CN1073447A - 卡达西叮抗肿瘤发色团 - Google Patents

Abstract

卡达西叮发色团是一种由卡达西叮抗肿瘤抗菌 素中分离出来的非蛋白发色团，它是通过溶剂萃取和 色谱方法纯化或部分纯化卡达西叮而得到。该发色 团被发现具有卡达西叮的几乎所有抗肿瘤特性。

Description

美国专利5001112中公开了一种叫作卡达西叮（Kedarcidin）的蛋白抗肿瘤抗菌素。据报道，这种抗菌素是由一种单链多肽和一种非蛋白发色团组成的复合物。卡达西叮是由一种链球菌（streptoallotei-chus）中的特别链L585-6（ATCC-53650）发酵得到的，它的分离和纯化已在上述的美国专利的例4中描述。在此专利中既没有公开从卡达西叮抗菌素中分离发色团的方法，也没有提及卡达西叮的抗肿瘤活性应归因于非蛋白发色团。

所谓新制癌菌素的抗肿瘤抗菌素是由1∶1的蛋白和非蛋白发色团复合而成。文献中公开了新制癌菌素的发色团部分可以通过用酸性甲醇溶液萃取新制癌菌素的复合物而得到;新制癌菌素的抗肿瘤特性主要归因于发色团。新制癌菌素中的发色团结构已被确定（可见于J.Antibiotics，1989，42，761-768），然而，对于卡达西叮，用甲醇萃取的方法却不能满意地获得纯发色团。

另外一种叫金霉素的蛋白抗肿瘤抗菌素也由一种蛋白和一种非蛋白发色团组成。这种抗菌素的发色团也是用甲醇萃取抗菌素的方法获得的。（见于Biochem.Biophys.Res.Commun.，1980，94，255-261），并且再次发现了抗肿瘤活性是基于抗菌素中的发色团的。

申请者发现了其它种类的含有非蛋白发色团的蛋白抗肿瘤抗菌素，其发色团既不能成功地运用前述的甲醇萃取法，也不能运用其它的常规纯化方法获得。总之，这种蛋白抗菌素的发色团，即便是能够被分离，同抗菌素复合物相比，它也是很不稳定的。

本发明涉及一种从卡达西叮抗菌素中获得的新型抗肿瘤发色团。

本发明提供了一种制作卡达西叮发色团的方法，其步骤如下：（a）制备卡达西叮水溶液;（b）将该水溶液加入乙酸乙酯有机萃取剂中，（c）收集乙酸乙酯萃取液;（d）将该萃取液加入硅胶色谱柱中，用苯-甲醇分步梯度洗脱;（e）收集含卡达西叮发色团的级分。

本发明的另外一方面是关于抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，它包括向该宿主给予肿瘤抑制量的卡达西叮发色团或其药用组合物。

本发明还提供了一种药用组合物，它由肿瘤抑制量的卡达西叮和药学上可接受的稀释剂或载体组成。

图1是卡达西叮发色团的红外吸收光谱（KBr片）。

图2是卡达西叮发色团溶于甲醇后的紫外吸收光谱。

图3是卡达西叮发色团在DMSO-d6中质子磁共振光谱（500.13MHz）。

图4是卡达西叮发色团在DMSO-d6中的¹³C磁共振光谱（125.76MHz）。

卡达西叮发色团可以按照美国专利5001112从卡达西叮抗肿瘤抗菌素中获得，也可以从制得的卡达西叮发酵液中获得。一种优选的原料是用上述专利实施例4中描述的方法分离和纯化了的卡达西叮，另外一种优选的原料是通过过滤生产卡达西叮的菌株（Streptoallotei-chus）的发酵液得到的。将滤液加入阴离子交换色谱中，先用PH7-8的阳离子缓冲液，再用含NaCl的这种缓冲液洗脱，收集NaCl缓冲液洗脱的溶液。这种色谱方法去除了卡达西叮溶液中的许多杂质而且有很高的卡达西叮发色团收率。本申请者发现在将要进行下述的萃取步骤前把该洗脱液亲水化处理后便于贮存，但实际上，这种洗脱液也可被直接使用。前述的过滤发酵液也可以不经过阴离子交换纯化步骤直接使用，但是要获得纯的发色团则需进一步的纯化，此方法同以纯化的卡达西叮为原料或以阴离子交换部分纯化的发酵液为原料的方法相比，效率要低得多。

然后，将上述方法纯化或部分纯化得到的水溶液加入乙酸乙酯的有机萃取液中。另外的一些有机溶剂，例如，提取新制癌菌素的酸性甲醇、正丁醇、苯-甲醇和氯仿-甲醇却导致发色团降解或形成乳浊液。再将乙酸乙酯萃取液加入硅胶液相色谱柱，用苯-甲醇溶液分步梯度洗脱，甲醇浓度逐渐增大。洗脱液由薄层色谱监控，然后真空浓缩含有纯化了的卡达西叮发色团的洗脱液，以获得浅黄色的无定形产品。

卡达西叮发色团具有以下的物化特性：

外观：浅黄色无定形固体。

稳定性：很不稳定，在苯、甲醇、氯仿和二甲基亚砜（DMSO）等溶液中数小时降解。

分子式：C₅₃H₆₀N₃O₁₆Cl

分子量：1029.3626

质谱：Kratos MS50质谱[M+H]⁺1030，FAB使用间硝基苯乙醇。

红外光谱：Perkin Elmer 1800傅立叶转换红外光谱仪，KBr底片，主要吸收峰（cm^-1）

3432，3076，2976，2832，2188，

1742，1656，1622，1524，1470，

1450，1434，1386，1354，1298，

1240，1192，1164，1114，1080，

1060，1032，1010，980，936，

902，862，824，798，680.

紫外光谱：Hewlett Packard 8452A二极管光谱，λ_max（MeOH）：256，316nm（Logε4.78，4.16）。

高压液相色谱分析：

柱子：Q-BEX  C18（10μ）＃10230

洗脱液：4份四氢呋喃

6份0.2M的乙酸铵

流速：2ml/min

检测波长：254nm

样品浓度：每微升甲醇4微克

保留时间：12分钟。

元素分析：碳，58.78;氢，5.78氮，3.56;氯量试验，正;硫量试验，负。

¹H核磁共振：布鲁克（Bruker）AM-500型光谱仪;

溶剂：DMSO-d6;

观察到的化学位移（相对于DMSO信号的δ2.531）：

1.09（s，3H），1.16（s  br，

6H），1.34（s  br，6H），1.74

（m，2H），1.92（m，1H），2.05

（d，1H，J＝14.3），2.36（m，

1H），2.46（s，6H），2.86（m，

2H），3.21（m，1H），3.78（s，

3H），3.95（s，3H），3.95（m，

1H），4.04（m，1H），4.09（m，

1H），4.12（m，1H），4.27（m，

1H），4.30（m，1H），4.34（m，

1H），4.53（s  br，1H），4.75

（m，1H），4.81  s  br，1H），5.11

（s  br，1H），5.44（s  br  1H），

5.56（m，1H），6.19（s，1H），

6.62（s，1H），6.97（s，1H），

7.11（s，1H），7.22（d，1H，

J＝8.3），8.06（d，1H，J＝8.3），

8.48（s，1H），9.56（d，1H，

J＝7.4）.

¹³C核磁共振：布鲁克AM-500型光谱仪;

溶剂：DMSO-d6;

观察到的化学位移相对于DMSO信号δ

39.113，39.268，39.447，

39.601，39.780，39.935，

40.113）：

序号  PPM  峰裂数:

1  17.13  q

2  18.25  q

3  21.86  q

4  27.19  q

5  36.38  t

6  37.62  t

7  41.64  t

8  44.63  q

9  48.31  d

10  49.94  d

11  60.71  q

12  61.62  q

13  64.05  d

14  64.24  t

15  65.57  d

16  65.96  d

17  68.45  s

18  68.93  d

19  70.11  d

20  71.85  s

21  71.91  d

22  76.22  d

23  78.46  d

24  83.14  d

25  88.16  s

26  94.64  d

27  99.81  d

5  28  99.91  s

29  102.13  d

30  103.96  s

31  109.79  s

32  110.01  d

10  33  115.86  s

34  117.10  s

35  120.06  d

36  122.80  d

37  123.99  d

15  38  129.02  s

39  134.33  s

40  136.22  d

41  139.02  s

42  139.10  d

20  43  141.40  s

44  144.46  s

45  146.28  s

46  148.43  s

47  153.29  s

25  48  155.17  s

49  155.37  s

50  167.24  s

51  169.06  s

薄层色谱：Rf  0.29  苯-甲醇  9∶2

Rf  0.16  苯-甲醇  9∶1

板：硅胶GHLF单一板，0.25毫米厚;

检测：短波长紫外光、二硫酸铈喷洒剂。

鉴于上述物化性质，卡达西叮发色团被确认为：

生物活性

卡达西叮发色团的活性在体外针对数种人的肿瘤细胞系的细胞毒性实验中、在体内针对移植小白鼠P388白血病和B-16黑素瘤细胞中评估。所用的方法及所获结果如下：

Ⅰ.方法：

A.体外细胞毒性实验

用于体外估价细胞毒性效能的细胞系包括：人体克隆腺癌HCT116药敏感系;HCT116/VP35和HCT116/VM46子药抗细胞系，这种抗细胞系包含有低（分子量）的拓扑同分异构酶Ⅱ和较多量的P-170糖蛋白;人卵巢癌A2780药物敏感系和A2780/DDP子药抑制细胞系。据报道A2780/DDP细胞系通过增强DNA修复机制和增加GSH/GST水平来起对抗作用。细胞是在McCoy培养基和10%胎牛血清中培养的。在对数生长期，把细胞转移至96孔微量滴定板，每孔4×10³个细胞，并在95%氧气、5%二氯化碳的气体中，37℃下孵育24小时，以使细胞附着孔壁。在第一排孔中加入系列稀释（4倍稀释）的化合物，再孵育72小时。每孔中活细胞的数量可用目前常用方法计数，即在最终浓度为0.005毫摩尔吩嗪N-甲硫酸盐中加入最终浓度为0.05mg/ml升的四唑鎓盐染色剂（XTT）。室温下孵育3小时，以使颜色变深，用DynatechMR600板计数器在450nm下读数。IC50值（抑制细胞生长50%的药物浓度）用最优密度计数浅性回归计算得到。在分开的96孔板中对角种药剂作用于各种细胞系实验重复三次。

B.小鼠体内模型

1.P388小鼠白血病模型

P388肿瘤在DBA/2小鼠腹水中培养。此肿瘤实验是在CDF′小鼠中经由腹膜内和静脉内在第零天，按照指定路径和计划注入加了一定药剂的1×10⁶个白血病细胞。小鼠在第零天和第五天（或第六天）称重，重量减轻了20%以上的说明了药物毒性。每组实验由6个小鼠及10个未处理小鼠对照组成。配药计划为Q1DX1;1。每天进行死亡检查，并确定平均寿命。药物处理的小鼠同未药物处理的小鼠相对比，寿命延长了25%以上作为药物有活性（%T/C大于125%）的判据。实验的完成大约需要30天。

2.B-16小鼠固体肿瘤模型

B-16小鼠黑素瘤被作为皮下生长瘤在C57BL/6小鼠中培养。实验是在CDF′小鼠中经由大腿骨上部突起处在第零天注入25毫克肿瘤片段。卡达西叮发色团是按Q1DX1;1配药计划下药的。小鼠在第零天和第9天称重。

Ⅱ.结果

A.在体外

如下表所示，卡达西叮发色团对细胞生长的抑制是特别有效的（和VP-16相比，IC50值表示为每毫升化合物的毫微克数，最终浓度）。卡达西叮发色团对两种VP-16敏感细胞系比VP-16的效能要分别高285和1725倍。另外，卡达西叮发色团对HCT116/VP35或HCT116/VM46细胞系和VP-16没有交叉对抗。当评价对A2780和A2780  DDP细胞系的敏感性时，VP-16和卡达西叮发色团对对抗细胞系的效能比对敏感细胞系的效能大约低6.6倍。

B.在体内

1.P388小鼠白血病模型

评估卡达西叮发色团对腹膜内注入的P388小鼠白血病细胞的抑制作用，可知，在注入肿瘤细胞一天后，卡达西叮发色团的优化腹膜注入量为每次1毫克/千克。优化剂量下，卡达西叮发色团产生175的T/C%。在同样的实验中，静脉内注射P388肿瘤细胞，卡达西叮发色团对之也是敏感。的。在肿瘤细胞静脉注入一天后，卡达西叮发色团的优化静脉注入量为每次0.25毫克/千克。在优化剂量下，卡达西叮发色团产生214的T/C%。在此静脉注入实验中，比较不同量的卡达西叮注入后的效果，可知，两个差别很大的卡达西叮注入量，其效能却几乎是相同的。卡达西叮发色团对于P388小鼠白血病的抗肿瘤活性在实验8328中得以证实。在腹膜内注入模型中（依照Q1DX1;1方案），当优化剂量为每次注入0.25毫克/千克时，产生185的T/C%。在本实验的静脉注射部分，按照同样的注射计划，优化剂量为每次0.125毫克/千克时产生186的T/C%。在这个实验中，卡达西叮发色团量虽然差别很大，但效果却相差不多。

在P388小鼠白血病模型中，卡达西叮发色团是有效的。不论是腹膜模型还静脉模型，都被用来评价该化合物的抗肿瘤活性。在P388模型中，卡达西叮发色团同卡达西叮相比具有同样的，或许还更高一些的效能。

2.B-16小鼠固体肿瘤模型

在实验796中，卡达西叮发色团的抗肿瘤活性是用B-16小鼠黑素瘤模型来评价的。当皮下注入肿瘤细胞一天后，静脉注射的卡达西叮发色团的优化剂量为每次0.0062毫克/千克，其T/C%为164。根据寿命判据可知卡达西叮发色团是有活性的。在同样的实验中，应用同样的途径和方案，每次注入优化量为0.75毫克每千克的卡达西叮时，产生同样的T/C%。根据肿瘤寿命判据，卡达西叮和卡达西叮发色团都是具有活性的。

Ⅲ.结论

由腹膜和静脉注入P388小鼠白血病细胞模型和皮下注入B-16小鼠黑素瘤模型，依据寿命判据，卡达西叮发色团显示出了明显的抗肿瘤活性，同卡达西叮相比，卡达西叮发色团具有同样的，甚至更有效的活性。

Ⅳ.参考资料

1.Long，B.H.，Wang，L.，Lorico，A.，Wang，R.C.C.，Brattain，M.G.and  Casazza，A.M.《在获取抑制人体克隆和肺癌细胞系中Etoposide和Teniposide的抑制机理》，Cancer  Research  51;待发表（1991）。

2.Scudiero，D.A.，Shoemaker，R.H.，Paull，K.D.，Monds，A.，Tierney，S.，Nofziger，T.H.，Currens，M.J.，Seniff，D.and  boyd，M.R.《用人和其它的动物肿瘤细胞系，进行一种可溶的四唑/甲簪试验，对细胞和药物敏感性的评估》，Cancer  Research  48：4827-4833（1988）。

实验结果表明，卡达西叮发色团在体外对数种人的肿瘤细胞系展示了强有力的抗肿瘤活性，在体内对小鼠白血病P388和BO-16黑素瘤也具有抗肿瘤活性。

本发明包括含抑制肿瘤有效果的卡达西叮发色团和药学上可接受的稀释剂或载体的组合物。该组合物还可以含有其它的活性抗肿瘤试剂。可以根据一定的路径和方法制成任何合适的药物形式。这种药物形式可以有口服固体组合物形式，如，片剂、胶囊、丸剂、粉剂和粒剂;液体口服物形式，如，溶液、悬浮液、糖浆、酏剂;非口服形式有，无菌溶液、悬浮液或乳液;它们亦可被制成无菌固体组合物形式，这种固体可以在使用前迅速溶于无菌水、生理盐水或其它的无菌注射介质中。

对于哺乳动物宿主，这种抗肿瘤试剂的最佳剂量和摄入量可以很容易地被本领域技术人员确定。当然，应当理解，药物用量要根据具体的制剂、用药途径、病灶部位、宿主类别、疾病形式来决定。影响药效的因素有年令、体重、性别、饮食、用药时间、用药方式、排泄速度、患者状况、药物组成、过敏反应、病情等。

本发明可由以下实施例得以说明，但这些实施例并不能概括发明的范围。没有特别说明的情况下，下文的所有活剂比均为体积比。

实施例1

实验方法：

原料：氯仿、苯、乙酸乙酯和甲醇均为ACS（美国化学学会）无水级溶剂，四氢呋喃为高压液相色谱级溶剂，这些溶剂都未重新纯化或蒸馏。部分实验中溶剂水为室内去离子水。色谱实验中所使用的水是由去离子水通过Millipore4试剂级系统柱后得到的（10兆欧Milliq水）。乙酸铵是高压液相色谱级试剂。真空液相色谱所用硅胶为默克里克帕（Merck  Lichroprep）硅60，粒径25-40微米。水合硫酸铈和四水合钼酸铵（VI）为ACS级试剂。

薄层分析色谱：（TLC）

予涂了单二硅胶GHLF薄层色谱板（尺寸为10×20厘米，250微米）。样品用2微升的取样器取样点板，点样后的板放入盛有苯-甲醇（9∶2  V/V）的容器中展开，可用短波紫外光或硫酸高铈喷洒剂显示各组成色谱结果。

硫酸高铈喷洒剂

硫酸高铈喷洒剂是由6克水合硫酸高铈和28克四水合钼酸铵溶于20%的硫酸水溶液（500毫升）中形成的。喷洒后的薄层色谱板在约150℃下加热5-10分钟。

高压液相色谱（HPLC）分析：

高压液相色谱系统的组件如下：缔合水，M-45型溶剂处理系统;缔合水，V6K型注射器;缔合水，Guard-Pak前置柱模块（C18柱）;Q-BEX科技公司C18（10微米）柱（3.9毫米内径×30厘米QBX-10230）。组件间由316不锈钢管（116毫米外径，0.23毫米内径）连接。洗脱剂的泵速为2.0毫升每分钟。检测系统为Hewlett  Packard  HP-1040A检测系统。这套系统由HewlettPacked二极管检测器、HP-85B型计算机、HP-9121磁盘驱动器和HP-7470绘图仪组成。

卡达西叮发色团的纯化，见图5。

萃取物A的制备

按照美国专利5001112实施例1-3中的方法，我们可以得到卡达西叮的发酵液，这种发酵液粗品经过滤和阴离子交换色谱后得到美国专利5001112中第13段34行中所描述的洗脱液，把含部分纯化了的卡达西叮抗菌素洗脱液冷冻干燥后，作为下面萃取步骤中的原料。

部分纯化，冷冻干燥后的上述卡达西叮76克溶于1100毫升水中，在6升的分液漏斗中用等体积的乙酸乙酯萃取四次，收集乙酸乙酯萃取液，在旋转蒸发器中真空蒸发至干燥，得到0.34克残余物A。

残余物A的真空液相色谱：

把12克干硅胶（默克.里克帕，25～40微米），装入一小的多孔玻璃过滤漏斗，至四分之三满（漏斗内径2.5厘米×11厘米）。用100毫升苯平衡柱子并真空抽脱出溶剂。残余物A溶解在5毫升3∶1的乙酸乙酯-甲醇溶剂中，并预吸附到3克硅胶上，样品在苯中制成浆状，然后转移至柱上并抽真空，分步梯度洗脱，分别用苯，1%的甲醇的苯溶液，2%，5%，7.5%甲醇的苯溶液各100毫升洗脱三次。色谱检测使用薄层色谱，并用短波长紫外光或硫酸高铈喷洒剂显示。所需物质是在100毫升7.5%的甲醇的苯溶液中洗脱出来的。这部分洗脱液在旋转蒸发器中真空（25℃）蒸发至干燥，可以生成0.2克的卡达西叮发生团。

Claims (4)

1、一种称为卡达西叮发色团的抗生素，其特征在于：

(a)外观为淡黄色无定性固体；

(b)质谱得到的分子量为1029；

(c)分子式为C₅₃H₆₀N₃O₁₆Cl；

(d)(溴化钾)汇外吸收光谱如图1所示；

(e)溶于甲醇后的紫外吸收光谱如图2所示；

(f)溶于DMSO-d6中后，质子磁共振如图3所示；

(g)溶于DMSO-d6中后，13C磁共振光谱如图4所示；

(h)硅胶薄层色谱中，当使用的溶剂系统为苯-甲醇(9∶2V/V)时，Rf值为0.29；当溶剂系统为苯-甲醇(9∶1V/V)时，Rf值为0.16；

(i)高压液相色谱保留时间为12分钟，色谱用及C₁₈反相硅胶柱和四氢呋喃-0.2摩尔乙酸铵(2∶3V/V)溶剂系统。

2、一种药用组合物，它包括肿瘤抑制量的卡达西叮发色团和药学上可接受的稀释剂或载体。

3、抑制哺乳动物宿主中的肿瘤生长的方法，它包括给予所述宿主肿瘤抑制有效量的卡达西叮发色团。

4、卡达西叮发色团的生产方法，包括如下步骤：

（a）制备卡达西叮水溶液;

（b）用乙酸乙酯萃取该水溶液;

（c）收集乙酸乙酯萃取相;

（d）把乙酸乙酯萃取液加入硅胶色谱中，用苯-甲醇分步梯度洗脱;

（e）收集卡达西叮发色团的级分。

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