PL168918B1

PL168918B1 - Sposób wytwarzania nowego chromoforu kedarcydyny PL PL

Info

Publication number: PL168918B1
Application number: PL92295725A
Authority: PL
Inventors: John E Leet
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1991-09-26
Filing date: 1992-08-25
Publication date: 1996-05-31
Also published as: RU2067117C1; EP0534137A3; IL102942A0; AU647300B2; NO178892B; FI923827A0; CN1032235C; CA2075453A1; MX9204765A; AU2080092A; EP0534137A2; US5143906A; NO923260D0; ZA926421B; NZ244149A; PL295725A1; TW215900B; CN1073447A; JPH06179623A; NO923260L

Abstract

Sposób wytwarzania now ego chromoforu kedarcydyny, który (a) jest jasnozóltym bezpostaciow ym cialem stalym; (b) ma mase m olekularna 1029 okreslona ze spektrogramu masowego; (c) ma wzór sumaryczny C 53H60N 3O 16Cl; (d) daje widm o absorpcyjne w podczerwieni (KBr) takie, jak pokazane na fig. 1; (e) daje widm o absorpcyjne w nadfiolecie po rozpuszczeniu w metanolu takie, jak pokazano na fig. 2 ; (f) po rozpuszczeniu w D M SO -d 6 daje widm o m agnetycznego rezonansu protonowego takie, jak na fig. 3; (g) po rozpuszczeniu w D M SO -d 6 daje widm o m agnetycznego rezonansu 13C takie, jak na fig. 4; (h) daje w chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym wartosc Rf 0,29 w ukladzie rozpuszczalników benzen-metanol (9 : 2 objetosciow o) i wartosc Rf 0,16 w ukladzie rozpuszczalników benzen-m etanol (9 : 1 objetosciowo); oraz (i) daje czas retencj i w wysokowydajnej chromatografii cieczowej równy 1 2 minutom na kolumnie z zelem krzemionkowym C 1 8 z odwróconymi fazami w ukladzie rozpuszczalników tetrahydrofuran - 0,2M octan amonu ( 2 : 3 objetosciowo), znam ienny tym , ze wytwarza sie wodny roztwór kedarcydyny, poddaje sie ten roztwór ekstrakcji octanem etylu, zbiera sie ekstrakt octanu etylu, poddaje sie wymieniony ekstrakt octanu etylu chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym stosujac gradient krokowy w ukladzie elucyjnym benzen-metanol i zbiera sie frakcje zawierajaca chromofor kedarcydyny Wzór PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego chromoforu kedarcydyny o działaniu przeciwnowotworowym.

Białkowy przeciwnowotworowy antybiotyk nazwany kedarcydynąopisuje opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 001 112. Według opisu antybiotyk ten jest kompleksem pojedynczego łańcuchapolipeptydowego i niebiałkowego chromoforu. Kedarcydynę otrzymuje się w procesie fermentacyjnym z udziałem Streptoalloteichus sp. nov. L585-6 (ATCC-53650), a wyodrębnianie i oczyszczanie kedarcydyny opisuje przykład 4 wymienionego opisu. W tym opisie patentowym nie opisano ani nie zasugerowano żadnej procedury oddzielania chromoforu z otrzymanego antybiotyku, ani też nie zasugerowano, że przeciwnowotworowa aktywność kedarcydyny jest związana z niebiałkowym chromoforem.

Przeciwnowotworowy antybiotyk zwany neokarcynostatynąskłada się z kompleksu 1: 1 białka i niebiałkowego chromoforu. Literatura podaje, że część chromoforową neokarcynostatyny można oddzielić od kompleksu drogą ekstrakcji zakwaszonym metanolem i że właściwości przeciwnowotworowe neokarcynostatyny są związane głównie z chromoforem. W przypadku neokarcynostatyny struktura chromoforu została określona (patrz np. J. Antibiotics, 1989, 42, 761-768. Jednak w przypadku kedarcydyny procedura ekstrakcj i metanolem nie wystarczyła do otrzymania oczyszczonego chromoforu.

Inny białkowy przeciwnowotworowy antybiotyk nazwany aureomycyną także zawiera składnik białkowy i niebiałkowy chromofor. Chromofor tego antybiotyku także wydzielono z antybiotyku drogą ekstrakcji metanolem (patrz Biochem. Biophys. Res. Commun., 1980, 94 255-261, a aktywność przeciwnowotworowąponownie stwierdzono przede wszystkim w chromoforze.

168 918

Wiadomo, że istnieją inne białkowe antybiotyki przeciwnowotworowe zawierające niebiałkowy chromofor, którego nie można było skutecznie oddzielić od antybiotyku ani opisaną powyżej metodą ekstrakcji metanolem, ani innymi znanymi metodami oczyszczania. Ogólnie, chromofory z takich białkowych antybiotyków, nawet po oddzieleniu, są znacznie bardziej nietrwałe od samego kompleksu antybiotykowego.

Zgodny z wynalazkiem sposób wytwarzania nowego chromoforu kedarcydyny obejmuje etapy (a) sporządzania wodnego roztworu kedarcydyny, (b) poddania tego wodnego roztworu ekstrakcji organicznej octanem etylu, (c) zebrania ekstraktu octanu etylu, (d) poddania wymienionego ekstraktu chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym z użyciem gradientowej mieszaniny benzenu z metanolem oraz (e) zebrania frakcji zawierającej chromofor kedarcydyny.

Chromofor wytworzony sposobem według wynalazku jest użyteczny w sposobie powstrzymywania wzrostu nowotworu u ssaka, polegającym na podaniu wymienionemu ssakowi skutecznej ilości chromoforu kedarcydyny lub środka farmaceutycznego zawierającego powstrzymującą wzrost nowotworu ilość chromoforu kedarcydyny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik.

Chromofor kedarcydyny można otrzymać z przeciwnowotworowego antybiotyku kedarcydyny wydzielonego metodą z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 001 112 lub z pożywki fermentacyjnej używanej do wytwarzania kedarcydyny. Jednym z zalecanych substratów jest oczyszczona kedarcydyna wydzielona w sposób opisany w przykładzie 4 wymienionego wyżej opisu patentowego. Inny zalecany substrat otrzymuje się przez filtrację pożywki fermentacyjnej hodowli wytwarzającego kedarcydynę szczepu Streptoalloteichus, poddanie przesączu chromatografii anionowymiennej, gdzie eluentem jest bufor kationowy o pH 7 - 8, a następnie ten sam bufor z chlorkiem sodu oraz zebranie frakcji wymytej buforem z NaCl. Eluat z tej operacji chromatograficznej jest wolny od wielu zanieczyszczeń, co pozwala na osiągnięcie wyższej wydajności chromoforu. Stwierdzono, że wygodnie jest liofilizować ten eluat przechowując go przed opisaną poniżej ekstrakcją, ale równie dobrze można zastosować bezpośrednio eluat wodny. W sposobie według wynalazku można także zastosować przesączoną pożywkę fermentacyjną pomijając etap oczyszczania anionowymiennego, ale niezbędne są wówczas dalsze etapy oczyszczania chromoforu, a proces jest mniej wydajny w porównaniu z procesem stosującym oczyszczoną kedarcydynę lub częściowo oczyszczoną pożywkę fermentacyjną poddaną procesowi anionowymiennemu.

Wodny roztwór kedarcydyny oczyszczonej lub częściowo oczyszczonej zgodnie z powyższym opisem poddaje się następnie ekstrakcji octanem etylu. Inne rozpuszczalniki organiczne, takie jak zakwaszony metanol stosowany do otrzymywania chromoforu neokarcynostatyny, n-butanol, benzen z metanolem i chloroform z metanolem, powodują rozkład lub tworzenie emulsji. Ekstrakt octanu etylu poddaje się następnie chromatografii cieczowej na żelu krzemionkowym, stosując jako eluent benzen zawierający gradientowo rosnące ilości metanolu. Frakcje bada się metodą chromatografii cienkowarstwowej, a pożądaną frakcję zawierającą oczyszczony chromofor kedarcydyny można następnie zatężyć pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymać produkt w postaci bezpostaciowego ciała stałego barwy jasnożółtej.

Chromofor kedarcydyny ma następujące właściwości fizykochemiczne:

Opis: Jasnożółte ciało stałe, bezpotaaciowe

Trwałość: Bardzo nietrwały. Rozkłada się w ciągu godzin w roztworze benzenu, chloroformu, metanolu i dimetylosulfotlenku (DMSO).

Wzór cząsteczki:

C5₃H60N3Oi6Cl

Masa cząsteczkowa: 1029,3228

Widmo masowe: Spekoometr masowy Kratos MS50 [M+H]+ 1030, FAB z alkoholem m-nitrobenzylowym

168 918

Widmo w podczerwieni: Spektrometr IR z transformacją Fouriera Perkin Elmer

1800; pastylka KBr. Główne pasma IR (cm'¹); 3432, 3076, 2976, 2832, 2188,1742,1656, 1622,1525,1470, 1450,1434, 1386,1354,1298, 1240, 1192,1164, 1114, 1080, 1060, 1032, 1010, 980, 936, 902, 862, 824, 798, 680.

Widmo w nadfiolecie:

Spektrofotometr z matrycą diodową Hewlett Packard 8452A X_max (MeOH): 256, 316 nm (log ε 4,78, 4,16)

Analiza metodą wysokowydajnej chromatografii cieczowej: Kolumna:

Eluant:

Przepływ: Detektor: Stężenie próbki Czas retencji:

Q-BEX C18 (10 μ) nr 10230 4 części tetrahydrofuranu, części 0,2M octanu amonu 2 ml na minutę 254 nm μg/ml metanolu 12 minut

Analiza elementarna: Znaleziono: C 58,78; H 5,78; N 3,56

Test jakościowy na Cl: pozytywny Test jakościowy na S: negatywny 'Η-NMR: Spektrometr Bruker model AM-500

Rozpuszczalnik: DMSO-d6

Zaobserwowane przesunięcia chemiczne (względem sygnału DMSO δ 2,531):

1,09 (s, 3H), 1,16 (s br, 6H), 1,34 (s br, 6H), 1,74 (m, 2H), 1,92 (m, 1H), 2,05 (d, 1H, J=14,3), 2,36 (m, 1H), 2,46 (s, 6H), 2,86 (m, 2H), 3,21 (m, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,95 (s, 3H), 3,95 (m, 1H), 4,04 (m, 1H), 4,09 (m, 1H), 4,12 (m, 1H), 4,27 (m, 1H), 4,30 (m, 1H), 4,34 (m, 1H), 4,53 (s br, 1H), 4,75 (m, 1H), 4,81 (s br, 1H), 5,11 (s br, 1H), 5,44 (s br, 1H), 5,56 (m, 1H), 6,19 (s, 1H), 6,62 (s, 1H), 6,97 (s, 1H), 7,11 (s, 1H), 7,22 (d, 1H, J=8,3), 8,06 (d, 1H, J=8,3), 8,48 (s, 1H), 9,59 (d, 1H, J=7,4).

13C-NMR: Spektrometr Bruker model AM-500

Rozpuszczalnik: DMSO-d6

Zaobserwowane przesunięcia chemiczne (względem sygnału DMSO δ 39,113, 39,268, 39,447, 39,601, 39,780,39,935,40,113):

Sygnał	PPM	Krotność
1	17,13	q
2	18,25	q
3	21,86	q
4	27,19	q
5	36,38	t
6	37,62	t
7	41,64	t
8	44,63	q
9	48,31	d
10	49,94	d
11	60,71	q
12	61,62	q

168 918

13	64,05	d
14	64,24	t
15	65,67	d
16	65,96	d
17	68,45	s
18	68,93	d
19	70,11	d
20	71,85	s
21	71,91	d
22	76,22	d
23	78,46	d
24	83,14	d
25	88,16	s
26	94,64	d
27	99,81	d
28	99,91	s
29	102,13	d
30	103,96	s
31	109,79	s
32	110,01	d
33	115,86	s
34	117,10	s
35	120,06	d
36	122,80	d
37	123,99	d
38	129,02	s
39	134,33	s
40	136,22	d
41	139,02	s
42	139,10	d
43	141,40	s
44	144,46	s
45	146,28	s
46	148,33	s
47	153,29	s
48	155,17	s
49	155,37	s
50	167,24	s
51	169,06	s
Chromatografia cienkowarstwowa: Rf 0,29 Benzen-metanol 9 :	: 2

Rf 0,16 Benzen-metanol 9 :1 Płytka: żel krzemionkowy Uniplate, 0,25 mm grubości (Analtech) Detekcja: Krótkie promieniowanie nadfioletowe, spryskiwanie siarczanem ceru

W oparciu o podaną wyżej charakterystykę fizykochemiczną sądzi się, że chromofor kedarcydyny ma strukturę odpowiadającą wzorowi przedstawionemu na rysunku.

Fig. 1 przedstawia widmo absorpcji w podczerwieni chromoforu kedarcydyny (pastylka KBr). Fig. 2 przedstawia widmo absorpcyjne w nadfiolecie chromoforu kedarcydyny rozpuszczonego w metanolu.

Fig. 3 przedstawia widmo protonowego rezonansu magnetycznego chromoforu kedarcydyny w DMSO-d6 (500,13 MHz).

168 918

Fig. 4 przedstawia widmo magnetycznego rezonansu C chromoforu kedarcydyny w DMSO-d6 (125,76 MHz).

Środki farmaceutyczne zawierające skutecznie inhibitujące nowotwór ilości chromoforu kedarcydyny w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem mogą także zawierać inne aktywne środki przeciwnowotworowe i mogą przybierać postać farmaceutyczną odpowiednią dla pożądanego sposobu podawania. Przykłady takich środków obejmują preparaty stałe do podawania doustnego, takie jak tabletki, kapsułki, pigułki, proszki i granulki, ciekłe preparaty do podawania doustnego, takie jak roztwory, zawiesiny, syropy lub eliksiry oraz preparaty do podawania pozajelitowego, takie jak sterylne roztwory, zawiesiny lub emulsje. Można je wytwarzać także w postaci sterylnych preparatów stałych, które można rozpuszczać w sterylnej wodzie, solance fizjologicznej lub innym sterylnym środku do iniekcji bezpośrednio przed zastosowaniem.

Przy stosowaniu jako środek przeciwnowotworowy optymalne dawki i reżimy podawania dla danego pacjenta może łatwo ustalić fachowiec. Należy oczywiście rozumieć, że rzeczywista stosowana dawka będzie się zmieniała w zależności od konkretnej mieszanki, sposobu podawania i danego miejsca, pacjenta i leczonej choroby. Będzie trzeba wziąć pod uwagę wiele czynników modyfikujących działanie leku, włącznie z wiekiem, masą ciała, płcią dietą, czasem podawania, drogą podawania, szybkością wydalania, stanem pacjenta, połączeniem leków, wrażliwością na leki i stanem choroby.

Aktywność przeciwnowotworową chromoforu kedarcydyny określono w teście cytotoksyczności in vitro wobec kilku linii komórek ludzkich nowotworów oraz in vivo wobec transplantowalnej białaczki P388 i czerniaka B-16. Poniżej opisano wykorzystane metody i wyniki.

I. Metody

A. Test cytotoksyczności in vitro

Linie komórek zastosowane do określania cytotoksycznego działania in vitro obejmują wrażliwą na leki linię ludzkich komórek raka gruczołów okrężnicy HCT116, oporne na leki siostrzane linie komórek HCT116/VP35 i HCT116/VM46 odpowiednio o niskim poziomie topoizomerazy II i podwyższonym poziomie ¹ glikoproprotein P-170 oraz oporną na leki linię ludzkich komórek raka jajnika A2780 i siostrzaną a2780/DDP. Linia A2780/DDP jest zgodnie z literaturą oporna dzięki ulepszonym mechanizmom naprawy DNA i zwiększonemu poziomowi GSH/GST. Komórki hodowano w środowisku McCoya i 10% płodowej surowicy bydlęcej. W fazie wzrostu logarytmicznego umieszczono 4 x 10³ komórek na studzienkę w płytkach o 96 studzienkach i inkubowano w temperaturze 37°C w atmosferze 95% O2^z5% CO2 przez 24 godziny, aby komórki uległy przyłączeniu. Dodano związki do górnego rzędu studzienek, seryjnie rozcieńczono (czterokrotne rozcieńczenie) i inkubowano przez dodatkowe 72 godziny. Określono liczbę żywych komórek w każdej studzience w opisany poprzednio sposób ² dodając 0,05 mg/ml końcowego stężenia barwnika tetrazolinowego (XXT) w obecności 0,005 nM końcowego stężenia metanosulfonianu fenazyny. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 3 godziny w celu rozwinięcia koloru zmierzono optyczną gęstość przy pomocy czytnika płytek Dynatech MR600 przy długości 450 nm. Obliczono wartości IC50 (stężenie leku inhibitujące wzrost komórek w 50%) stosując regresję liniową odczytów gęstości optycznej. Dokonano trzykrotnego oznaczenia na oddzielnych płytkach o 96 studzienkach dla każdego leku i każdej badanej linii komórek.

B. Modele komórek mysich in vivo

1. Modele białaczki mysiej P388

Utrzymywano nowotwór P388 w formie puchlinowej w myszach DBA/2. Doświadczalne modele nowotworu wykorzystywały myszy CDF1 którym implantowano dootrzewnowo lub dożylnie 1 x 10⁶ komórek białaczki w dniu 0 i leczono je lekami zgodnie z podanym sposobem i czasem dawkowania. Myszy zważono w dniu 0 oraz w dniu 5 i 6. Utrata wagi rzędu 20% lub większa wskazywała na toksyczność leku. Każda grupa dawkowania składała się z sześciu myszy, a grupa kontrolna z 10. Rozkład dawkowania był Q1DX1;1. Codziennie badano liczbę

168 918 zgonów i określono medianę czasu życia dla każdej grupy. Wzrost czasu życia rzędu 25% lub większy w grupie poddanej działaniu leku w porównaniu z grupą kontrolną nie leczoną był kryterium aktywności (% T/C > 125%). Doświadczenie przerwano około 30 dnia.

2. Model mysiego nowotworu stałego B-16

Czerniaka mysiego B-16 utrzymywano jako nowotwór podskórny w myszach C57BL/6. Doświadczalne modele nowotworu wykorzystywały myszy BDF¹, którym implantowano podskórnie 25 mg fragment nowotworu w dniu O. Chromofor kedarcydyny podawano dożylnie w układzie Q1DX1;1. Myszy zważono w dniu 0 oraz 9.

II. Wyniki

A. in vitro

Jak to przedstawiono w poniższej tabeli 1, chromofor kedarcydyny był wyjątkowo silny (w porównaniu z VP-16 (etopozyd)) jako środek wstrzymując rozwój komórek (wartości IC50 wyrażone w nanogramach związku na ml, końcowe stężenie). Chromofor kedarcydyny był 285 i 1725 razy bardziej skuteczny od VP-16 w dwu wrażliwych na VP-16 liniach komórek. Ponadto chromofor kedarcydyny nie wykazywał krzyżowej oporności z VP-16 w liniach HCT116/VP3 5 i HCT116/VM46. W testach z wrażliwą linią A2780 i linią A2780/DDP zarówno VP-16, jak i chromofor kedarcydyny były 6,6 raza słabsze w linii komórek opornej w porównaniu z linią wrażliwą

Tabela 1

Związek	Cytotoksyczność in vitro chromoforu kedarcydyny IC50 (ng/ml)
Linie komórek
HCT116	HCT116/VP3	HCT116/VM46	A2780	A2780/DDP
Chromofor kedarcydyny	0,4	0,3	0,3	0,2	1,3
VP-16^a (etopozyd)	690	8758	3255	57	379

^a Wartości VP-16 są wartościami średnimi z trzykrotnych oznaczeń z ostatnich sześciu eksperymentów

B. In vivo

1. Model białaczki mysiej P388

Oceniany w działaniu wobec dootrzewnowo implantowanej mysiej białaczki P388 chromofor kedarcydyny dawał stosunek T/C% 175 przy optymalnej dawce 1 mg/kg na zastrzyk przy podawaniu dootrzewnowym w dzień po implantowaniu nowotworu. W tym samym doświadczeniu dożylnie implantowane komórki nowotworowe P388 były także wrażliwe na działanie chromoforu kedarcydyny. Po podaniu dożylnym w dzień po implantowaniu nowotworu chromofor kedarcydyny dał T/C% równe 214 przy optymalnej dawce 0,25 mg/kg zastrzyk. Dwie różnego pochodzenia kedarcydyny były jednakowo skuteczne, chociaż nieco słabsze od chromoforu kedarcydyny w tym samym doświadczeniu. Działanie przeciwnowotworowe chromoforu kedarcydyny wobec białaczki mysiej P388 potwierdzono w doświadczeniu 8328. W modelu implantacji dootrzewnowej chromofor kedarcydyny podawany dootrzewnowo w układzie Q1DX1;1 dawał T/C% równe 185 przy optymalnej dawce 0,25 mg/kg na zastrzyk. W modelu implantacji dożylnej w tym doświadczeniu chromofor kedarcydyny dawał T/C% równe 186 przy optymalnej dawce 0,125 mg/kg na zastrzyk dożylnie, w tym samym układzie. Dwie różnego pochodzenia kedarcydyny były jednakowo skuteczne, nawet jeśli nieco słabsze od chromoforu kedarcydyny w tym samym doświadczeniu.

W modelach białaczki mysiej P388 chromofor kedarcydyny był równie silny i skuteczny niezależnie od ustalaniajego działania przeciwnowotworowego przy podawaniu dootrzewnowym w modelu dootrzewnowym lub podawaniu dożylnym w modelu dożylnym. Chromofor kedarcydyny był równie skuteczny i nieco silniejszy od kedarcydyny w modelu P388.

2. Model mysiego nowotworu stałego B-16

W doświadczeniu 796 oceniano działanie przeciwnowotworowe chromoforu kedarcydyny w modelu mysiego czerniaka B-16. Gdy nowotwór implantowano podskórnie, chromofor

168 918 kedarcydyny wykazywał aktywność według kryterium długości życia dając T/C% równe 164 przy podaniu dożylnym w dzień po implantacji nowotworu w optymalnej dawce 0,75 mg/kg na zastrzyk. W tym samym doświadczeniu kedarcydyny dała identyczny stosunek T/C% przy optymalnej dawce 0,75 mg/kg na zastrzyk przy tym samym sposobie i układzie podawania. Ani kedarcydyna, ani jej chromofor nie były aktywne według kryterium opóźniania rozwoju nowotworu.

III. Wnioski

Chromofor kedarcydyny wykazał znaczące działanie przeciwnowotworowe w modelu dootrzewnowo lub dożylnie implantowanej białaczki mysiej P388orazpodskómieimplantowanego czerniaka mysiego B-16 według kryterium długości życia. Był tak samo aktywny i nieco silniejszy od kedarcydyny przy bezpośrednim porównaniu w tych samych doświadczeniach.

IV. Odnośniki

1. Long, B. H., Wang, L., Lorico, A., Wang, R. C. C., Brattain, M. G. i Casazza, A. M., Mechanisms of Resistance to Etoposide and Teniposide in Acquired Resistant Human Colon and Lung Carcinoma Cell Lines. Cancer Research 51, w druku (1991).

2. Scudiero, D. A., Shoemaker, R. H., Pauli, K. D., Monks A., Tierney, S., Nofziger, T. H., Currens, M. J., Seniff, D. i Boyd, M. R., Evaluation of a Soluble Tetrazolinum/Formazan Assay for Cell Growth and Drug Sensivity in Culture Using Human and Other Tumor Cell Lines. Cancer Research 48: 4827-4822 (1988).

Wyniki doświadczeń wskazują, że chromofor kedarcydyny wykazuje silne działanie przeciwnowotworowe invitro wobec kilku linii komórek ludzkich nowotoworów oraz in vivo wobec mysiej białaczki P388 i czerniaka BI 6.

Wyniki prób przedstawiono w poniższych tabelach 2-7.

Tabela 2

Aktywność przeciwnowotworowa wobec implantowanej dootrzewnowo białaczce P388 (dośw. 8305)

Próbka	Ilość mg/kg/dawkę lub rozcieńczenie	Mediana czasu życia	% T/C	Przeciętna zmiana masy (g)	Liczba żywych myszy 5 dnia
Mitomycyna C	4,8	23,0	230	-0,7	6,6
	3,2	20,0	200	-0,5	6,6
Kedarcydyna	1,6	18,5	185	1,3	6,6
26596-48-1	0,8	17,0	170	-0,9	6,6
	0,4	16,0	160	-0,8	6,6
	0,2	15,0	150	-0,0	6,6
	0,1	14,0	140	0,3	6,6
	0,05	13,5	135	0,8	6,6
Kedarcydyna	1,6	17,5	175	-0,9	6,6
29190-85-1	0,8	17,5	175	-0,3	6,6
	0,4	15,0	150	0,2	6,6
	0,2	14,0	140	0,3	6,6
	0,1	13,5	135	0,5	6,6
	0,05	14,0	140	1,4	6,6
Chromofor	4	9,0	90	-3,6	6,6
kedarcydyny	2	10,5	105	-2,2	6,6
	1	17,5	175	-0,3	6,6
	0,5	16,5	165	-0,5	6,6
	0,25	15,0	150	-0,4	6,6
	0,125	14,5	145	0,1	6,6
Grupa kontrolna		10,0	100	2,5	10/10

168 918

T a b e 1 a 3

Aktywność przeciwnowotworową wobec implantowanej dożylnie białaczce P388 (dośw. 8305)

Próbka	Ilość mg/kg/dawkę lub rozcieńczenie	Mediana czasu życia	% TC	Przeciętna zmiana masy (g)	Liczba żywych myszy 5 dnia
Mitomycyna	4,8	13,5	193	-0,8	6,6
	3,2	11,0	157	0,5	6,6
	1,6	10,0	143	-0,3	6,6
	0,8	8,0	114	0,4	6,6
Kedarcydyna	1,6	6,5	93	-6,0	6,6
26596-48-1	0,8	12,5	179	-3,0	6,6
	0,4	11,0	157	-0,0	6,6
	0,2	9,0	129	0,5	6,6
	0,1	8,0	114	-0,3	6,6
	0,05	7,0	100	-0,5	6,6
Kedarcydyna	1,6	7,0	100	-4,8	6,6
29190-85-1	0,8	13,0	186	-2,0	6,6
	0,4	11,0	157	-0,3	6,6
	0,2	9,0	129	-0,0	6,6
	0,1	8,5	121	-0,2	6,6
	0,05	7,5	107	-0,0	6,6
Chromofor	4	toks.	toks.		0,6
kedarcydyny	2	toks.	toks.	-	0,6
	1	toks.	toks.	-	0,6
	0,5	7,5	107	-2,9	6,6
	0,25	15,0	214	-0,8	6,6
	0,125	13,0	186	-0,3	6,6
Grupa kontrolna		7,0	100	-0,1	10/10

Tabela 4

Aktywność przeciwnowotworową wobec implantowanej dootrzewnowo białaczce P388 (dośw. 8328)

Próbka	Ilość mg/kg/dawkę lub rozcieńczenie	Mediana czasu życia	% T/C	Przeciętna zmiana masy (g)	Liczba żywych myszy 5 dnia
Mitomycyna C	4,8	20,0	200	-0,5	6/6
	3,2	19,0	190	-0,8	6/6
Chromofor	2,0	toks.	toks.	-1,9	2/6
kedarcydyny	1,0	9,0	90	-2,3	6/6
	0,5	13,0	130	-1,1	6/6
	0,25	18,5	185	-0,4	6/6
Kedarcydyna	2,0	22,0	220	-1,1	5/6
Q257	1,0	21,0	210	-0,8	6/6
	0,5	15,5	155	-0,5	6/6
	0,25	17,0	170	-1,0	6/6

168 918

Tabela 5

Próbka Kedarcydyna W-4 Grupa kontrolna

Próbka	Ilość mg/kg/dawkę lub rozcieńczenie	Mediana czasu życia	% T/C	Przeciętna zmiana masy (g)	Liczba żywych myszy 5 dnia
Kedarcydyna	8,0	18,0	180	1,4	6/6
W-4	4,0	18,0	180	-1,3	6/6
	2,0	17,5	175	-0,8	6/6
	1,0	16,0	160	-1,0	6/6
	0,5	14,5	145	-0,9	6/6
	0,25	14,5	145	-0,3	6/6
Grupa kontrolna		10,0	100	0,8	10/10

Tabela 6

Aktywność przeciwnowotworowa wobec implantowanej dożylnie białaczce P388 (dośw. 8328)

Próbka	Ilość mg/kg/dawkę lub rozcieńczenie	Medianaczasu życia	% T/C	Przeciętna zmiana masy (g)	Liczba żywych myszy 5 dnia
Mitomycyna C	3,2	10,0	143	-0,7	6/6
	1,6	9,0	129	-0,1	6/6
Chromofor	1,0	toks.	toks.		0/6
kedarcydyny	0,5	toks.	toks.	-	0/6
	0,25	7,0	100	-2,4	6/6
	0,125	13,0	186	-2,5	6/6
Kedarcydyna	2,0	7,0	100	-5,6	6/6
Q257	1,0	9,5	136	-4,7	6/6
	0,5	13,0	186	-1,7	6/6
	0,25	9,0	129	-0,7	6/6
Kedarcydyna	8,0	7,0	100	-5,4	6/6
W-4	4,0	11,5	164	-3,6	6/6
	2,0	11,5	164	-0,9	6/6
	1,0	9,0	129	-0,9	6/6
	0,5	8,0	114	-0,0	6/6
	0,25	7,0	100	-0,1	6/6
Grupa kontrolna		7,0	100	-0,5	10/10

Tabela 7

Aktywność przeciwnowotworowa wobec implantowanemu podskórnie czerniakowi B16 (dośw. 796)

Próbka	Ilość mg/kg/dawkę lub rozcieńczenie	Mediana czasu życia	% T/C	Przeciętna zmiana masy (g)	Liczba żywych myszy 5 dnia
1	2	3	4	5	6
Chromofor	0,5	toks.	toks.	-	0/8
kedarcydyny	0,25	toks.	toks.	-1,0	2/8
	0,125	31,5	126	1,1	8/8
	0,062	41,0	164	1,1	8/8

168 918

1	2	3	4	5	6
Kedarcydyna	1,5	toks.	toks.	-4,7	1/8
Q257	0,75	41,0	164	0,7	8/8
	0,32	40,5	162	0,8	8/8
	0,16	39,0	156	0,4	8/8
Kedarcydyna	6	toks.	toks.	-7,7	2/8
W-4	3	47,5	190	-0,7	8/8
	1,5	36,5	146	0,0	8/8
	0,75	31,0	124	0,0	8/8
Grupa kontrolna		25,0	100	-0,2	10/10

Niniejszy wynalazek zilustrowano poniższym przykładem nie mającym jednak ograniczać zakresu wynalazku. Jeśli nie podano inaczej, wszystkie stosunki ilości rozpuszczalników są objętościowe.

Przykład

Metody ogólne:

Materiały:

Chloroform, benzen, octan etylu i metanol były bezwodnymi rozpuszczalnikami o czystości analitycznej. Tetrahydrofuran był wolnym od środków konserwujących rozpuszczalnikiem o czystości chromatograficznej. Rozpuszczalników tych nie oczyszczano ani nie destylowano. Woda użyta do rozdzielania rozpuszczalników to woda wodociągowa zdejonizowana. Woda zastosowana w doświadczeniach chromatograficznych to woda wodociągowa zdejonizowana przepuszczona przez układ wodny ze wsadem Millipore 4 (oporność 10 megaomów MilliQ). Octan amonu był reagentem o czystości chromatograficznej. Żel krzemionkowy do chromatografii cieczowej pod zmniejszonym ciśnieniem to LiChroprep Si 60 Mercka o rozmiarach cząstek 25 - 40 pm. Hydrat siarczanu ceru i tetrahydrat molibdenianu amonu (VI) są reagentami o czystości analitycznej.

Analityczna chromatografia cienkowarstwowa (TLC):

Zastosowano płytki chromatograficzne pokryte żelem krzemionkowym Uniplate GHLF (10 x 20 cm, 250 pm). Frakcje znaczono stosując jednorazowe pipety Mcrocaps 2 pl, a płytki wywoływano w zbiorniku równoważonym mieszaniną benzenu z metanolem (9:2 objętościowo). Składniki chromatogramu uwidoczniono w świetle nadfioletowym krótkofalowym i/łub po spryskaniu reagentem z siarczanem ceru. Natryskowy reagent z siarczanem ceru:

Natryskowy reagent z siarczanem ceru do chromatografii cienkowarstwowej sporządzono rozpuszczając 6g hydratu siarczanu ceru i 28g tetrahydratu molibdenianu amonu (VI) w 20% wodnym roztworze kwasu siarkowego (500 ml). Natryskiwaną płytkę TLC wywoływano ogrzewając ją w temperaturze około 150°C przez 5-10 minut.

Analityczna wysokowydajna chromatografia cieczowa

Następujące składniki wykorzystano w układzie analitycznej chromatografii cieczowej: układ dostarczania rozpuszczalnika M-45 Waters Associates, urządzenie wtryskowe U6K Waters Associates, moduł przedkołumnowy Guard-Pak ze wsadem Cl8, kolumna Q-BEX Scientific Inc. Cl8 (10 pm), średnica wewnętrzna 3,9 mm x 30 cm, QBX-10230). Składniki połączono rurkami stalowymi 316 (zewnętrzna średnica 1,6 mm, wewnętrzna 0,23 mm). Podany eluant pompowano z natężeniem 2,0 ml na minutę. Detekcji dokonywano układem detektorowym Hewlett Packard HP-1040A. Układ ten składał się z detektora diodowego HP-1040A, komputera HP-85B, napędu dyskowego HP-9121 i plotera HP-7470.

Oczyszczenie chromoforu kedarcydyny:

Otrzymywanie ekstraktu A - według schematu

Pożywkę fermentacyjną kedarcydyny otrzymuje się zgodnie z ogólnymi procedurami z przykładów 1 - 3 opisu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 001 112. Surowąpożywkę poddaje się filtracji i chromatografii anionowymiennej otrzymując eluat opisany w kol. 13, wiersze 34 opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 001 112. Eluat ten zawierający '2 '68 918 częściowo oczyszczoną kedarcydynę wykorzystuje się po liofilizacji jako substrat w następującym etapie ekstrakcji.

Częściowo oczyszczonąkedarcydynę (76 g) z liofilizacji powyższego eluatu rozpuszczono w 1100 ml wody. Wodny roztwór ekstrahowano czterokrotnie równą objętością octanu etylu w rozdzielaczu o pojemności 61. Ekstrakty octanu etylu zebrano i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem do suchej masy w obrotowej wyparce otrzymując 0,34 g pozostałości A. Chromatografia cieczowa pod zmniejszonym ciśnieniem pozostałości A:

Mały lejek filtracyjny Kontes ze spiekiem (wewnętrzna średnica 2,5 cm x 11 cm) upakowano w trzech czwartych suchym żelem krzemionkowym (Merck LiChroprep 25-40 pm), 12g. Kolumnę zrównoważono 100 ml benzenu odciągając rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość A rozpuszczono w octanie etylu z metanolem 3 : 1 (5 ml) i wstępnie adsorbowano na 3 g żelu krzemionkowego. Próbkę umieszczono w zawiesinie w benzenie, przeniesiono na kolumnę i obniżono ciśnienie. Stosując gradient krokowy rozpoczęto elucję (po 100 ml) benzenem, 1% metanolem w benzenie, 2%, 5% i 7,5% metanolem w benzenie (trzykrotnie). Chromatogram obserwowano przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej w świetle nadfioletowym krótkofalowym używając do wywoływania natrysku z siarczanu ceru. Pożądaną substancję eluowano pierwszą porcją 100 ml 7,5% metanolu w benzenie. Frakcję tę odparowano do suchej masy pod zmniejszonym ciśnieniem (25°C) w wyparce obrotowej otrzymując 0,2g chromoforu kedarcydyny.

168 918

Liofilizowany antybiotyk,kedarcydyna

1. Rozpuścić w wodzie

2. Ekstrakcja octanem etylu wyekstrahować octanem etylu odparować

Woda

Pozost ilość

Chromatografia cieczowa pod zmniejszonym ciśnieniem na żelu krzemionkowym gradient krokowy (benzen- metanol) chromofor kedarcydyny

Schemat

168 918

Ο

U_ ε

1_J

O <

<

1X1

LJ

168 918 ο

Vr3NV8dOSaV

LICZBA FALOWA (nm)

168 918

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób wytwarzania nowego chromoforu kedarcydyny, który (a) jest jasnożółtym bezpostaciowym ciałem stałym;

(b) ma masę molekularną 1029 określoną ze spektrogramu masowego;

(c) ma wzór sumaryczny C53H60N3O16Cl;

(d) daje widmo absorpcyjne w podczerwieni (KBr) takie, jak pokazane na fig. 1;

(e) daje widmo absorpcyjne w nadfiolecie po rozpuszczeniu w metanolu takie, jak pokazano na fig.
2;

(f) po rozpuszczeniu w DMSO-d6 daje widmo magnetycznego rezonansu protonowego takie, jak na fig.
3;

(g) po rozpuszczeniu w DMSO-d6 daje widmo magnetycznego rezonansu ¹³C takie, jak na fig. 4;

(h) daje w chromatografii cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym wartość Rf 0,29 w układzie rozpuszczalników benzen-metanol (9 : 2 objętościowo) i wartość Rf 0,16 w układzie rozpuszczalników benzen-metanol (9 : 1 objętościowo); oraz (i) daje czas retencji w wysokowydajnej chromatografii cieczowej równy 12 minutom na kolumnie z żelem krzemionkowym Cis z odwróconymi fazami w układzie rozpuszczalników tetrahydrofuran - 0,2M octan amonu (2 : 3 objętościowo), znamienny tym, że wytwarza się wodny roztwór kedarcydyny, poddaje się ten roztwór ekstrakcji octanem etylu, zbiera się ekstrakt octanu etylu, poddaje się wymieniony ekstrakt octanu etylu chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym stosując gradient krokowy w układzie elucyjnym benzen-metanol i zbiera się frakcję zawierającąchromofor kedarcydyny.