CN1032235C - 卡达西叮发色团的生产方法 - Google Patents

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Abstract

卡达西叮发色团是一种由卡达西叮抗肿瘤抗菌素中分离出来的非蛋白发色团，它是通过溶剂萃取和色谱方法纯化或部分纯化卡达西叮而得到。该发色团被发现具有卡达西叮的几乎所有抗肿瘤活性。

Description

卡达西叮发色团的生产方法
美国专利5001112中公开了一种叫作卡达西叮(Kedarcidin)的蛋白抗肿瘤抗菌素。据报道，这种抗菌素是由一种单链多肽和一种非蛋白发色团组成的复合物。卡达西叮是由一种链异壁菌属的新种菌株(streptoalloteichus Sp.nov.strain)L585-6(ATCC-53650)发酵得到的，它的分离和纯化已在上述的美国专利的例4中描述。在此专利中既没有公开从卡达西叮抗菌素中分离发色团的方法，也没有提及卡达西叮的抗肿瘤活性应归因于非蛋白发色团。
所谓新制癌菌素的抗肿瘤抗菌素是由1∶1的蛋白和非蛋白发色团复合而成。文献中公开了新制癌菌素的发色团部分可以通过用酸性甲醇溶液萃取新制癌菌素的复合物而得到；新制癌菌素的抗肿瘤特性主要归因于发色团。新制癌菌素中的发色团结构已被确定(可见于J.Antibiotics，1989，42，761-768)，然而，对于卡达西叮，用甲醇萃取的方法却不能满意地获得纯发色团。
另外一种叫金霉素的蛋白抗肿瘤抗菌素也由一种蛋白和一种非蛋白发色团组成。这种抗菌素的发色团也是用甲醇萃取抗菌素的方法获得的。(见于Biochcm.Biophys.Res.Commun.，1980，94，255-261)，并且再次发现了抗肿瘤活性主要是基于抗菌素中的发色团的。
申请者发现了其它种类的含有非蛋白发色团的蛋白抗肿瘤抗菌素，其发色团既不能成功地运用前述的甲醇萃取法，也不能运用其它的常规纯化方法从抗菌素中分离。总之，这种蛋白抗菌素的发色团，即便是能够被分离，同抗菌素复合物本身相比，它也是很不稳定的。
本发明涉及一种从卡达西叮抗菌素中获得的新型抗肿瘤发色团。
本发明提供了一种生产卡达西叮发色团的方法，其步骤如下：(a)制备卡达西叮水溶液；(b)将该水溶液以乙酸乙酯进行有机萃取，(c)收集乙酸乙酯萃取液；(d)将该萃取液加入硅胶色谱柱中，用苯—甲醇分步梯度洗脱；(e)收集含卡达西叮发色团的级分。
本发明的另外一方面是关于抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，它包括向该宿主给予肿瘤抑制量的卡达西叮发色团或其药用组合物。
本发明还提供了一种药用组合物，它由肿瘤抑制量的卡达西叮和药学上可接受的稀释剂或载体组成。
图1是卡达西叮发色团的红外吸收光谱(KBr片)。
图2是卡达西叮发色团溶于甲醇后的紫外吸收光谱。
图3是卡达西叮发色团在DMSO-d6中质子磁共振光谱(500.13MHz)。
图4是卡达西叮发色团在DMSO-d6中的13C磁共振光谱(125.76MHz)。
卡达西叮发色团可以按照美国专利5001112从卡达西叮抗肿瘤抗菌素中获得，也可以从用于生产卡达西叮发酵液中获得。一种优选的原料是用上述专利实施例4中描述的方法分离和纯化了的卡达西叮，另外一种优选的原料是通过过滤生产卡达西叮的菌株(Streptoallotei-chus)的发酵液得到的。将滤液加入阴离子交换色谱中，先用PH7-8的阳离子缓冲液，再用含NaCl的这种缓冲液洗脱，收集NaCl缓冲液洗脱的溶液。这种色谱方法去除了卡达西叮溶液中的许多杂质而且有很高的卡达西叮发色团收率。本申请者发现在将要进行下述的萃取步骤前把该洗脱液冻干处理后便于贮存，但实际上，这种洗脱液也可被直接使用。前述的过滤发酵液也可以不经过阴离子交换纯化步骤直接使用，但是要获得纯的发色团则需进一步的纯化，此方法同以纯化的卡达西叮为原料或以阴离子交换步骤部分纯化的发酵液为原料的方法相比，效率要低得多。
然后，将上述方法纯化或部分纯化的卡达西叮的水溶液以乙酸乙酯进行有机萃取。另外的一些有机溶剂，例如，提取新制癌菌素的酸性甲醇、正丁醇、苯—甲醇和氯仿—甲醇却导致发色团降解或形成乳浊液。再将乙酸乙酯萃取液加入硅胶液相色谱柱，用苯—甲醇溶液分步梯度洗脱，甲醇浓度逐渐增大。洗脱液由薄层色谱监控，然后真空浓缩含有纯化了的卡达西叮发色团的洗脱液，以获得浅黄色的无定形产品。
卡达西叮发色团具有以下的物化特性：
外观：浅黄色无定形固体。
稳定性：很不稳定，在苯、甲醇、氯仿和二甲基亚砜(DMSO)等溶液中数小时降解。
分子式：C53H60N3O16Cl
分子量：1029.3628
质谱：Kratos MS50质谱[M＋H]+1030，FAB使用间硝基苯甲醇。
红外光谱：Perkin Elmer 1800傅立叶转换红外光谱仪，KBr片，主要吸收峰(cm-1)
3432，3076，2976，2832，2188，
1742，1656，1622，1524，1470，
1450，1434，1386，1354，1298，
1240，1192，1164，1114，1080，
1060，1032，1010，980，936，
902，862，824，798，680.
紫外光谱：Hewlett Packard 8452A二极管光谱，λmax(MeOH)：256，316nm(Logε4.78，4.16)。
高压液相色谱分析：
柱子：Q-BEX C18(10μ)#10230
洗脱液：4份四氢呋喃
        6份0.2M的乙酸铵
流速：  2ml/min
检测波长：254nm
样品浓度：每微升甲醇4微克
保留时间：12分钟。
元素分析：碳，58.78；氢，5.78；氮，3.56；含氯试验，正；含硫试验，负。
1H核磁共振：布鲁克(Bruker)AM-500型光谱仪；
溶剂：DMSO-d6；
观察到的化学位移(相对于DMSO信号的δ2.531)：
1.09(s，3H)，1.16(s br，
6H)，1.34(s br，6H)，1.74
(m，2H)，1.92(m，1H)，2.05
(d，1H，J＝14.3)，2.36(m，
1H)，2.46(s，6H)，2.86(m，
2H)，3.21(m，1H)，3.78(s，
3H)，3.95(s，3H)，3.95(m，
1H)，4.04(m，1H)，4.09(m，
1H)，4.12(m，1H)，4.27(m，
1H)，4.30(m，1H)，4.34(m，
1H)，4.53(s br，1H)，4.75
(m，1H)，4.81 s br，1H)，5.11
(s br，1H)，5.44(s br 1H)，
5.56(m，1H)，6.19(s，1H)，
6.62(s，1H)，6.97(s，1H)，
7.11(s，1H)，7.22(d，1H，
J＝8.3)，8.06(d，1H，J＝8.3)，
8.48(s，1H)，9.56(d，1H，
J＝7.4).
13C核磁共振：布鲁克AM-500型光谱仪；
溶剂：DMSO-d6；
观察到的化学位移(相对于DMSO信号δ
39.113，39.268，39.447，
39.601，39.780，39.935，
40.113)：信号             PPM         峰重数：1              17.13          q2              18.25          q3              21.86          q4              27.19          q5              36.38          t6              37.62          t7              41.64          t8              44.63          q9              48.31          d10             49.94          d11             60.71          q12             61.62          q13             64.05          d14             64.24          t15             65.57          d16             65.96          d17             68.45          s18             68.93          d19             70.11          d20             71.85          s21             71.91          d22             76.22          d23             78.46          d 24             83.14        d25             88.16        s26             94.64        d27             99.81        d28             99.91        s29             102.13       d30             103.96       s31             109.79       s32             110.01       d33             115.86       s34             117.10       s35             120.06       d36             122.80       d37             123.99       d38             129.02       s39             134.33       s40             136.22       d41             139.02       s42             139.10       d43             141.40       s44             144.46       s45             146.28       s46             148.43       s47             153.29       s48             155.17       s49             155.37       s50             167.24       s51             169.06       s薄层色谱：Rf0.29苯-甲醇9∶2
      Rf0.16苯-甲醇9∶1板：硅胶GHLF单一板，0.25毫米厚(Analtech)；检测：短波长紫外光、二硫酸铈喷洒剂。鉴于上述物化性质，卡达西叮发色团的结构被确认为：
Figure C9211025600091
生物活性
卡达西叮发色团的抗肿瘤活性在体外针对数种人的肿瘤细胞系的细胞毒性实验中、在体内对移植小白鼠P388白血病和B-16黑素瘤细胞中评估。所用的方法及所获结果如下：
I.方法：
A.体外细胞毒性实验
用于体外估价细胞毒性效能的细胞系包括：人体克隆腺癌HCT116药敏感系；HCT116/VP35和HCT116/VM46子药抗细胞系，这种抗细胞系包含有低量的拓扑同分异构酶II和较多量的P-170糖蛋白1；人卵巢癌A2780药物敏感系和A2780/DDP子药抗细胞系。据报道A2780/DDP细胞系通过增强DNA修复机制和增加GSH/GST水平来起对抗作用。细胞是在McCoy培养基和10％胎牛血清中培养的。在对数生长期，把细胞转移至96孔微量滴定板，每孔4×103个细胞，并在95％氧气、5％二氧化碳的气体中，37℃下孵育24小时，以使细胞附着孔壁。在第一排孔中加入系列稀释(4倍稀释)的化合物，再孵育72小时。每孔中存活细胞的数量可用前述方法2计数，即在最终浓度为0.005mM的吩嗪N—甲硫酸盐中加入最终浓度为0.05mg/ml升的四唑鎓盐染色剂(XTT)。室温下孵育3小时，以使颜色变深，用DynatechMR600板计数器在450nm下测定其光密度值。IC50值(抑制细胞生长50％的药物浓度)用光密度读数线性回归分析得到。在分开的96孔板中对各种药剂作用于各种细胞系实验重复三次。
B.小鼠体内模型
1.P388小鼠白血病模型
P388肿瘤在DBA/2小鼠腹水中培养。此肿瘤实验是在CDF1小鼠中经由腹膜内和静脉内在第零天，按照指定路径和计划注入加了一定药剂的1×106个白血病细胞。小鼠在第零天和第五天(或第六天)称重，重量减轻了20％以上的说明了药物毒性。每剂量组实验由6个小鼠及10个未处理小鼠对照组成。配药计划为Q1DX1；1。每天进行死亡检查，并确定各组的平均寿命。药物处理组的小鼠同未药物处理的对照组小鼠相对比，寿命延长了25％以上作为药物有活性(％T/C大于125％)的判据。实验的完成大约需要30天。
2.B-16小鼠固体肿瘤模型
B-16小鼠黑素瘤被作为皮下生长瘤在C57BL/6小鼠中培养。实验是在BDF1小鼠中经由大腿骨上部突起处在第零天皮下植入25毫克肿瘤片段。卡达西叮发色团是按Q1DX1；1配药计划给药的。小鼠在第零天和第9天称重。
II.结果
A.在体外
如下表所示，卡达西叮发色团对细胞生长的抑制是特别有效的(和VP-16(鬼臼乙叉苷)相比，IC50值表示为每毫升化合物的毫微克数，最终浓度)。卡达西叮发色团对两种VP-16敏感细胞系比VP-16的效能要分别高285和1725倍。另外，卡达西叮发色团对HCT116/VP35或HCT116/VM46细胞系和VP-16没有交叉对抗。当评价对A2780和A2780/DDP细胞系的敏感性时，VP-16和卡达西叮发色团对对抗细胞系的效能比对敏感细胞系的效能大约低6.6倍。
                               卡达西叮发色团的细胞毒性(体外)
                                          IC50(ng/ml)化合物                                               细胞系
                          HCT116   HCT116/VP35   HCT116/VM46    A2780    A2780/DDP卡达西叮发色团                 0.4         0.3          0.3          0.2        1.3vp-16a(鬼臼乙叉苷)            690         8758         3255         57         379aVp-16值是从上六个试验中一式三份所得的平均值
B.在体内
1.P388小鼠白血病模型
评估卡达西叮发色团对腹膜内植入的P388小鼠白血病细胞的抑制作用，可知，在植入肿瘤细胞一天后，卡达西叮发色团的优化腹膜注入量为每次1毫克/千克。优化剂量下，卡达西叮发色团产生175的T/C％。在同样的实验中，静脉内植入P388肿瘤细胞，卡达西叮发色团对之也是敏感的。在肿瘤细胞静脉植入一天后，卡达西叮发色团的优化静脉注入量为每次0.25毫克/千克。在优化剂量下，卡达西叮发色团产生214的T/C％。在此静脉注入实验中，比较不同量的卡达西叮注入后的效果，可知，两个差别很大的卡达西叮注入量，其效能却几乎是相同的。卡达西叮发色团对于P388小鼠白血病的抗肿瘤活性在实验8328中得以证实。在腹膜内植入模型中，卡达西叮腹膜内给药(依照Q1DX1；1方案)，当优化剂量为每次注入0.25毫克/千克时，产生185的T/C％。在本实验的静脉植入部分，按照同样的注射计划静脉给药，优化剂量为每次0.125毫克/千克时产生186的T/C％。在这个实验中，卡达西叮发色团量虽然差别很大，但效果却相差不多。
在P388小鼠白血病模型中，卡达西叮发色团是有效的。不论是腹膜模型还静脉模型，都被用来评价该化合物的抗肿瘤活性。在P388模型中，卡达西叮发色团同卡达西叮相比具有同样的，或许还更高一些的效能。
2.B-16小鼠固体肿瘤模型
在实验796中，卡达西叮发色团的抗肿瘤活性是用B-16小鼠黑素瘤模型来评价的。当皮下植入肿瘤细胞一天后，静脉注射的卡达西叮发色团的优化剂量为每次0.062毫克/千克，其T/C％为164。根据寿命判据可知卡达西叮发色团是有活性的。在同样的实验中，应用同样的途径和方案，每次注入优化量为0.75毫克每千克的卡达西叮时，产生同样的T/C％。根据肿瘤生长推迟判据，卡达西叮和卡达西叮发色团都是具有活性的。
III.结论
由腹膜和静脉植入P388小鼠白血病细胞模型和皮下植入B-16小鼠黑素瘤模型，依据寿命判据，卡达西叮发色团显示出了明显的抗肿瘤活性，同卡达西叮相比，卡达西叮发色团具有同样的，甚至更有效的活性。
IV.参考资料
1.Long，B.H.，Wang，L.Lorico，A.，Wang，R.C.C.，Brattain，M.G.and Casazza，A.M.《在获取抑制人体克隆和肺癌细胞系中Etoposide和Teniposide的抑制机理》，Cancer Research 51；待发表(1991)。
2.Scudieo，D.A.，Shoemaker，R.H.，Paull，K.D.，Monks，A.，Tierney，S.，Nofziger，T.H.，Currens，M.J.，Seniff，D.and Boyd，M.R.《用人和其它的肿瘤细胞系在培养中对细胞生长和药物敏感性进行一种可溶的四唑鎓/甲分析的评估)，Cancer Research 48：4827-4833(1988)。
实验结果表明，卡达西叮发色团在体外对数种人的肿瘤细胞系展示了强有力的抗肿瘤活性，在体内对小鼠白血病P388和B0-16黑素瘤也具有抗肿瘤活性。
         对腹膜内注射P388白血病细胞的抗肿瘤活性(实验8305)
         mg/kg/剂量      药物测量       ％       平均重量      第五天活着
类别       或稀释        时间           T/C       变化(g)      老鼠的数目丝裂霉素C       4.8          23.0           230        -0.7           6/6
            3.2          20.0           200        -0.5           6/6卡达西叮        1.6          18.5           185        -1.3           6/626596-48-1      0.8          17.0           170        -0.9           6/6
            0.4          16.0           160        -0.8           6/6
            0.2          15.0           150        -0.0           6/6
            0.1          14.0           140         0.3           6/6
            0.05         13.5           135         0.8           6/6卡达西叮        1.6          17.5           175        -0.9           6/629190-85-1      0.8          17.5           175        -0.3           6/6
            0.4          15.0           150         0.2           6/6
            0.2          14.0           140         0.3           6/6
            0.1          13.5           135         0.5           6/6
            0.05         14.0           140         1.4           6/6卡达西叮        4            9.0            90         -3.6           6/6发色团          2            10.5           105        -2.2           6/6
        mg/kg/剂量      药物测量       ％      平均重量      第五天活着类别          或稀释          时间         T/C      变化(g)      老鼠的数目
            1             17.5         175       -0.3           6/6
            0.5           16.5         165       -0.5           6/6
            0.25          15.0         150       -0.4           6/6
            0.125         14.5         145        0.1           6/6对照物                        10.0         100        2.5           10/10
        对静脉内注射P388白血病细胞的抗肿瘤活性(实验8305)
        mg/kg/剂量       药物测量      ％      平均重量     第五天活着类别          或稀释           时间        T/C      变化(g)     老鼠的数目丝裂霉素C      4.8             13.5        193       -0.8          6/6
           3.2             11.0        157        0.5          6/6
           1.6             10.0        143       -0.3          6/6
           0.8              8.0        114        0.4          6/6卡达西叮       1.6              6.5         93       -6.0          6/626596-48-1     0.8             12.5        179       -3.0          6/6
           0.4             11.0        157       -0.0          6/6
           0.2              9.0        129        0.5          6/6
           0.1              8.0        114       -0.3          6/6
           0.05             7.0        100       -0.5          6/6卡达西叮       1.6              7.0        100       -4.8          6/629190-85-1     0.8             13.0        186       -2.0          6/6
           0.4             11.0        157       -0.3          6/6
           0.2              9.0        129       -0.0          6/6
           0.1              8.5        121       -0.2          6/6
           0.05             7.5        107       -0.0          6/6
        mg/kg/剂量       药物测量      ％     平均重量    第五天活着类别         或稀释            时间        T/C     变化(g)    老鼠的数目卡达西叮       4               TOX         TOX       -           0/6发色团         2               TOX         TOX       -           0/6
           1               TOX         TOX       -           0/6
          0.5              7.5         107       -2.9        6/6
          0.25             15.0        214       -0.8        6/6
          0.125            13.0        186       -0.3        6/6对照物                         7.0         100       -0.1        10/10
              对腹膜内注射P388白血病细胞的抗肿瘤活性(实验8328)
              mg/kg/剂量      药物测量     ％    平均重量    第五天活着
类别            或稀释          时间       T/C    变化(g)    老鼠的数目丝裂霉素C           4.8           20.0       200     -0.5         6/6
                  3.2           19.0       190     -0.8         6/6卡达西叮发色团        2.0           TOX        TOX     -1.9         2/6
                  1.0           9.0        90      -2.3         6/6
                  0.5           13.0       130     -1.1         6/6
                  0.25          18.5       185     -0.4         6/6卡达西叮              2.0           22.0       220     -1.1         5/6Q257                  1.0           21.0       210     -0.8         6/6
                  0.5           15.5       155     -0.5         6/6
                  0.25          17.0       170     -1.0         6/6
         mg/kg/剂量    药物测量    ％     平均重量变化    第五天活着类别          或稀释        时间       T/C        (g)         老鼠的数目卡达西叮        8.0         18.0       180       -1.4            6/6W-4             4.0         18.0       180       -1.3            6/6
            2.0         17.5       175       -0.8            6/6
            1.0         16.0       160       -1.0            6/6
            0.5         14.5       145       -0.9            6/6
            0.25        14.5       145       -0.3            6/6对照物                      10.0       100        0.8            10/10
         对静脉内注射P388白血病细胞的抗肿瘤活性(实验8328)
         mg/kg/剂量    药物测量    ％    平均重量    第五天活着类别          或稀释        时间       T/C    变化(g)    老鼠的数目丝裂霉素C       3.2         10.0       143     -0.7         6/6
            1.6         9.0        129     -0.1         6/6卡达西叮        1.0         TOX        TOX     -            0/6发色团          0.5         TOX        TOX     -            0/6
            0.25        7.0        100     -2.4         6/6
            0.125       13.0       186     -2.5         6/6卡达西叮        2.0         7.0        100     -5.6         6/6Q257            1.0         9.5        136     -4.7         6/6
            0.5         13.0       186     -1.7         6/6
            0.25        9.0        129     -0.7         6/6
       mg/kg/剂量    药物测量    ％    平均重量    第五天活着类别        或稀释        时间       T/C    变化(g)    老鼠的数目卡达西叮     8.0           7.0       100     5.4          6/6W-4          4.0           11.5      164     -3.6         6/6
         2.0           11.5      164     -0.9         6/6
         1.0           9.0       129     -0.9         6/6
         0.5           8.0       114     -0.0         6/6
         0.25          7.0       100     -0.1         6/6对照物                     7.0       100     -0.5         10/10
         对皮下注入B16黑素瘤细胞的抗肿瘤活性(实验796)
         mg/kg/剂量    药物测量    ％    平均重量     第五天活着类别          或稀释         时间      T/C    变化(g)     老鼠的数目卡达西叮       0.5           TOX       TOX      -             0/8发色团         0.25          TOX       TOX      -1.0          2/8
           0.125         31.5      126      1.1           8/8
           0.062         41.0      164      1.1           8/8卡达西叮       1.5           TOX       TOX     -4.7           1/8Q257           0.75          41.0      164      0.7           8/8
           0.32          40.5      162      0.8           8/8
           0.16          39.0      156      0.4           8/8卡达西叮       6             TOX       TOX     -7.7           2/8W-4            3             47.5      190     -0.7           8/8
           1.5           36.5      146      0.0           8/8
           0.75          31.0      124      0.0           8/8对照物                       25.0      100     -0.2           10/10
本发明包括含抑制肿瘤有效量的卡达西叮发色团和药学上可接受的稀释剂或载体结合的组合物。该组合物还可以含有其它的活性抗肿瘤试剂。可以根据所需的给药的路径制成任何合适的药物形式。这种药物形式可以有口服固体组合物形式，如，片剂、胶囊、丸剂、粉剂和粒剂；液体口服组合物形式，如，溶液、悬浮液、糖浆或酏剂；非肠道给药形式有，无菌溶液、悬浮液或乳液；它们亦可被制成无菌固体组合物形式，这种固体可以在使用前迅速溶于无菌水、生理盐水或其它的无菌注射介质中。
对于哺乳动物宿主，这种抗肿瘤试剂的最佳剂量和形式可以很容易地被本领域技术人员确定。当然，应当理解，药物用量要根据具体的制剂、用药途径、病灶部位、宿主类别、被治疗疾病来决定。影响药效的因素有年令、体重、性别、饮食、用药时间、用药方式、排泄速度、患者状况、药物组成、过敏反应、病情等。
本发明可由以下实施例得以说明，但这些实施例并不能限制发明的范围。没有特别说明的情况下，下文的所有溶剂比均为体积比。
实施例1
实验方法：
原料：氯仿、苯、乙酸乙酯和甲醇均为ACS(美国化学学会)无水级溶剂，四氢呋喃为无防腐剂的高压液相色谱级溶剂，这些溶剂都未重新纯化或蒸馏。用于溶剂分配实验中的水为室内去离子水。色谱实验中所使用的水是由去离子水通过Millipore4试剂级系统柱后得到的(10兆欧Milliq水)。乙酸铵是高压液相色谱级试剂。真空液相色谱所用硅胶为默克里克帕(Merck Lichroprep)硅60，粒径25-40微米。水合硫酸铈和四水合钼酸铵(VI)为ACS级试剂。
薄层分析色谱：(TLC)
予涂了的单一硅胶GHLF薄层色谱板(尺寸为10×20厘米，250微米)。样品用2微升的取样器(Microcaps，一次性滴管)取样点板，点样后的板放入以有苯—甲醇(9∶2V/V)平衡的容器中展开，可用短波紫外光和/或硫酸高铈喷洒剂显示各组成色谱结果。
硫酸高铈喷洒剂
硫酸高铈喷洒剂是由6克水合硫酸高铈和28克四水合钼酸铵溶于20％的硫酸水溶液(500毫升)中形成的。喷洒后的薄层色谱板在约150℃下加热5-10分钟显色。
高压液相色谱(HPLC)分析：
高压液相色谱系统的组件如下：Waters公司，M-45型溶剂处理系统；Waters公司，U6K型注射器；Waters公司，Guard-Pak前置柱型(C18柱)；Q-BEX科技公司C18(10微米)柱(3.9毫米内径×30厘米QBX-10230)。组件间由316不锈钢管(1.6毫米外径，0.23毫米内径)连接。洗脱剂的以流为2.0毫升每分钟泵送。检测系统为Hewlett Packard HP-1040A检测器系统。这套系统由Hcwlett Packard二极管检测器、HP-85B型计算机、HP-9121磁盘驱动器和HP-7470绘图仪组成。
卡达西叮发色团的纯化方法见图5。
萃取物A的制备
按照美国专利5001112实施例1—3中的方法，我们可以得到卡达西叮的发酵液，这种发酵液粗品经过滤和阴离子交换色谱后得到美国专利5001112中第13栏34行中所描述的洗脱液，把含部分纯化了的卡达西叮抗菌素洗脱液冷冻干燥后，作为下面萃取步骤中的原料。
由上述的洗脱液冻干制备的部分纯化，冷冻干燥的卡达西叮76克溶于1100毫升水中，在6升的分液漏斗中用等体积的乙酸乙酯萃取四次，收集乙酸乙酯萃取液，在旋转蒸发器中真空蒸发至干燥，得到0.34克残余物A。
残余物A的真空液相色谱：
把12克干硅胶(默克，里克帕，25～40微米)，装入一小的Kontes多孔玻璃过滤漏斗，至四分之三满(漏斗内径2.5厘米×11厘米)。用100毫升苯平衡柱子并真空抽脱出溶剂。残余物A溶解在5毫升3∶1的乙酸乙酯—甲醇溶剂中，并预吸附到3克硅胶上，样品在苯中制成浆状，然后转移至柱上并抽真空，分步梯度洗脱，分别用苯，1％的甲醇的苯溶液，2％，5％，7.5％甲醇的苯溶液各100毫升洗脱三次。色谱检测使用薄层色谱，并用短波长紫外光或硫酸高铈喷洒剂显示。所需物质是在第1个100毫升7.5％的甲醇的苯溶液中洗脱出来的。这部分洗脱液在旋转蒸发器中真空(25℃)蒸发至干燥，可以生成0.2克的卡达西叮发色团。

Claims (1)

1.卡达西叮发色团的生产方法，包括如下步骤：
(a)制备卡达西叮抗肿瘤抗菌素水溶液；
(b)用乙酸乙酯萃取该水溶液；
(c)收集乙酸乙酯萃取液；
(d)把乙酸乙酯萃取液加入硅胶色谱中，用苯一甲醇分步梯度洗脱；
(e)用薄层层析监测，收集含有卡达西叮发色团的馏分；
(f)浓缩所述的馏分以得到所需的卡达西叮发色团。
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