的上清液，用乙酸调pH＝3～4，加入95％食用酒精，静置过夜，过滤，沉淀用蒸馏水溶解，然后置于透析袋中透析24h，冻干，得到化橘红碱性多糖；

所述步骤九中乙酸的质量分数为2％；所述95％食用酒精与溶解后溶液的体积比为3:1～4:1。

2.如权利要求1所述的以化橘红为基础制备多糖的方法，其特征在于：所述步骤二的提取温度为85～100℃，料液比为1:20～1:40g/mL，提取时间为2.5～3.5h。

3.如权利要求1所述的以化橘红为基础制备多糖的方法，其特征在于：所述步骤三的浓缩温度为60～70℃。

4.如权利要求1所述的以化橘红为基础制备多糖的方法，其特征在于：所述步骤四中加入95％食用酒精的量与浓缩液的体积比为3:1～4:1。

5.如权利要求1所述的以化橘红为基础制备多糖的方法，其特征在于：所述步骤五中样品溶解后得到的溶液浓度为10～20mg/mL；所述三氯乙酸的质量分数为5～8％；所述样品溶液与三氯乙酸溶液的体积比为8:1～10:1；所述氢氧化钠的浓度为2mol/L；所述95％食用酒精与溶解后溶液的体积比为3:1～4:1。

6.如权利要求1所述的以化橘红为基础制备多糖的方法，其特征在于：所述步骤六中粗多糖加入溶解后得到的溶液浓度为15～30mg/mL；所述CTAB溶液的质量分数为1～3％；粗多糖溶液与CTAB的体积比3:1～1:1。

7.如权利要求1所述的以化橘红为基础制备多糖的方法，其特征在于：所述步骤七中NaCl溶液的质量分数为5～10％；所述95％食用酒精与溶解后溶液的体积比为3:1～4:1。

8.如权利要求1所述的以化橘红为基础制备多糖的方法，其特征在于：所述步骤八中H₃BO₃的质量分数为1％，所述NaOH溶液的浓度为2mol/L，所述NaCl的质量分数为5～10％，乙酸的质量分数为2％，所述95％食用酒精与溶解后溶液的体积比为3:1～4:1。