HU211108B

HU211108B - Process to prepare kedarcidine chromophores with antitumor activity

Info

Publication number: HU211108B
Application number: HU9202712A
Authority: HU
Inventors: John E Leet
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1991-09-26
Filing date: 1992-08-19
Publication date: 1995-10-30
Also published as: PL295725A1; CN1032235C; KR930005632A; MX9204765A; US5143906A; AU647300B2; IL102942A0; NO178892B; HUT62908A; AU2080092A; NO178892C; FI923827A; FI923827A0; PL168918B1; NO923260L; RU2067117C1; JPH06179623A; NO923260D0; CN1073447A; CA2075453A1

Description

A találmány tárgya eljárás kedarcidin tumorellenes kromofórok előállítására.

A kedarcidin nevű protein típusú tumorellenes antibiotikumot az 5 001 112 számú USA-beli szabadalmi leírás és a J. Antibiot. (1991), 44(5), 472-478. cikke ismerteti. Az ebben foglaltak szerint ez az antibiotikum egy egyláncú polipeptid és egy nem-fehérje jellegű kromofór vegyület komplexe.

A kedarcidin antibiotikumot a Streptoalloteichus sp. nov. L585-6 (ATCC 53 650) törzzsel végzett fermentációval állítják elő; a kedarcidin elkülönítését és tisztítását az említett amerikai szabadalmi leírás 4. példája írja le.

Ez a szabadalmi leírás azonban nem tartalmaz és nem javasol semmiféle eljárást a kromofór vegyületnek az elkülönített kedarcidin antibiotikumból való kiválasztására és nem szolgáltat olyan információt, hogy a kedarcidin tumorellenes aktivitását a nemfehérje jellegű kromofór hordozza.

A neokarcinosztatin nevű tumorellenes antibiotikum egy fehérje és egy nemfehérje kromofór 1:1 arányú komplexe. Az irodalomból ismert, hogy a neokarcinosztatin kromofór maradéka a neokarcinosztatin komplexből savas metanollal végzett extrakcióval választható ki és hogy a neokarcinosztatin tumorellenes tulajdonságaiért főként a kromofór felelős. A neokarcinosztatin esetében meghatározták a kromofór szerkezetét (1. pl.: J. Antibiotics 1989, 42, p. 761-768). A keracidin esetében azonban a metanolos extrakciós eljárás nem volt megfelelő a tisztított kromofór előállítására.

Egy másik fehérjetípusú tumorellenes antibiotikum, az aureomicin szintén tartalmaz egy fehérje-komponenst és egy nemfehérje kromofórt. Ennek az antibiotikumnak a kromofór részét ugyancsak metanolos extrakcióval nyerték ki az antibiotikumból (Biochem. Biophys. Rés. Commun. 1980, 94, p. 256-261) és megállapították, hogy a tumorellenes aktivitás ebben az esetben is főként a kromofórban található meg.

Ismeretesek más, nemfehérje kromofórt tartalmazó fehérjetípusú tumorellenes antibiotikumok is, amelyek esetében a kromofór nem volt sikeresen elkülöníthető az antibiotikumból sem az előbbiekben említett extrakciós eljárással, sem más szokásos tisztítási eljárással. Az ilyen fehérjejellegű antibiotikumok kromofór komponense - még abban az esetben is, ha elválasztható és elkülöníthető - általában sokkal labilisabb, mint maga az antibiotikum komplexe.

A találmány tárgya eljárás a kedarcidin kromofór előállítására, amely a következő lépésekből áll:

(a) vizes oldatot készítünk a kedarcidinból, (b) ezt a vizes oldatot etil-acetáttal extraháljuk, (c) az etil-acetátos kivonatokat összegyűjtjük, (d) szilikagél oszlopkromatográfiának vetjük alá benzol/metanol eleggyel végezve a lépcsős grádiens elúciót és (e) összegyűjtjük a kedarcidin kromofórt tartalmazó frakciókat.

Az l.ábra a kedarcidin kromofór IR abszorpciós spektrumát (KBr pellet) mutatja be.

A 2. ábra a kedarcidin kromofór metanolos oldatának UV abszorpciós spektrumát mutatja be.

A 3. ábra a kedarcidin kromofór DMSO-dg-ban felvett protomágneses rezonancia spektruma (500,13 MHz) látható.

A 4. ábra a kedarcidin kromofór DMSO-d₆-ban (125,76 MHz) felvett ¹³C mágneses rezonancia spektrumát ábrázolja.

A kedarcidin kromofór az 5 001 112 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint izolált tumorellenes kedarcidin antibiotikumból vagy a kedarcidin előállításához felhasznált fermentléből nyerhető ki. Az egyik kitüntetett kiindulási anyag az említett szabadalmi leírás 4. példájában leírt módon elkülönített és tisztított kedarcidin. Egy másik kitüntetett kiindulási anyaghoz úgy jutunk, hogy a fermentlevet, amelyben a Streptoalloteichus kedarcidintermelő törzsét tenyésztettük, szűrtük, a szűrletet kromatográfiának vetjük alá, eluálószerként pH 7-8 kationcserélő puffért, majd ugyanilyen, NaCI-ot tartalmazó puffért alkalmazva és összegyűjtjük a NaCl-os pufferrel eluált frakciót.

Az ilyen kromatográfiás eljárással kapott eluátum mentes számos, már eltávolított szennyezéstől és ennek eredményeként magasabb kitermeléssel juthatunk a keresett kedarcidin kromofórhoz.

Célszerűen úgy járunk el, hogy ezt az eluátumot tárolás céljából az előbbiekben leírt extrakciós lépés előtt liofilizáljuk, de a vizes eluátum közvetlenül is felhasználható. A találmány szerinti eljárásban a szűrt fermentlé az anioncserélós tisztítási lépés nélkül is alkalmazható, de ebben az esetben további tisztítási lépésekre van szükség a kromofór előállításához. Ez a megoldás sokkal kevésbé hatékony, mint az a módszer, amely szerint tisztított kedarcidinből vagy részlegesen tisztított (az anioncserének alávetett) fermentléből indulunk ki.

Az előbbiekben leírt módon tisztított vagy részlegesen tisztított kedarcidin vizes oldatát ezután szerves extrakcióval, etil-acetáttal kezeljük. Más szerves oldószerek, pl. a savas metanol (amelyet a neokarcinosztatin kromofór előállításához alkalmaznak), az n-butanol, benzol/metanol elegy és kloroform/metanol elegy bomlást vagy emulzióképződést eredményez. Az etil-acetátos kivonatot ezután szilikagél folyadék-kromatográfiának vetjük alá, eluálószerként - lépcsős grádiens elúció keretében - növekvő koncentrációban metanolt tartalmazó benzolt alkalmazva. A frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) követjük. A keresett frakciót, amely a tisztított kedarcidin kromofórt tartalmazza, vákuumban betöményíthetjük és így a terméket bamássárga színű amorf szilárd anyag alakjában kapjuk.

A találmány szerint előállított kedarcidin kromofór fizikokémiai tulajdonságai

A kedarcidin kromofór a következő fizikokémiai tulajdonságokkal rendelkezik:

Megjelenés:barnássárga színű amorf szilárd anyag.

Stabilitás: nagyob labilis. Benzolos, metanolos, kloroformos és dimetil-szulfoxiddal (DMSO) készített oldatban órákon belül elbomlik.

HU 211 108 Β

Összegképlet: C₅₃H_é0N₃O₁₆Cl

Molekulatömeg: 1029 · 3628

Tómegspektrum: Kratos MS50 tömegspektrométer (M + H)⁺ 1030, FAB, m-nitro-benzilalkohol felhasználásával

IR-spektrum: Perkin Elmer 1800 Fourier Transform IR spektrométer KBr pellet

Jelentősebb IR sávok (cm¹):

3432, 3076, 2976, 2832, 2188, 1742, 1656, 1622, 1524, 1470, 1450, 1434, 1386, 1354, 1298, 1240, 1192, 1164, 1114, 1080, 1060, 1032, 1010, 980, 936, 902, 862, 824, 798, 680

UV spektrum: Hewlett Packard 8452A Diódé Array spektrofotométer lamdban,^ (MeOH): 256, 316 nm loge 4,78; 4,16

Analitikai HPLC:

oszlop: Q-BEXC18 (10μ) 10230 eluálószer: 4 rész tetrahidrofurán, 6 rész 0,2 M ammónium-acetát áramlási sebesség: 2 ml/perc detektor: 254 nm a minta koncentrációja: 4 pg/μΙ metanol retenciós idő: 12 perc

Elemanalízis:

talált: C 58,78 H 5,78 N 3,56 kvalitatív Cl-próba: pozitív kvalitatív S-próba: negatív 'Η-NMR: Bruker AM-500 spektrométer; oldószer

DMSO-d₆ megfigyelt kémiai eltolódás értékek (a δ

2,531 DMSO szignálhoz viszonyítva):

1,09 (s, 3H), 1,16 (széles s, 6H), 1,34 (széles s, 6H),

1.74 (m, 2H), 1,92 (m, 1H), 2,05 (d, 1H, J = 14,3),

2,36 (m, 1H), 2,46 (s, 6H), 2,86 (m, 2H), 3,21 (m,

1H), 3,78 (s, 3H), 3,95 (s, 2H), 3,95 (m, 1H), 4,04 (m, 1H), 4,09 (m, 1H), 4,12 (m, 1H), 4,27 (m, 1H),

4,30 (m, 1H), 4,34 (m, 1H), 4,53 (széles s, 1H),

4.75 (m, 1H), 4,81 (széles s, 1H), 5,11 (széles s,

1H), 5,44 (széles s, 1H), 5,56 (m, 1H), 6,19 (s, 1H),

6,62 (s, 1H), 6,97 (s, 1H), 7,11 (s, 1H), 7,22 (d, 1H,

J = 8,3), 8,06 (d, 1H, J = 8,3), 8,48 (s, 1H), 9,56 (d,

1H,J = 7,4) ¹³C-NMR: Bruker AM-500 spektrométer oldószer: DMSO-d₆ megfigyelt kémiai eltolódások (a DMSO következő szignáljaihoz viszonyítva: δ 39 113; 39 268; 39 447; 39 601; 39 780; 39 935; 40 113):

Szignál	PPM	Multiplicitás
1	17,13	q
2	18,25	q
3	21,86	q
4	27,19	q
5	36,38	t
6	37,62	t
7	41,64	t

Szignál	PPM	Multiplicitás
8	44,63	q
9	48,31	d
10	49,94	d
11	60,71	q
12	61,62	q
13	64,05	d
14	64,24	t
15	65,57	d
16	65,96	d
17	68,45	s
18	68,93	d
19	70,11	d
20	71,85	s
21	71,91	d
22	76,22	d
23	78,46	d
24	83,14	d
25	88,16	s
26	94,64	d
27	99,81	d
28	99,91	s
29	102,13	d
30	103,96	s
31	109,79	s
32	110,01	d
33	115,86	s
34	117,10	s
35	120,06	d
36	122,80	d
37	123,99	d
38	129,02	s
39	134,33	s
40	136,22	d
41	139,02	s
42	139,10	d
43	141,40	s
44	144,46	s
45	146,28	s
46	148,43	s
47	153,29	s
48	155,17	s
49	155,37	s
50	167,24	s
51	169,06	&

HU 211 108 Β

Vékonyréteg-kromatográfia:

R_f 0,29 benzol:metanol 9:2

R_f 0,16 benzobmetanol 9:2

Lemez: Uniplate Silica Gél GHLF (Analtech), vastagság 0,25 mm

Kimutatás: rövid hullámhosszúság UV fény; cérium-szulfát reagens (spray)

Az előbbiekben leírt fizikokémiai jellemzők alapján a kedarcidin kromofór szerkezete feltevésünk szerint az (I) képletnek felel meg.

Biológiai aktivitás

A kedarcidin kromofór tumorellenes aktivitását in vitro többféle humán daganatsejtvonallal és in vivő transzplantálható egér P388 leukémiával és B-16 melanómával végzett citotoxicitási vizsgálattal határoztuk meg. Az alkalmazott módszereket és a kapott eredményeket a következőkben mutatjuk be.

/. Módszerek

A. In vitro citotoxicitási vizsgálat

Az in vitro citotoxikus hatékonyság értékeléséhez felhasznált sejtvonalak a következők:

- humán vastagbél adenokarcinóma HCTU6 (gyógyszerre érzékeny) sejtvonal és a

- HCT116/VP35 és HCT116/VM46 (gyógyszerrezisztens) leánysejtvonal. alacsony topoizomeráz II és magas P-170 glukoprotein szintekkel (Β. H. Long et al.: Mechanisms of resistance to Etoposide and Teniposide in acquired resistant humán colon and lung carcinoma cell lines, Cancer Rés. 51, 1991), valamint

- a humán petefészekkarcinóma A2780 gyógyszerérzékeny sejtvonal és az A22 780/DDP gyógyszer-rezisztens leánysejtvonal.

Az A278O/DDT sejtvonalról azt írják, hogy a rezisztencia oka a fokozott DNA-regenerálódási mechanizmus és a magas GSH/GST szintek.

A sejteket 10% borjúembrió szérumot tartalmazó McCoy táptalajban tenyésztjük. A logaritmikus fázisnak megfelelő növekedési szakaszban 96 helyes mikrotitráló lemezen 4xl0³/lyuk mennyiségben szélesztjük a sejteket és a tenyészeteket 37 °C-on 24 órán át 95% O₂/5% CO₂ atmoszférában inkubáljuk, a sejtek tapadásának elősegítésére. A vegyületeket sorozatban hígítjuk (négyszeres hígítás), a felső lyuksorba adagoljuk és a tenyészeteket további 72 órán át inkubáljuk. Az életképes sejtek számát az egyes üregekben kvantitatíve meghatározzuk (a D. A. Scudiero et al.: Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay fór cell growth and drug sensivity in culture using humán other tumor cell lines, Cancer Rés. 48, p. 4827-4833, 1988) oly módon, hogy 0,05 mg/ml végkoncentrációban tetrazólium-festéket (XTT) adagolunk 0,005 mM (végkoncentráció) fenazim-metoszulfát jelenlétében. A tenyészeteket szobahőmérsékleten 3 órán át inkubáljuk a szín kialakulása elősegítésére, majd Dynatech MR600 lemezleolvasó segítségével

450 nm-en mérjük az optikai sűrűség értékeket. Az IC50 (a sejtnövekedést 50%-ban gátló hatóanyag koncentráció) értékeket az optikai sűrűség leolvasott értékeinek regressziós elemzésével számoljuk ki. Mindegyik hatóanyag esetében mindegyik vizsgált sejtvonallal 3 párhuzamos meghatározást végzünk 96 helyes lemezeken.

B. in vivő egér modellek

1. P388 egér leukémia modellek

A P388 tumort ascitesz alakban DBA/2 egérben tartjuk fenn. A kísérleti tumor modellekben CDF egereket használtunk fel (Long et al., Cancer Rés. 51, 1991), amelyekbe a 0. napon intraperitoneálisan vagy intravénásán lxlO⁶ leukémia sejtet vittünk be és a hatóanyagokat a következőkben jelzett úton és rendszer szerint adagoltuk. Az egereket lemértük a 0. napon, majd az 5. vagy 6. napon. 20%-os vagy ennél nagyobb tömeg-veszteséget a gyógyszer toxikus voltát jelző ténynek tekintettünk. Az egyes adagoknak megfelelő csoportok 6 egeret tartalmaztak, míg a kezeletlen kontroll csoportban 10 egér volt. Az adagolási menetrend: Q1DX1; 1. Naponta meghatároztuk az elhullást és kiszámítottuk az egyes csoportok átlagos élettartamát. Az aktivitás kritériumaként a gyógyszerrel kezelt csoportnak a kezeletlen kontroll csoporthoz viszonyítva 25%-os vagy ennél magasabb növekedését fogadtuk el (%T/C nagyobb, mint 125%). A kísérleteket kb. a 30. napon fejeztük be.

2. B-16 egér szilárd tumor modell

A B-16 egér melanómát szubkután növekvő tumorként tartottuk fenn C57BL/6 egérben. A kísérleti tumor modellekben BDF egereket használtunk fel (Long et al., Cancer Rés. 51, 1991), amelyekbe a 0. napon szubkután, trokár segítségével 25 mg-os tumor fragmentumot ültettünk be. A kedarcidin kromofórt iv adagoltuk, Q1DX1; 1 menetrend szerint. Az egereket a 0. és a 9. napon mértük le.

//. Erdemények

A. In vitro

Mint ez a következő táblázatból látható, a kedarcidin kromofór rendkívül hatásos - a VP-16-hoz (etopozid) viszonyítva - a sejtnövekedés gátlására irányuló képessége tekintetében (nanogramm vegyület/ml végkoncentráció alakban kifejezett IC₅₀ értékek). A kedarcidin kromofór a két VP-16 érzékeny sejtvonal esetében 285-ször, illetőleg 1725-ször hatásosabb, mint a VP-16. A kedarcidin kromofór ezenkívül nem mutat keresztrezisztenciát a VP-16-tal a HCT116/VP36 vagy a HCT116/VM46 sejtvonal esetében. Az A278O érzékeny és az A278O/DDP sejtvonal esetében az értékelés arra mutat, hogy a VP-16 és a kedarcidin kromofór egyaránt kb. 6,6-szer kevésbé hatásos a rezisztens sejtvonal vonatkozásában, az érzékeny sejtvonalhoz képest.

HU 211 108 Β

A kedarcidin kromofór in vitro citotoxititása

IC₅₀ (ng/ml)

Sejvonal	Vegyület
kedarcidin kromofór	VP-16^a (etopozid)
HCT116	0,4	690
HCTU6/VP35	0,3	8758
HCT116/VM46	0,3	3255
A2780	0,2	57
A2780/DDP	1,3	379

^a A VP-16 énékek legalább 6 kísérlet három párhuzamosban 15 végzett meghatározásainak átlagénékei

B. ín vivő

1. P388 egér leukémia modell

Ip (implantált) P388 egér leukémia ellen értékelve a 20 kedarcidin kromofór 1 nappal a tumor beültetése után ip 1 mg/kg/inj. optimális dózisban való bevitel esetén T/C (%) = 175 értéket eredményez.

Ugyanebben a kísérletben az iv implantált P388 tumorsejtek a kedarcidin kromofór tumorellenes hatá- 25 saira is érzékenyek voltak. 1 nappal a tumor beültetése után iv adagolva a kedarcidin kromofór 0,25 mg/kg/inj. optimális dózisban T/C (%) = 214 értéket eredményez.

Két különböző sarzsból származó kedarcidin ebben a kísérletben ugyancsak hatásos, bár valamivel kevésbé, 30 mint a kedarcidin kromofór.

A kedarcidin kromofór tumorellenes aküvitását a P388 egér leukémia ellen a 8328. sz. kísérletben igazoltuk. Az ip implantált modellben az ip, Q1DX1; 1 séma szerint adagolt kedarcidin kromofór 35 0,25 mg/kg/inj. optimális dózisban T/C (%) = 185 értéket eredményez.

Ebben a kísérletben az iv implantált modell esetében a kedarcidin kromofór 0,125 mg/kg/inj. optimális dózisban T/C (%) = 186 értéket szolgáltat az előbbi séma szerint iv beadagolva. Két különböző sarzsból származó kedarcidin ugyancsak hatásos ebben a kísérletben, bár valamivel kevésbé, mint a kedarcidin kromofór.

A P388 egér leukémia modellekben a kedarcidin kromofór attól függetlenül hatásos és potens, hogy a tumorellenes hatás értékelésére az ip, ip vagy az iv, iv modellt alkalmazzuk. A P388 modellben a kedarcidin kromofór ugyanolyan hatásos, kissé magasabb potencia mellett, mint a kedarcidin.

2. B-l6 Egér szilárd tumor modell

A 796. sz. kísérletben a kedarcidin kromofór tumorellenes aktivitását a B-l6 egér melanóma modell alkalmazása mellett értékeltük. A tumor szubkután beültetése esetén a kedarcidin kromofór 1 nappal a tumor beültetése után iv, 0,062 mg/kg/inj. optimális dózisban alkalmazva az élettartam kritérium alapján T/C (%) = 164 érték mellett aktív. Ugyanebben a kísérletben a kedarcidin ugyanezt a T/C értéket 0,75 mg/kg/inj. optimális dózisban eredményezi, azonos beviteli utat és menetrendet alkalmazva. A tumornövekedés késleltetési kritérium alapján sem a kedarcidin kromofór, sem a kedarcidin nem aktív.

///. Következmények

A kedarcidin kromofór az élettartam megnyújtási kritérium alapján jelentős tumorellenes aktivitást mutat az ip vagy iv implantált P388 egér leukémia modellben és az se implantált B-l6 egér melanóma modellben. Ezekben a kísérletekben a közvetlen összehasonlítás alapján megállapítható volt, hogy olyan aktív, és valamivel potensebb, mint a kedarcidin.

A vizsgált eredmények arra mutatnak, hogy a kedarcidin kromofór erőteljes in vitro tumorellenes aktivitást mutat több humán tumor sejtvonallal szemben, és in vitro tumorellenes aktivitást fejt ki a P388 egér leukémia és a B16 melanóma vonatkozásában.

Tumorellenes hatás ip implantált P388 leukémia sejtekkel szemben (8305. sz. kísérlet)

Hatóanyag	mg/kg/dózis vagy hígítás	átl. túlélési idő, nap	T/C%	átl. tömegvált., g	élő szám, 5. nap
mitomicin C	4,8	23,0	230	-0,7	6/6
	3,2	20,0	200	-0,5	6/6
kedarcidin 26 59648-1 sarzsszám	1,6	18,5	185	-1,3	6/6
	0,8	17,0	170	-0,9	6/6
	0,4	16,0	160	-0,8	6/6
	0,2	15,0	150	-0,0	6/6
	0,1	14,0	140	0,3	6/6
	0,05	13,5	135	0,8	6/6
kedarcidin 29 19085-1 sarzsszám	1,6	17,5	175	-0,9	6/6
	0,8	17,5	175	-0,3	6/6
	0,4	15,0	150	0,2	6/6

HU 211 108 Β

Hatóanyag	mg/kg/dózis vagy hígítás	átl. túlélési idő, nap	T/C%	átl. tömegvált., g	élő szám, 5. nap
	0,2	14,0	140	0,3	6/6
	0,1	13,5	135	0,5	6/6
	0,05	14,0	140	1,4	6/6
kedarcidin kromofór	4	9,0	90	-3,6	6/6
	2	10,5	105	-2,2	6/6
	1	17,5	175	-0,3	6/6
	0,5	16,5	165	-0,5	6/6
	0,25	15,0	150	-0,4	6/6
	0,125	14,5	145	0,1	6/6
kontroll		10,0	100	2,5	10/10

Tumorellenes aktivitás iv implantált P388 leukémia sejtekkel szemben (8305. sz. kísérlet)

Hatóanyag	mg/kg/dózis vagy hígítás	átl. túlélési idő, nap	T/C%	átl. tömegvált., g	élő egerek száma az 5. napon
mitomicin C	4,8	13,5	193	-0,8	6/6
	3,2	11,0	157	0,5	6/6
	1,6	10,0	143	-0,3	6/6
	0,8	8,0	114	0,4	6/6
kedarcidin 26 59648-1 sarzsszám	1,6	6,5	93	-6,0	6/6
	0,8	12,5	179	-3,0	6/6
	0,4	11,0	157	-0,0	6/6
	0,2	9,0	129	0,5	6/6
	0,1	8,0	114	-0,3	6/6
	0,05	7,0	100	-0,5	6/6
kedarcidin 29 19085-1 sarzsszám	1,6	7,0	100	-4,8	6/6
	0,8	13,0	186	-2,0	6/6
	0,4	11,0	157	-0,3	6/6
	0,2	9,0	129	-0,0	6/6
	0,1	8,5	121	-2,2	6/6
	0,05	7,5	107	-0,0	6/6
kedarcidin kromofór	4	TOX	TOX	-	0/6
	2	TOX	TOX	-	0/6
	1	TOX	TOX	-	0/6
	0,5	7,5	107	-2,9	6/6
	0,25	15,0	214	-0,8	6/6
	0,125	13,0	186	-0,3	6/6
kontroll !		7,0	100	-0,1	10/10

HU 211 108 Β

Tumorellenes aktivitás ip implantált P388 leukémia sejtekkel szemben (8328. sz. kísérlet)

Hatóanyag	mg/kg/dózis vagy hígítás	átl. túlélési idő, nap	T/C%	átl. tömegvált., g	élő egerek száma az 5. napon
mitomicin C	4,8	20,0	200	-0,5	6/6
	3,2	19,0	190	-0,8	6/6
kedarcidin kromofór	2,0	TOX	TOX	-1,9	2/6
	1,0	9,0	90	-2,3	6/6
	0,5	13,0	130	-1,1	6/6
	0,25	18,5	185	-0,4	6/6
kedarcidin Q257	2,0	22,0	220	-1,1	6/6
	1,0	21,0	210	-0,8	5/6
	0,5	15,5	155	-0,5	6/6
	0,25	17,0	170	-1,0	6/6
kedarcidin W-4	8,0	18,0	180	-1,4	6/6
	4,0	18,0	180	-1,3	6/6
	2,0	17,5	175	-0,8	6/6
	1,0	16,0	160	-1,0	6/6
	0,5	14,5	145	-0,9	6/6
	0,25	14,5	145	-0,3	6/6
kontroll		10,0	100	0,8	10/10

Tumorellenes hatás iv implantált P388 leukémia sejtekkel szemben (8328. sz. kísérlet)

Hatóanyag	mg/kg/dózis vagy hígítás	átl. túlélési idő, nap	T/C%	átl. tömegvált., g	élő egerek száma az 5. napon
mitomicin C	3,2	10,0	143	-0,7	6/6
	1,6	9,0	129	-0,1	6/6
kedarcidin kromofór	1,0	TOX	TOX	-	0/6
	0,5	TOX	TOX		0/6
	0,25	7,0	100	-2,4	6/6
	0,125	13,0	186	-2,5	6/6
kedarcidin Q257	2,0	7,0	100	-5,6	6/6
	1,0	9,5	136	-4,7	6/6
	0,5	13,0	186	-1,7	6/6
	0,25	9,0	129	-0,7	6/6
kedarcidin W-4	8,0	7,0	100	-5,4	6/6
	4,0	11,5	164	-3,6	6/6
	2,0	11,5	164	-0,9	6/6
	1,0	9,0	129	-0,9	6/6
	0,5	8,0	114	-0,0	6/6
	0,25	7,0	100	-0,1	6/6
kontroll		7,0	100	-0,5	10/10

HU 211 108 Β

Tumorellenes aktivitás se implantált B16 melanómával szemben (796. sz. kísérlet)

Hatóanyag	mg/kg/dózis vagy hígítás	átl. túlélési idő, nap	T/C%	átl. tömegvált., g	élő egerek száma az 5. napon
kedarcidin kromofór	0,5	TOX	TOX	-	0/8
	0,25	TOX	TOX	-1,0	2/8
	0,125	31,5	126	1,1	8/8
	0,062	41,0	164	Li	8/8
kedarcidin Q257	1,5	TOX	TOX	-4,7	1/8
	0,75	41,0	164	0,7	8/8
	0,32	40,5	162	0,8	8/8
	0,16	39,0	156	0,4	8/8
kedarcidin W-4	6	TOX	TOX	-7,7	2/8
	3	47,5	190	-0,7	8/8
	1,5	36,5	146	0,0	8/8
	0,75	31,0	124	0,0	8/8
kontroll		25,0	100	-0,2	10/10

A találmány szerinti kedarcidin kromofór olyan gyógyszerkészítmények előállítására alkalmazható, amelyek a kedarcidin kromofórt a tumorgátlás szempontjából hatásos mennyiségben tartalmazzák, gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal vagy hígítóval összekeverve. Ezek a készítmények más tumorellenes hatóanyagokat is tartalmazhatnak és bármely gyógyszerészeti alakban kikészíthetők, amely a választott beviteli módnak megfelel. Példák az ilyen készítményekre: orális alkalmazásra szolgáló szilárd készítmények, mint tabletta, kapszula, pirula, por vagy granulátum; orális adagolásra szolgáló folyékony készítmények, így oldatok, szuszpenziók, szirupok vagy elixírek és parenterális bevitelre szolgáló készítmények, így steril oldatok, szuszpenziók vagy emulziók. A hatóanyagok kikészíthetők steril szilárd készítmények alakjában is, amelyek steril vízben, fiziológiás sóoldatban vagy valamely más steril, injektálható közegben közvetlenül a felhasználás előtt oldhatók.

Tumorellenes szerként való alkalmazás esetén egy adott emlős gazdaszervezet vonatkozásában az optimális dózis és az adagolási mód a szakember által könnyen meghatározható. Magától értetődik természetesen, hogy az alkalmazott tényleges dózis változik a készítmény konkrét kikészítési alakja, a beviteli mód és az adott állapot, szervezet és betegség függvényében. A gyógyszer hatását megváltoztató több olyan tényezőt is figyelembe kell venni, mint a kor, testtömeg, nem, étrend, a bevitel időpontja, adagolási mód, a kiválasztás sebessége, a beteg állapota, gyógyszerkeverékek, érzékenységi reakciók és a betegség súlyossága.

A találmányt a következő példával szemléltetjük, amely nem tekinthető korlátozónak a találmány oltalmi köre vonatkozásában. Hacsak másként nem jelezzük, minden oldószerarány térfogat/térfogat dimenzióban értendő.

1. példa

Általános módszerek:

Anyagok:

Vízmentes, ÁCS minőségű oldószerként kloroformot, benzolt, etil-acetátot és metanolt alkalmaztunk. A HPLC-hez oldószerként tartósítószertől mentes tetrahidrofuránt vettünk. Ezeket az oldószerelet felhasználás előtt nem tisztítottuk vagy desztilláltuk. Az oldószer és a víz közötti megosztást szemléltető kísérletekben házilagosan ionmentesített vizet alkalmaztunk. A kromatográfiás vizsgálatok kapcsán említett víz házilagosan ionmentesített, Millipore 4, reagens minőségű vizet előállító oszloprendszeren átvezetett (10 megaohm MilliQ) víz. Az ammónium-acetát HPLC reagens minőségű. A vákuum-folyadékkromatográfiához Merck LiChroprep Sí 60 szilikagélt használtunk, részecskenagyság 25—40 pm. A cérium-szulfát-hidrát és az ammónium-molibdát-(VI)-tetrahidrát ÁCS minőségű reagens.

Analitikai vékonyrétegkromatográfia (TLC):

Uniplate Silica Gél GHLF, előre bevont vékonyrétegkromatográfiás lemezeket alkalmazunk (10 x 20 cm, 250 mikron). A frakciókat 2 mikroliteres Microcap-ok (eldobható pipetták) segítségével visszük fel; a lemezeket 9:2 térf./térf. benzol/metanol eleggyel, előhívható tankban fejlesztjük ki. A kapott kromatogram komponenseit rövid hullámhosszúságú UV fény és/vagy cérium-szulfát reagenssel végzett bepermetezés segítségével tesszük láthatóvá.

Cérium-szulfát permetező reagens:

A vékonyrétegkromatografáláshoz a cérium-szulfát permetező reagenst úgy állítjuk elő, hogy 6 g cériumszulfát-hidrátot és 28 g ammónium-molibdát-(VI)-tetrahidrátot 500 ml 20%-os vizes kénsavban oldunk. A bepermetezetl TLC-lemezeket kb. 150 °C-on 5-10 percen át végzett hevítéssel hívjuk elő.

HU 211 108 B

Analitikai HPLC:

A következő komponenseket használjuk fel egy analitikai HPLC-rendszer létrehozására:

- Waters Associates, M-45 oldószerszállító rendszer

- Waters Associates U6K injektor

- Waters Associates Guard-Pak előoszlop Cl8 töltettel

- Q-BEX Scientific Inc., Cl8 (10 mikron) oszlop (belső átmérő, 3,9 mmx30 cm, QBX-10 230).

A komponenseket 316 saválló acél csövekkel (1,6 mm külső átmérő - 0,23 mm belső átmérő) kötjük össze. A kiválasztott oldószert 2,0 ml/perc áramlási sebességgel szivattyúzzuk be. A kimutatást Hewlett Packard HP-1040A detektorrendszerrel végezzük. Ennek a rendszernek a részei:

- Hewlett Packard HP-1040A diódarendszer detektor

- HP-85B számítógép

- HP-9121 lemezmeghajtó és

- HP-7470 kiértékelő.

Az A. kivonat előállítása

A kedarcidin permetlevet az 5 001 112 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 1-3. példája szerinti általános eljárásoknak megfelelően állítjuk elő. A nyers fermentlevet szűrjük, majd anioncserélő kromatográfiának vetjük alá az említett szabadalmi leírás 13. oszlopa 34. során szereplő eluátum előállítására. Ezt a részlegesen tisztított kedarcidin antibiotikumot tartalmazó eluátumot alkalmazzuk - liofilizálás után a következő extrakciós lépés kiindulási anyagaként.

g részlegesen tisztított, liofilizált kedarcidint amelyet az előbbi eluátum liofilizálásával kaptunk 1100 ml vízben oldunk. A vizes kivonatot négyszer extraháljuk azonos térfogatú etil-acetát alkalmazásával, 6 literes választótölcsér segítségével. Az etil-acetátos kivonatokat összeöntjük, és vákuumban, forgó bepárlóban szárazra pároljuk. így 0,34 g A. maradékot kapunk.

Az A. maradék vákuum-folyadékkromatográfiája:

Egy kisméretű Kontes zsugorított szűrő-tölcsért (belső átmérő 2,5 cmxll cm) háromnegyedrészben megtöltünk száraz szilikagéllel (Merck LiChroprep 25-40 pm, 12 g). Az oszlopot 100 ml benzollal kiegyensúlyozzuk, az oldószer eluálására vákuumot alkalmazva. Az A. maradékot 3:1 (5 ml) etil-acetát/metanol elegyben oldjuk és 3 g szilikagélre adszorbeáltatjuk. A mintát benzolban szuszpendáljuk, felvisszük az oszlopra és vákuumot alkalmazunk. Lépcsős grádiens segítségével végezzük az eluálást, a következők szerint benzol; 1% metanolt tartalmazó benzol; 2%, 5% és 7,5% metanolt tartalmazó benzol (3x100-100 ml). A kromatogramot TCL segítségével értékeljük ki, az előhíváshoz rövid hullámhosszúságú UV fényt és cériumszulfát permetező reagenst alkalmazva. A keresett anyagot a 7,5% metanolt tartalmazó benzol első 100 ml-ével eluáljuk. Ezt a frakciót vákuumban (25 ’C), forgó bepárlóban szárazra pároljuk. így 0,2 g kedarcidin kromofórt kapunk.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONT

Eljárás kedarcidin kromofór antibiotikum előállítására, mely a következő tulajdonságokkal rendelkezik:

a) barnássárga amorf, szilárd anyag,

b) molekulatömege tömegspektroszkópiával meghatározva 1029,

c) molekulaképlete CjjH^jNjO^CI,

d) IR abszorpciós spektruma (KBr) az 1. ábrának felel meg,

e) UV abszorpciós spektruma metanolos oldatban a 2. ábrának felel meg,

f) DMSO-d₆-ban oldva a 3. ábra szerinti proton mágneses rezonancia spektrumot mutatja,

g) DMSO-d₆-ban oldva a 4. ábra szerinti ¹³C mágneses rezonancia spektrumot adja,

h) szilikagél vékonyréteg-kromatográfiával R_rértéke 0,29 9:2 (térf./térf.) benzol .metanol eleggyel és 0,16 9:1 (térf./térf.) benzol:metanol eleggyel, és

i) nagyteljesítményű folyadék-kromatográfiás retenciós ideje 12 C_i8 fordított fázisú szilikagél oszlop és 2:3 (térf./térf.) tetrahidrofurán:0,2 M ammónium-acetát oldószerrendszer alkalmazásával, azzal jellemezve, hogy vizes kedarcidin oldatot készítenek, ezt a vizes oldatot etil-acetáttal extraháljuk, összegyűjtjük az etil-acetátos kivonatokat, az etil-acetátos kivonatból nyert maradékot szilikagél oszlop-kromatográfiának vetjük alá, lépcsős grádiens rendszerben benzol-metanol elegyet alkalmazva, és felfogjuk a kedarcidin kromofórt tartalmazó frakciót.