CN105001309A - 一种达巴万星的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高效分离纯化达巴万星的方法，包括以下步骤，将达巴万星粗提取物进行溶解、过滤；将上述过滤后的粗溶液上样到装有聚苯乙烯高分子聚合物微球的层析柱中进行层析；采用磷酸水溶液和有机溶剂作为流动相对目标产物进行梯度洗脱；分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总。本发明分离方法简单，可规模化生产，回收率高且稳定。

Description

一种达巴万星的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及药物纯化领域，特别是一种高效分离纯化达巴万星的方法。
背景技术
达巴万星(Dalbavancin)是新型半合成糖肽类抗生素，其作用机制与万古霉素和替考拉宁相同，通过抑制G+菌细胞壁的生物合成，可被广泛用作治疗皮肤和软组织感染的药物。达巴万星具有独特的药动学性质，半衰期长，可每周间隔用药，且能代谢完全。目前，达巴万星在治疗导管相关的血源性感染以及皮肤和软组织感染已取得了良好的效果，其具有优良的体内抗菌活性和安全性，是理想的第二代糖肽抗生素。
达巴万星由结构相近的A0、A1、B0、B1和B2五种成分组成，其中B0是其主要成分，这五种成分具有相同的母核结构。根据美国发明专利US 20120184497 A1的报道，达巴万星作为抗菌药使用时，其主要成分B0要求应不低于75％。达巴万星是由放线菌代谢产物A40926经过氨基葡萄糖醛酸上的羧基酯化、38位羧基酰胺化、酯水解得到。达巴万星的结构式如下：
目前国内外专利、文献等对达巴万星的分离纯化方法鲜有报道。在国内，目前达巴万星不存在化合物制备、分离相关的专利，仅存在三篇制剂或组合物相关的专利CN200380103406.2、CN200710140471.2和CN200380103406.2。因此有必要对达巴万星的分离、纯化和制备做更进一步的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效分离纯化达巴万星的方法，仅需一步层析纯化即可满足达巴万星主要组份B0含量高于75％的要求，纯化收率高而稳定，同时本发明分离方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低生产成本。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种达巴万星的分离纯化方法，其特征在于，将达巴万星粗提取物进行溶解、过滤；将上述过滤后的达巴万星溶液上样到装有聚苯乙烯高分子聚合物微球的层析柱中进行层析；采用磷酸水溶液和有机溶剂作为流动相对达巴万星溶液进行梯度洗脱；分段收集目的峰值的达巴万星溶液，对符合要求的组份液进行汇总。
优选的，所述聚苯乙烯高分子聚合物微球为单分散的、具有孔道结构的微球。
优选的，所述微球的型号可以是或
优选的，达巴万星粗提取物溶解于10％-20％的酸性甲醇溶液中，其溶液pH值控制在2-5。
优选的，磷酸水溶液中含有0.1％的磷酸。
优选的，有机溶剂可以为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、异丙醇。
优选的，上样前，对层析柱进行柱前预处理，先高浓度有机相进行除杂，后用浓度低于20％的有机相进行平衡。
优选的，所述梯度洗脱过程为，先用甲醇含量为40-50％的流动相冲洗5-10个柱体积脱前杂，再用甲醇含量为45-55％的流动相冲洗6-10个柱体积洗脱主峰，最后用甲醇含量为65-75％的流动相冲洗2-4个柱体积洗脱后杂。
和是苯乙烯单体通过聚合形成的粒径分别为30μm和40μm，孔径的高分子微球，该微球严格控制的粒径大小和孔径结构(如图1)，使其作为色谱填料时具有很好的针对性，较好的契合了达巴万星的分子大小与结构，因此特别适合用于纯化达巴万星。同时，聚苯乙烯基质的该微球可耐受全pH范围，并可在后期对层析柱进行高pH下的彻底清洗，便于工业上反复利用，填料寿命长，降低成本。
本发明采用有机溶剂和含0.1％磷酸的水溶液作为流动相，仅用6-10个柱体积就可完成达巴万星主峰的洗脱，因此本过程所用流动相安全、无污染且成本较低，并且使用的流动相量较少，纯化周期比较短。
本发明采用单分散的和作为固定相，仅需一步层析即可使达巴万星主要组份B0含量高于85％，收率可达88％。
因此，本发明方法分离纯化达巴万星B0组分，不仅纯度高、收率高且稳定，而且操作简单方便，所用固定相可重复利用，所用流动相量少节约，大大降低成本。
附图说明
图1为实施例1使用的PS30-300聚合物微球的的扫描电镜照片。
图2为实施例1提纯前的粗品的高效液相色谱分析。
图3为实施例1达巴万星纯化后的高效液相色谱分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
量取40mg/ml的达巴万星粗品(58％纯度)溶于20％乙醇溶液中，加一定量HCl溶解，溶液pH值控制在2-5，超声处理。待溶液澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用4.6×250mm的色谱柱，聚合物微球(苏州纳微科技有限公司生产)作为层析柱填料，装柱体积为4.2ml。上样前，对层析柱进行柱前预处理，先高浓度有机相进行除杂，后用浓度低于20％的有机相进行平衡。然后采用0.1％的磷酸水溶液和甲醇溶液作为流动相进行梯度洗脱，流速控制在1ml/min。梯度洗脱过程为，先用甲醇含量为45％的流动相冲洗8个柱体积脱前杂，后用甲醇含量为50％的流动相冲洗7个柱体积洗脱主峰，再用甲醇含量为70％的流动相冲洗3个柱体积洗脱后杂。分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中达巴万星B0的纯度90％，收率88％。
图2是提纯前的达巴万星粗品的高效液相色谱分析，可见杂质非常多且杂。图3是提纯后的达巴万星高效液相色谱分析，可见杂质少且浓度低。
实施例2
量取40mg/ml的达巴万星粗品(58％纯度)溶于20％乙醇溶液中，加一定量HCl溶解，溶液pH值控制在2-5，超声处理，待溶液澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用4.6×250mm的色谱柱，聚合物微球(苏州纳微科技有限公司生产)作为层析柱填料，装柱体积为4.2ml。上样前，对层析柱进行柱前预处理，先高浓度有机相进行除杂，后用浓度低于20％的有机相进行平衡。然后采用0.1％的磷酸水溶液和甲醇溶液作为流动相进行梯度洗脱，流速控制在1ml/min。梯度洗脱过程为，先用甲醇含量为45％的流动相冲洗8个柱体积脱前杂，后用甲醇含量为50％的流动相冲洗7个柱体积洗脱主峰，再用甲醇含量为70％的流动相冲洗3个柱体积洗脱后杂。分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中达巴万星B0的纯度为87％，收率89％。
实施例3
量取40mg/ml的达巴万星粗品(58％纯度)溶于20％乙醇溶液中，加一定量HCl溶解，溶液pH值控制在2-5，超声处理，待溶液澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用4.6×250mm的色谱柱，聚合物微球(苏州纳微科技有限公司生产)作为层析柱填料，装柱体积为4.2ml。上样前，对层析柱进行柱前预处理，先高浓度有机相进行除杂，后用浓度低于20％的有机相进行平衡。然后采用0.1％的磷酸水溶液和甲醇溶液作为流动相进行梯度洗脱，流速控制在1ml/min。梯度洗脱过程为，先用甲醇含量为45％的流动相冲洗8个柱体积脱前杂，后用甲醇含量为50％的流动相冲洗9个柱体积洗脱主峰，再用甲醇含量为70％的流动相冲洗4个柱体积洗脱后杂。分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中达巴万星B0的纯度74％，收率89％。
实施例4
量取40mg/ml的达巴万星粗品(58％纯度)溶于20％乙醇溶液中，加一定量HCl溶解，超声处理，待溶液澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用4.6×250mm的色谱柱，聚合物微球(苏州纳微科技有限公司生产)作为层析柱填料，装柱体积为4.2ml。上样前，对层析柱进行柱前预处理，先高浓度有机相进行除杂，后用浓度低于20％的有机相进行平衡。采用0.1％的磷酸水溶液和甲醇溶液作为流动相进行梯度洗脱，流速控制在1ml/min。梯度洗脱过程为，先用甲醇含量为45％的流动相冲洗10个柱体积脱前杂，后用甲醇含量为50％的流动相冲洗12个柱体积洗脱主峰，再用甲醇含量为70％的流动相冲洗4个柱体积洗脱后杂。分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中达巴万星B0的纯度85％，收率60％。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种达巴万星的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：将达巴万星粗提取物进行溶解、过滤；将上述过滤后的达巴万星溶液上样到装有聚苯乙烯高分子聚合物微球的层析柱中进行层析；采用磷酸水溶液和有机溶剂作为流动相对达巴万星溶液进行梯度洗脱；分段收集目的峰值的达巴万星溶液，对符合要求的组份液进行汇总。
2.如权利要求1所述的达巴万星的分离纯化方法，其特征在于，所述聚苯乙烯高分子聚合物微球为单分散的、具有孔道结构的微球。
3.如权利要求2所述的达巴万星的分离纯化方法，其特征在于，所述微球的型号是30-300或40-300。
4.如权利要求1所述的达巴万星的分离纯化方法，其特征在于，将达巴万星粗提取物溶解于10％-20％的酸性甲醇溶液中，其溶液pH值控制在2-5。
5.如权利要求1所述的达巴万星的分离纯化方法，其特征在于，所述磷酸水溶液中含有0.1％的磷酸。
6.如权利要求1所述的达巴万星的分离纯化方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、异丙醇。
7.如权利要求1所述的达巴万星的分离纯化方法，其特征在于，上样前，对层析柱进行柱前预处理，先用高浓度有机相进行除杂，后用浓度低于20％的有机相进行平衡。
8.如权利要求1所述的达巴万星的分离纯化方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程为，先用甲醇含量为40-50％的流动相冲洗5-10个柱体积脱前杂，再用甲醇含量为45-55％的流动相冲洗6-10个柱体积洗脱主峰，最后用甲醇含量为65-75％的流动相冲洗2-4个柱体积洗脱后杂。
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