CN115219626A - 达巴万星合成反应的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药分析技术领域，特别涉及一种达巴万星合成反应的分析方法，包括如下步骤：S1、利用高效液相色谱法建立从达巴万星母核A40926、中间体至达巴万星合成反应中各化合物的特征色谱图；以及以相同的高效液相色谱条件获得样品的高效液相色谱后，基于面积归一化法获得样品中化合物与对应化合物的浓度比值，以实现对样品的分析。本发明所提供的达巴万星合成反应的分析方法灵敏、便捷且稳定。
Description
技术领域
本发明涉及医药分析技术领域，特别涉及一种达巴万星合成反应的分析方法。
背景技术
达巴万星(Dalbavancin)，又称道古霉素，是一种新型半合成糖肽类抗生素，于2014年5月23日获FDA批准在美国上市。达巴万星的作用机制与万古霉素和替考拉宁相同，通过抑制G+菌细胞壁的生物合成，具有很强的抗菌活性，被广泛用于治疗皮肤和软组织感染。
达巴万星的主要给药途径为静脉注射，具有独特的药动学性质，半衰期长，每周给药一次即可，且能代谢完全。目前，达巴万星在治疗导管相关的血源性感染以及皮肤和软组织感染方面取得了良好的效果，其具有优良的体内抗菌活性和安全性，是理想的第二代糖肽类抗生素。
达巴万星是由放线菌代谢产物A40926经过氨基葡萄糖醛酸上的羧基酯化、38位羧基酰胺化、酯水解得到的。达巴万星的母核结构如式(1)所示：
目前国内外文献对达巴万星中间体的检测方法鲜有报道。CN107121505A、CN113447575A报道的均为达巴万星合成原料3-二甲胺基丙胺的检测方法，均没有对达巴万星中间体的研究报道。因此，为了直观监测达巴万星的合成反应过程，有必要针对达巴万星中间体的分离开发一种灵敏、便捷、稳定的检测方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种灵敏、便捷且稳定的达巴万星合成反应的分析方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：达巴万星合成反应的分析方法，包括如下步骤：
S1、利用高效液相色谱法建立从达巴万星母核A40926、中间体至达巴万星合成反应中各化合物的特征色谱图；
S2、以相同的高效液相色谱条件获得样品的高效液相色谱图后，基于面积归一化法获得样品中化合物与对应化合物的浓度比值，以实现对样品的分析。
本发明的有益效果在于：本发明所提供的分析方法适用于达巴万星从母核至成品的全过程样品检测，各中间体均由同一方法进行检测，减少切换不同检测方法所带来的繁琐过程，有效提高高效液相色谱仪的工作效率，对达巴万星的整个合成过程进行直观监测，极大方便了达巴万星各反应步骤的杂质溯源、反应终点判定以及各步合成收率的计算，大大提高了整个工艺的优化效率。
附图说明
图1所示为本发明在具体实施方式中达巴万星母核A40926对照品的色谱图；
图2所示为本发明在具体实施方式中酯化产物的色谱图；
图3所示为本发明在具体实施方式中酰胺化产物的色谱图；
图4所示为本发明在具体实施方式中水解产物的色谱图；
图5所示为本发明在具体实施方式中中间体混合样品的色谱图；
图6所示为本发明在具体实施方式中酯化产物样品的色谱图；
图7所示为本发明在具体实施方式中水解产物样品的色谱图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
达巴万星合成反应的分析方法，包括如下步骤：
S1、利用高效液相色谱法建立从达巴万星母核A40926、中间体至达巴万星合成反应中各化合物的特征色谱图；
S2、以相同的高效液相色谱条件获得样品的高效液相色谱图后，基于面积归一化法获得样品中化合物与对应化合物的浓度比值，以实现对样品的分析。
其中，所述中间体包括以达巴万星母核A40926为合成原点所合成的酯化产物和由所述酯化产物所合成的酰胺化产物。
所述分析具体可以为：
1、可直观看出反应底物的残留量(按面积归一化法计)、目标产物生成的量以及各杂质所占的量(按面积归一化法计)，从而快速判断反应终点(理想的合成反应终点为底物基本转化为目标产物，且杂质少)；
2、可通过相应标准标定各反应中底物和产物的含量，以实现各步反应收率的计算；
3、通过杂质不同的底物进行合成反应生成含杂质不同的产物，从而找出二者杂质间的相关性，进而对杂质进行溯源，指导合成反应的优化方向，提高合成反应的优化效率。
具体的，所述对样品的分析包括但不限于对样品反应程度的分析，反应终点的判定、收率等数据的计算、杂质溯源等。
所述对应化合物为以该样品中化合物为基准的前步骤化合物。举例而言，当样品中化合物为酯化产物时，对应化合物为达巴万星母核A40926；当样品中化合物为酰胺化产物时，对应化合物为所述酯化产物；当样品中化合物为达巴万星时，对应化合物为所述酰胺化产物。
优选地，所述高效液相色谱条件为：
色谱柱：
4.6×250mm，5μm；
流速：1.0mL/min；
检测波长：210nm；
进样量：10μL；
柱温：30℃；
进样器温度：15℃；
流动相A：缓冲液：乙腈＝9:1；
流动相B：乙腈；
流动相梯度为：
| 时间 | 流动相A | 流动相B |
| 0min | 75％ | 25％ |
| 15min | 45％ | 55％ |
| 18min | 75％ | 25％ |
| 25min | 75％ | 25％ |
其中，缓冲液为乙酸铵水溶液，其浓度为每1000mL水中含有乙酸铵1.16g。
具体的，所述S1具体包括如下步骤：
S11、稀释剂：取乙腈和水，并以体积比50：50配制稀释剂；
S12、达巴万星母核A40926对照品溶液：精密称取25mg达巴万星母核A40926对照品，置于50mL容量瓶，用所述稀释剂溶解定容，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，即得；
S13、酯化产物(C84H90C12N8O29)溶液：取达巴万星母核A40926进行酯化反应，获得酯化产物溶液，再用所述稀释剂稀释50倍，以0.45μm滤膜过滤，即得；
S14、酰胺化产物(C89H102Cl2N10O28)溶液：取所述酯化产物进行酰胺化反应，获得酰胺化产物溶液，再用所述稀释剂稀释50倍，以0.45μm滤膜过滤，即得；
S15、水解产物溶液：取所述酰胺化产物溶液进行水解反应，获得水解产物溶液，再用所述稀释剂稀释50倍，以0.45μm滤膜过滤，即得；
S16、中间体混合溶液：分别取200μL的达巴万星母核A40926对照品溶液、酯化产物溶液、酰胺化产物溶液和水解产物溶液混合，即得；
S17、分别将所述达巴万星母核A40926对照品溶液、酯化产物溶液、酰胺化产物溶液和中间体混合溶液进行高效液相色谱分析，获得达巴万星母核A40926的特征色谱图、酯化产物的特征色谱图、酰胺化产物的特征色谱图和中间体混合溶液的特征色谱图。
在本申请中，所述酯化反应为：在三口烧瓶中加入100mL正丁醇，冷却至5℃后滴加浓盐酸，调节pH值为1.2，加入达巴万星母核A40926(10.00g，5.77mmol)，在5℃下搅拌反应8小时，缓慢滴加三乙胺将pH调至5.5时出现沉淀，过滤，在35℃真空干燥获得酯化产物。
所述酰胺化反应为：将所述酯化产物(9.50g，5.28mmol)在25～30℃下溶于150mLDMSO中，加入3,3-二甲氨基-1-丙胺(0.65g，6.36mmol)和DCC(1.30g，6.35mmol)，在20℃下搅拌反应8小时，加入170mL甲基叔丁基醚沉淀，过滤，在35℃真空干燥获得酰胺化产物。
所述水解反应为：取酰胺化产物(8.70g，4.83mmol)溶于10mL乙腈和水的混合溶液中，在5℃条件下缓慢滴加1mol/L LiOH溶液至pH10，继续在此温度条件下搅拌反应6小时；然后缓慢滴加1N盐酸溶液调节pH＝6，获得水解产物(成品达巴万星)溶液，取1mL并用所述稀释剂稀释50倍，以0.45μm滤膜过滤，即得水解产物样品。
需要说明的是，所述酯化反应、酰胺化反应和水解反应均为常规合成反应(参见CN109467592B，其以引用的方式整体并入本文)。
实施例1
达巴万星合成反应的分析方法，包括如下步骤：
S1、稀释剂：取乙腈和水，并以体积比50：50配制稀释剂；
S2、达巴万星母核A40926对照品溶液：精密称取25mg达巴万星母核A40926对照品，置于50mL容量瓶，用所述稀释剂溶解定容，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，即得；
S3、酯化产物(C84H90Cl2N8O29)溶液：取达巴万星母核A40926进行酯化反应，获得酯化产物溶液，再用所述稀释剂稀释50倍，以0.45μm滤膜过滤，即得；
S4、酰胺化产物(C89H102Cl2N10O28)溶液：取所述酯化产物进行酰胺化反应，获得酰胺化产物溶液，再用所述稀释剂稀释50倍，以0.45μm滤膜过滤，即得；
S5、水解产物溶液：取所述酰胺化产物溶液进行水解反应，获得水解产物溶液，再用所述稀释剂稀释50倍，以0.45μm滤膜过滤，即得；
S6、中间体混合溶液：分别取200μL的达巴万星母核A40926对照品溶液、酯化产物溶液、酰胺化产物溶液和水解产物溶液混合，即得；
S7、分别将所述达巴万星母核A40926对照品溶液、酯化产物溶液、酰胺化产物溶液、中间体混合溶液进行高效液相色谱分析，获得达巴万星母核A40926的特征色谱图(图1)、酯化产物的特征色谱图(图2)、酰胺化产物的特征色谱图(图3)、水解产物的特征色谱图(图4)和中间体混合溶液的特征色谱图(图5)；
所述高效液相色谱分析的条件为：
色谱柱：
4.6×250mm，5μm；
流速：1.0mL/min；
检测波长：210nm；
进样量：10μL；
柱温：30℃；
进样器温度：15℃；
流动相A：缓冲液：乙腈＝9:1；
流动相B：乙腈；
流动相梯度为：
| 时间 | 流动相A | 流动相B |
| 0min | 75％ | 25％ |
| 15min | 45％ | 55％ |
| 18min | 75％ | 25％ |
| 25min | 75％ | 25％ |
其中，缓冲液为乙酸铵水溶液，其浓度为每1000mL水中含有乙酸铵1.16g。
由图5可知：达巴万星母核A40926的保留时间为7.104min，酯化产物的保留时间为9.607min，酰胺化产物的保留时间为10.699min，水解产物的保留时间为8.791min，任意相邻峰之间的分离度均大于1.5，说明达巴万星母核A40926与酯化产物、酯化产物与酰胺化产物，酰胺化产物与水解产物之间实现了很好的分离，该方法的专属性良好，为准确测定达巴万星各中间体的含量提供了非常有利的前提条件，为各步合成反应的收率计算奠定了良好的基础。
实施例2
将实际生产的酯化产物按前述方法进行酰胺化反应和水解反应，获得水解产物，并按与实施例1相同的相同的高效液相色谱分析的条件分别对所述实际生产的酯化产物和其水解产物进行色谱分析，获得酯化产物的色谱图(图6)和水解产物的色谱图(图7)。分析图1至图7可以看出：酯化产物(图2)的杂质1含量为2.56％(按面积归一化法计)，生成水解产物(图4)的杂质2的含量为3.03％(按面积归一化法计)，酯化产物(图6)的杂质2含量为24.12％(按面积归一化法计)，生成水解产物(图7)的杂质2的含量为15.98％(按面积归一化法计)，由此可认为水解产物中杂质2的生成与酯化产物的杂质1相关，为降低水解产物中杂质2的生成则需对酯化产物的杂质1进行限度控制。
由图3～图5可知：各合成反应步骤中的反应产物与反应底物、反应产物与杂质、杂质与杂质之间均能实现较好的分离，由面积归一化法可直观得到反应产物的生成量(按百分比计)，底物的残留量(按百分比计)以及各杂质所占的比例，可快速判定反应终点，指导合成反应的优化方向，提高合成反应的优化效率，理想的合成反应终点为底物少，杂质少，产物高。
综上所述，本发明所提供的分析方法适用于达巴万星从母核至成品的全过程样品检测，各中间体均由同一方法进行检测，减少切换不同检测方法所带来的繁琐过程，有效提高高效液相色谱仪的工作效率，对达巴万星的整个合成过程进行直观监测，极大方便了达巴万星各反应步骤的杂质溯源、反应终点判定以及各步合成收率的计算，大大提高了整个工艺的优化效率。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.达巴万星合成反应的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、利用高效液相色谱法建立从达巴万星母核A40926、中间体至达巴万星合成反应中各化合物的特征色谱图；
S2、以相同的高效液相色谱条件获得样品的高效液相色谱图后，基于面积归一化法获得样品中化合物与对应化合物的浓度比值，以实现对样品的分析。
2.根据权利要求1所述达巴万星合成反应的分析方法，其特征在于，所述中间体包括达以巴万星母核A40926为合成原点所合成的酯化产物和由所述酯化产物所合成的酰胺化产物。
3.根据权利要求1所述达巴万星合成反应的分析方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件为：
色谱柱：
XB-C18，4.6×250mm，5μm；
流速：1.0mL/min；
检测波长：210nm；
进样量：10μL；
柱温：30℃；
进样器温度：15℃；
流动相A：缓冲液：乙腈＝9:1；
流动相B：乙腈；
流动相梯度为：
0min，75％流动相A，25％流动相B；
15min，45％流动相A，55％流动相B；
18min，75％流动相A，25％流动相B；
25min，75％流动相A，25％流动相B。
4.根据权利要求3所述达巴万星合成反应的分析方法，其特征在于，所述缓冲液为乙酸铵水溶液，其浓度为每1000mL水中含乙酸铵1.16g。
5.根据权利要求1所述达巴万星合成反应的分析方法，其特征在于，所述S1包括如下步骤：
S11、稀释剂：取乙腈和水，并以体积比50：50配制稀释剂；
S12、达巴万星母核A40926对照品溶液：精密称取25mg达巴万星母核A40926对照品，置于50mL容量瓶，用所述稀释剂溶解定容，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，即得；
S13、酯化产物(C84H90C12N8O29)溶液：取达巴万星母核A40926进行酯化反应，获得酯化产物溶液，再用所述稀释剂稀释50倍，以0.45μm滤膜过滤，即得；
S14、酰胺化产物(C89H102Cl2N10O28)溶液：取所述酯化产物进行酰胺化反应，获得酰胺化产物溶液，再用所述稀释剂稀释50倍，以0.45μm滤膜过滤，即得；
S15、水解产物溶液：取所述酰胺化产物溶液进行水解反应，获得水解产物溶液，再用所述稀释剂稀释50倍，以0.45μm滤膜过滤，即得；
S16、中间体混合溶液：分别取200μL的达巴万星母核A40926对照品溶液、酯化产物溶液、酰胺化产物溶液和水解产物溶液混合，即得；
S17、分别将所述达巴万星母核A40926对照品溶液、酯化产物溶液、酰胺化产物溶液和中间体混合溶液进行高效液相色谱分析，获得达巴万星母核A40926的特征色谱图、酯化产物的特征色谱图、酰胺化产物的特征色谱图和中间体混合溶液的特征色谱图。
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