CN108059686B - 一种以化橘红为基础制备多糖的方法 - Google Patents

一种以化橘红为基础制备多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以化橘红为基础,制备化橘红多糖的方法。具体方法如下:将化橘红干果在50~60℃下低温烘干,粉碎,过筛,得到化橘红粉末,经石油醚脱脂,80%乙醇弃除单糖和苷类后,将化橘红粉末置于热水中浸提,经过滤,浓缩,醇沉,脱蛋白后得到化橘红粗多糖,然后由季铵盐十六烷基三甲基溴化铵纯化得到酸性多糖,中性多糖,碱性多糖。本发明具有工艺简单,操作方便,纯度、收率高,可工业化的特点。此外,所得的化橘红多糖可广泛用抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂、医药生产原料等领域。

Description

一种以化橘红为基础制备多糖的方法
技术领域
本发明属于中药领域,具体涉及一种以化橘红为基础制备多糖的方法及其应用。
背景技术
多糖是除了蛋白质和核酸除外的一类重要的生物高分子化合物。现代药理研究表明多糖具有多种生理活性,包括抗氧化,抗病毒,抗肿瘤,降血糖血脂,保护心脑血管,增强免疫功能等。因大多数植物来源的多糖均无不良反应物质,不会对机体产生较大的副作用,因此,从植物中提取分离的多糖在生物医药界引起了极大的关注。目前已对百余种植物多糖进行了相关活性的研究报道,现已确证糖类作为信息分子在受精、发生、发育、分化、神经系统和免疫系统衡态的维持等方面的重要作用。炎症和自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常增殖和转换、病原体感染、植物和病原体相互作用、植物与根瘤菌共生等生理和病理过程都有糖类的介导。随着研究的不断深入,多糖作为食品,保健品,医药等领域的研究热点,具有良好的开发研究的前景。
化橘红(Exocarpium citri grandis)又称化州橘红,是芸香科植柑橘属(Citrus)植物化州柚(Citrus grandis Osbeek)或柚(C.grandis Osbeek)的未成熟或成熟的干燥外层果皮。目前,已知化橘红果皮的提取物具有抗氧化、抗过敏、降血压及抗肿瘤等生物活性。而现有的化橘红产品主要为三种,第一种是摘取前期细嫩小果制成成药。可以用配成药方,也可以泡饮。第二种是化橘红制剂,主要功效为化痰止咳。这类产品很多,如止咳橘红胶囊、止咳橘红口服液、橘红颗粒及橘红痰咳液等产品。第三种是化橘红工艺品,其生产的品种有瓶、罐、盒、烟斗等。但是目前对化橘红多糖的研究报道较为稀少,相关的专利报道也几乎没有。大多数天然活性多糖是无毒作用的天然绿色产品,随着研究的不断深入,需求亦会越来越大。
发明内容
本发明的目的是针对化橘红深加工利用的不足,提供一种以化橘红为原料制备化橘红粗多糖和精制多糖的方法,具有方法简便,可工业化,纯品收率、纯度高的特点。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
1.一种以化橘红为基础制备多糖的方法,其特征在于,包括如步骤:
步骤一、预处理:将化橘红干果,在低温烘干,粉碎,过40-50目筛,得到黄化橘红粉末,加入石油醚,浸泡过夜,过滤,弃除石油醚,粉末挥干溶剂,加入体积分数为80%乙醇于80℃下水浴浸泡1h,弃除单糖和苷类,过滤,得到滤液与滤渣,滤液可用于制备柚皮苷,滤渣挥干溶剂,备用;
步骤二、提取:以水为溶剂,将预处理后的化橘红粉末置于水浴中浸泡提取,过滤,得滤液;
步骤三、浓缩:用真空旋转蒸发浓缩滤液;
步骤四、醇沉:上述所得浓缩液中加入95%食用酒精,静置过夜,过滤,滤饼依次用无水乙醇,丙酮洗涤两遍,于60℃下真空干燥;
步骤五、脱蛋白:将步骤四干燥后所得固体用水溶解,加入三氯乙酸,搅拌,室温下静置30min,然后离心取上清液,用氢氧化钠溶液调节至中性,加入95%食用酒精,静置过夜,过滤,洗涤,于60℃下真空干燥,得到粗多糖;
步骤六、纯化:取粗多糖加水溶解,加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),置过夜,4000r/min离心15min,得到沉淀和上清液;
步骤七、酸性多糖的制备:将步骤六所得的沉淀加入NaCl溶液使其溶解,然后加入95%的食用酒精,静置过夜,过滤,沉淀用蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析,冻干,得化橘红酸性多糖;
步骤八、中性多糖的制备:将步骤六所得的上清液用硼酸(H3BO3)调成pH=6.0~7.0,然后滴加NaOH溶液调节pH=10~12,析出沉淀后,离心分离沉淀、上清液;上清液备用,沉淀用NaCl溶液溶解后,用乙酸调至中性,加入95%食用酒精沉淀,静置过夜,过滤,沉淀用蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冻干,得到化橘红中性多糖;
步骤九、碱性多糖的制备:取步骤八所得的上清液,用乙酸调pH=3~4,加入95%食用酒精,静置过夜,过滤,沉淀用蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冻干,得到化橘红碱性多糖。
进一步地,所述步骤一的低温为50-60℃,粉碎用机械粉碎,加入石油醚与化橘红粉末的料液比为1:6g/mL;加入80%乙醇与化橘红粉末的比为1:6g/mL。
进一步地,所述步骤二的提取过程按温度为85~100℃,料液比为1:20~1:40g/mL,时间为2.5~3.5h的条件提取一次,过滤得滤液。
进一步地,所述步骤三的浓缩温度为60~70℃。
进一步地,所述步骤四中加入95%食用酒精的量为浓缩液的3~4倍体积。
进一步地,所述步骤五中具体为将步骤四所得样品溶解,得到浓度为10~20mg/mL的溶液,按体积比8:1~10:1的量加入质量分数为5~8%的三氯乙酸溶液,搅拌均匀后静置30min,离心取上清液,用2mol/L NaOH的将上清液调至中性。加入3~4倍体积的95%食用酒精,静置过夜,过滤得沉淀,60℃真空干燥,得到粗多糖。
进一步地,所述步骤六中将粗多糖加入溶解,得到浓度为15~30mg/mL的粗多糖溶液,按体积比3:1~1:1的量加入质量分数为1~3%的CTAB溶液,搅拌均匀后静置过夜,4000r/min离心15min,得沉淀和上清液。
进一步地,所述步骤七中往步骤六所得的沉淀中加入少量5~10%NaCl溶液使其溶解,加入3~4倍体积的95%食用酒精,静置过夜,过滤,沉淀用蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冷冻干燥,得化橘红酸性多糖。
进一步地,所述步骤八中将步骤六所得的上清液用1%H3BO3调pH至6.0~7.0,然后用2mol/L NaOH溶液调节pH至10~12,析出沉淀后,离心分离沉淀、上清液;沉淀用5~10%NaCl溶液溶解后,用2%乙酸调至中性,加入3~4倍体积的95%食用酒精,静置过夜,过滤,沉淀用蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冷冻干燥,得化橘红中性多糖。
进一步地,所述步骤九中将步骤八所得的上清液,用2%乙酸调pH至3~4,浓缩,加入3~4倍体积的95%食用酒精,静置过夜,过滤,沉淀用蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冷冻干燥,得化橘红碱性多糖。
与现有技术相比,本发明的优势在于:
1、本发明以化橘红为原料制备多糖,以水为溶剂提取,三氯乙酸脱蛋白,季铵盐纯化,不仅绿色环保无环境污染,且制备条件温和,不易破坏物质生物活性;
2、本发明的步骤简便,有利于减少多糖的损失和降低劳动生产的成本,通过此方法可分别得到粗多糖,酸性多糖,中性多糖,碱性多糖;
3、本发明所得多糖纯度高,收率好,外观色泽好,工艺可工业化。
附图说明
图1为本发明的实施流程图。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式进一步说明本发明,但发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
实施例1
一种以化橘红为基础制备多糖的方法,其具体工艺步骤如下:
粗多糖的制备:取已干燥过筛的化橘红粉末100g,加入石油醚600mL,搅拌均匀后静置过夜,过滤,去除石油醚,粉末挥干溶剂后,加入600mL体积分数为80%的食用酒精,80℃热水浴提取1h,过滤,得滤液和滤渣,滤液用于制备柚皮苷,滤渣挥干溶剂用于制备化橘红多糖。往滤渣中加入4000mL水,沸水浴下提取3h,过滤,得滤液。将所得的滤液在温度为65-70℃,真空度为0.05~0.1MPa的条件下浓缩至原体积的1/10,得到化橘红提取浓缩液;然后往浓缩液中边搅拌边加入4倍体积的95%食用酒精,静置过夜,过滤沉淀。沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤两次,60℃真空干燥;然后用水将干燥得到的固体溶解到15mg/mL,加入体积比为10:1,质量分数为8%的三氯乙酸溶液,搅拌均匀后静置30min,离心取上清液,用2mol/L NaOH的将上清液调至中性,再加入4倍体积的95%食用酒精,静置过夜,过滤得沉淀,60℃真空干燥,得到粗多糖,收率为10.1%,纯度为66.5%。
酸性多糖的制备:取粗多糖10.0g,用水溶解得到浓度为20mg/mL的粗多糖溶液,按体积比2:1的量加入质量分数为1%CTAB溶液,搅拌均匀后静置过夜,4000r/min离心15min,得沉淀和上清液1。上清液1备用,沉淀加入10%NaCl溶液使其溶解,然后加入4倍体积的95%的食用酒精,静置过夜,过滤的沉淀,沉淀用少量蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冻干,得化橘红酸性多糖,收率为56.0%,纯度为55.6%。
中性多糖的制备:将上述所得的上清液1用1%硼酸(H3BO3)调成pH=6.0,然后滴加2mol/L NaOH溶液调节pH=11.0,析出沉淀后,4000r/min离心15min,得到沉淀、上清液2;上清液2备用,沉淀用少量的10%NaCl溶液溶解后,用2%乙酸调至中性,加入4倍体积的95%食用酒精沉淀,静置过夜,过滤,沉淀用少量蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冻干,得到化橘红中性多糖,收率为26.0%,纯度为72.5%。
碱性多糖的制备:将上述所的上清液2用2%乙酸调pH至3~4,浓缩,加入4倍体积的95%食用酒精,静置过夜,过滤,沉淀用少量蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冷冻干燥,得化橘红碱性多糖,收率为10.1%,纯度为90.6%。
实施例2
一种以化橘红为基础制备柚皮苷的方法,其具体工艺步骤如下:
粗多糖的制备:取已干燥过筛的化橘红粉末100.5g,加入石油醚600mL,搅拌均匀后静置过夜,过滤,去除石油醚,粉末挥干溶剂后,加入600mL体积分数为80%的食用酒精,80℃热水浴提取1h,过滤,得滤液和滤渣,滤液用于制备柚皮苷,滤渣挥干溶剂用于制备化橘红多糖。往滤渣中加入4000mL水,沸水浴下提取3h,过滤,得滤液。将所得的滤液在温度为65-70℃,真空度为0.05~0.1MPa的条件下浓缩至原体积的1/10,得到化橘红提取浓缩液;然后往浓缩液中边搅拌边加入4倍体积的95%食用酒精,静置过夜,过滤的沉淀。沉淀依次用无水乙醇,丙酮洗涤两次,60℃真空干燥;然后用水将干燥得到的固体溶解到15mg/mL,加入体积比为10:1,质量分数为8%的三氯乙酸溶液,搅拌均匀后静置30min,离心取上清液,用2mol/L NaOH的将上清液调至中性,再加入4倍体积的95%食用酒精,静置过夜,过滤得沉淀,60℃真空干燥,得到粗多糖,收率为10.5%,纯度为66.2%。
酸性多糖的制备:取粗多糖10.0g,用水溶解得到浓度为20mg/mL的粗多糖溶液,按体积比2:1的量加入质量分数为1%CTAB溶液,搅拌均匀后静置过夜,4000r/min离心15min,得沉淀和上清液1。上清液1备用,沉淀加入10%NaCl溶液使其溶解,然后加入4倍体积的95%的食用酒精,静置过夜,过滤的沉淀,沉淀用少量蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冻干,得化橘红酸性多糖,收率为56.3%,纯度为55.7%。
中性多糖的制备:将上述所得的上清液1用1%硼酸(H3BO3)调成pH=6.0,然后滴加2mol/L NaOH溶液调节pH=11.0,析出沉淀后,4000r/min离心15min,得到沉淀、上清液2;上清液2备用,沉淀用少量的10%NaCl溶液溶解后,用2%乙酸调至中性,加入4倍体积的95%食用酒精沉淀,静置过夜,过滤,沉淀用少量蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冻干,得到化橘红中性多糖,收率为26.2%,纯度为72.9%。
碱性多糖的制备:将上述所的上清液2用2%乙酸调pH至3~4,浓缩,加入4倍体积的95%食用酒精,静置过夜,过滤,沉淀用少量蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冷冻干燥,得化橘红碱性多糖,收率为10.7%,纯度为90.0%。
实施例3
一种以化橘红为基础制备柚皮苷的方法,其具体工艺步骤如下:
粗多糖的制备:取已干燥过筛的化橘红粉末100.2g,加入石油醚600mL,搅拌均匀后静置过夜,过滤,去除石油醚,粉末挥干溶剂后,加入600mL体积分数为80%的食用酒精,80℃热水浴提取1h,过滤,得滤液和滤渣,滤液用于制备柚皮苷,滤渣挥干溶剂用于制备化橘红多糖。往滤渣中加入4000mL水,沸水浴下提取3h,过滤,得滤液。将所得的滤液在温度为65-70℃,真空度为0.05~0.1MPa的条件下浓缩至原体积的1/10,得到化橘红提取浓缩液;然后往浓缩液中边搅拌边加入4倍体积的95%食用酒精,静置过夜,过滤的沉淀。沉淀依次用无水乙醇,丙酮洗涤两次,60℃真空干燥;然后用水将干燥得到的固体溶解到15mg/mL,加入体积比为10:1,质量分数为8%的三氯乙酸溶液,搅拌均匀后静置30min,离心取上清液,用2mol/L NaOH的将上清液调至中性,再加入4倍体积的95%食用酒精,静置过夜,过滤得沉淀,60℃真空干燥,得到粗多糖,收率为10.2%,纯度为66.3%。
酸性多糖的制备:取粗多糖10.0g,用水溶解得到浓度为20mg/mL的粗多糖溶液,按体积比2:1的量加入质量分数为1%CTAB溶液,搅拌均匀后静置过夜,4000r/min离心15min,得沉淀和上清液1。上清液1备用,沉淀加入10%NaCl溶液使其溶解,然后加入4倍体积的95%的食用酒精,静置过夜,过滤的沉淀,沉淀用少量蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冻干,得化橘红酸性多糖,收率为56.4%,纯度为55.7%。
中性多糖的制备:将上述所得的上清液1用1%硼酸(H3BO3)调成pH=6.0,然后滴加2mol/L NaOH溶液调节pH=11.0,析出沉淀后,4000r/min离心15min,得到沉淀、上清液2;上清液2备用,沉淀用少量的10%NaCl溶液溶解后,用2%乙酸调至中性,加入4倍体积的95%食用酒精沉淀,静置过夜,过滤,沉淀用少量蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冻干,得到化橘红中性多糖,收率为26.3%,纯度为72.2%。
碱性多糖的制备:将上述所的上清液2用2%乙酸调pH至3~4,浓缩,加入4倍体积的95%食用酒精,静置过夜,过滤,沉淀用少量蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冷冻干燥,得化橘红碱性多糖,收率为10.1%,纯度为90.3%。

Claims (8)

1.一种以化橘红为基础制备多糖的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一、预处理:将化橘红干果,低温烘干,粉碎,过40-50目筛,得到黄化橘红粉末,加入石油醚,浸泡过夜,过滤,弃除石油醚,粉末挥干溶剂,加入体积分数为80%乙醇于80℃下水浴浸泡1h,弃除单糖和苷类,过滤,得到滤液与滤渣,滤液可用于制备柚皮苷,滤渣挥干溶剂,备用;
所述步骤一的低温为50-60℃,粉碎为机械粉碎;所述石油醚与化橘红粉末的料液比为1:6g/mL;所述80%乙醇与化橘红粉末的料液比为1:6g/mL;
步骤二、提取:以水为溶剂,将预处理后的化橘红粉末置于水浴中浸泡提取,过滤,得滤液;
步骤三、浓缩:用真空旋转蒸发浓缩滤液;
步骤四、醇沉:上述所得浓缩液中加入95%食用酒精,静置过夜,过滤,滤饼依次用无水乙醇,丙酮洗涤两遍,于60℃下真空干燥;
步骤五、脱蛋白:将步骤四干燥后所得固体用水溶解,加入三氯乙酸,搅拌,室温下静置30min,然后离心取上清液,用氢氧化钠溶液调节至中性,加入95%食用酒精,静置过夜,过滤,洗涤,于60℃下真空干燥,得到粗多糖;
步骤六、纯化:取粗多糖加水溶解,加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),置过夜,4000r/min离心15min,得到沉淀和上清液;
步骤七、酸性多糖的制备:将步骤六所得的沉淀加入NaCl溶液使其溶解,然后加入95%的食用酒精,静置过夜,过滤,沉淀用蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析,冻干,得化橘红酸性多糖;
步骤八、中性多糖的制备:将步骤六所得的上清液用硼酸(H3BO3)调成pH=6.0~7.0,然后滴加NaOH溶液调节pH=10~12,析出沉淀后,离心分离沉淀、上清液;上清液备用,沉淀用NaCl溶液溶解后,用乙酸调至中性,加入95%食用酒精沉淀,静置过夜,过滤,沉淀用蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冻干,得到化橘红中性多糖;
步骤九、碱性多糖的制备:取步骤八所得的上清液,用乙酸调pH=3~4,加入95%食用酒精,静置过夜,过滤,沉淀用蒸馏水溶解,然后置于透析袋中透析24h,冻干,得到化橘红碱性多糖;
所述步骤九中乙酸的质量分数为2%;所述95%食用酒精与溶解后溶液的体积比为3:1~4:1。
2.如权利要求1所述的以化橘红为基础制备多糖的方法,其特征在于:所述步骤二的提取温度为85~100℃,料液比为1:20~1:40g/mL,提取时间为2.5~3.5h。
3.如权利要求1所述的以化橘红为基础制备多糖的方法,其特征在于:所述步骤三的浓缩温度为60~70℃。
4.如权利要求1所述的以化橘红为基础制备多糖的方法,其特征在于:所述步骤四中加入95%食用酒精的量与浓缩液的体积比为3:1~4:1。
5.如权利要求1所述的以化橘红为基础制备多糖的方法,其特征在于:所述步骤五中样品溶解后得到的溶液浓度为10~20mg/mL;所述三氯乙酸的质量分数为5~8%;所述样品溶液与三氯乙酸溶液的体积比为8:1~10:1;所述氢氧化钠的浓度为2mol/L;所述95%食用酒精与溶解后溶液的体积比为3:1~4:1。
6.如权利要求1所述的以化橘红为基础制备多糖的方法,其特征在于:所述步骤六中粗多糖加入溶解后得到的溶液浓度为15~30mg/mL;所述CTAB溶液的质量分数为1~3%;粗多糖溶液与CTAB的体积比3:1~1:1。
7.如权利要求1所述的以化橘红为基础制备多糖的方法,其特征在于:所述步骤七中NaCl溶液的质量分数为5~10%;所述95%食用酒精与溶解后溶液的体积比为3:1~4:1。
8.如权利要求1所述的以化橘红为基础制备多糖的方法,其特征在于:所述步骤八中H3BO3的质量分数为1%,所述NaOH溶液的浓度为2mol/L,所述NaCl的质量分数为5~10%,乙酸的质量分数为2%,所述95%食用酒精与溶解后溶液的体积比为3:1~4:1。
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