DE69119964T2 - Rebeccamycinanaloga-Biosynthese durch Zuführung von Tryptophananalogen - Google Patents
Rebeccamycinanaloga-Biosynthese durch Zuführung von TryptophananalogenInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft neue Analoga von Rebeccamycin, die antineoplastische Eigenschaften besitzen.
- Die US-patente Nr. 4487925 und 4552842 beschreiben das als Antitumor-Mittel bezeichnete Rebeccamycin, und die 5'-Methyl- und 5', 2', 3", 6"-Tetraacetatderivate davon, und ein Verfahren zur Herstellung des Mittels durch Kultivierung eines Rebeccamycin-produzierenden Stammes von Nocardia aerocolonigenes, vorzugsweise Nocardia aerocolonigenes ATCC 39243, oder einer Rebeccamycin-produzierenden Mutante davon in einem wässerigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff enthält, unter submersen aeroben Bedingungen, bis eine bedeutende Menge an Rebeccamycin produziert wurde. Neuerdings wurde Nocardia aerocolonigenes ATCC 39243 als Saccharothrix aerocolonigenes ATCC 39243 reklassifiziert (Bush et al., J. Antibiotics 40 (1987) 668-678).
- Die EP-A-269025 beschreibt Rebeccamycinderivate der Formel:
- worin A&sup6;-(CH&sub2;)n-NR¹R² und A¹³ H ist, oder A&sup6; H ist und A¹³ -(CH&sub2;)n-NR¹R² ist, X ausgewählt ist under anderem aus H, F, Cl und Br, und R&sup4; H oder CH&sub3; ist. Diese Verbindungen zeigen anti-neoplastische Eigenschaften.
- Die vorliegende Erfindung stellt neue Analoga des als Rebeccamycin bezeichneten Antitumormittels (Formel I) bereit. Formel I
- Spezifischer ausgedrückt werden Rebeccamycin-Analoga der nachfolgenden Formeln II und III bereitgestellt. Formel II Formel III
- worin X&sub1; und X&sub2; unabhängig voneinander Fluor oder Wasserstoff bedeuten, mit der Maßgabe, daß X&sub1; und X&sub2; nicht gleichzeitig Wasserstoff bedeuten; sowie pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze dieser Analoga.
- Die Verbindungen der Formel II und III werden hergestellt, indem man die Kulturen eines Rebeccamycin-produzierenden Stammes von Saccharothrix aerocolonigenes mit dem geeigneten Tryptophan-Analogen ergänzt.
- Figur 1 zeigt das IR-Spektrum der Verbindung der Formel IV.
- Figur 2 zeigt das ¹H-NHR-Spektrum der Verbindung der Formel IV.
- Figur 3 zeigt das ¹³C-NMR-Spektrum der Verbindung der Formel IV.
- Figur 4 zeigt das IR-Spektrum der Verbindung der Formel V.
- Figur 5 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum der Verbindung der Formel V.
- Figur 6 zeigt das ¹³C-NMR-Spektrum der Verbindung der Formel V.
- Figur 7 zeigt das IR-Spektrum der Verbindung der Formel VIII.
- Figur 8 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum der Verbindung der Formel VIII.
- Figur 9 zeigt das ¹³C-NMR-Spektrum der Verbindung der Formel VIII.
- Figur 10 zeigt das Massenspektrum der Verbindung der Formel IV.
- Figur 11 zeigt das UV-Spektrum der Verbindung der Formel IV.
- Figur 12 zeigt das Massenspektrum der Verbindung der Formel V.
- Figur 13 zeigt das UV-Spektrum der Verbindung der Formel V.
- Figur 14 zeigt das Massenspektrum der Verbindung der Formel VIII.
- Figur 15 zeigt das UV-Spektrum der Verbindung der Formel VIII.
- Die US-Patente Nr. 4487925 und 4552842 beschreiben die Herstellung und Isolierung des als Rebeccamycin (Formel I) bezeichneten Antitumor-Mittels. Formel I
- Die vorstehend genannte Rebeccamycin-Verbindung ist die Hauptkomponente der Fermentation des Rebeccamycinproduzierenden Stammes von Saccharothrix aerocolonigenes.
- Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß das in den US- Patenten Nr. 4487925 und 4552842 beschriebene Fermentationsverfahren in Gegenwart bestimmter Tryptophan- Analoga durchgeführt werden kann, um neue Analoga von Rebeccamycin mit wertvollen Antitumor-Eigenschaften herzustellen. Die erfindungsgemäßen Rebeccamycin-Analoga besitzen die nachfolgenden Formel II und III. Formel II Formel III
- worin X&sub1; und X&sub2; Fluor oder Wasserstoff bedeuten, unter der Voraussetzung, daß X&sub1; und X&sub2; nicht gleichtzeitig Wasserstoff sind; sowie pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze davon.
- Ein bevorzugtes Beispiel der erfindungsgemäßen Verbindungen ist die Verbindung mit der nachfolgenden Strukturformel IV Formel IV
- Ein anderes bevorzugtes Beispiel der erfindungsgemäßen Verbindungen ist die Verbindung mit der nachstehenden Strukturformel V Formel V
- Ein anderes bevorzugtes Beispiel der erfindungsgemäßen Verbindungen ist die Verbindung mit der nachstehenden Strukturformel VI Formel VI
- Ein weiteres bevorzugtes Beispiel für erfindungsgemäße Verbindungen ist die Verbindung mit der nachstehenden Strukturformel VII: Formel VII
- Ein weiteres bevorzugtes Beispiel für erfindungsgemäße Verbindungen ist die Verbindung mit der nachstehenden Strukturformel VIII Formel VIII
- Ein weiteres bevorzugtes Beispiel für erfindungsgemäße Verbindungen ist die Verbindung mit der nachstehenden Strukturformel IX Formel IX
- Ein weiteres bevorzugtes Beispiel für erfindungsgemäße Verbindungen ist die Verbindung mit der nachstehenden Strukturformel X Formel X
- Ein weiteres bevorzugtes Beispiel für erfindungsgemäße Verbindungen ist die Verbindung mit der nachstehenden Strukturformel XI Formel XI
- Im erfindungsgemäßen Verfahren wird zum Rebeccamycin- Fermetationsmedium ein Tryptophan-Analogon zugegeben und während der Fermentation in die Rebeccamycin-Struktur eingebaut, wodurch ein entsprechendes Rebeccamycin-Analogon geschaffen wird. Eine ausführlichere Beschreibung des Verfahrens wird weiter unten und in den nachfolgenden Beispielen gegeben.
- Die Verbindungen der Formel IV-XI werden durch Kultivieren eines Rebeccamycin-produzierenden Stammes von Saccharothrix aerocolonigenes mit DL-4-Fluortryptophan, DL-5- Fluortryptophan, DL-6-Fluortryptophan oder DL-7- Fluortryptophan hergestellt. Der bevorzugte produzierende Organismus ist ein neuer Stamm von Saccharothrix aerocolonigenes, früher im US-Patent 4487925 als Nocardia aerocolonigenes-Stamm C38,383-RK2 (ATCC 39243) bezeichnet. Neuerdings wurde dieser Stamm als Saccharothrix aerocolonigenes reklassifiziert (Bush et al., J. Ahtibiotics 40 (1987) 668-678) und wird hier als Saccharothrix aerocolonigenes-Stamm C38,383-RK2 (ATCC 39243) bezeichnet. Dieser Stamm wurde aus in Panama gesammelten Bodenproben isoliert. Eine biologisch reine Kultur des Stammes C38,383- RK2 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland hinterlegt und zu ihrer permanenten Sammlung von Mikroorganismen als ATCC 39243 hinzugefügt. Diese Kultur, bezeichnet als C38,383-RK2, wird auch als ruhende Kultur in Lyophilisierröhrchen und Kryo-Ampullen in der Bristol-Myers Squibb Co. Pharmaceutical Research and Development Division Culture Collection, 5 Research Parkway, wallingford, Connecticut 06492, aufbewahrt.
- Die taxonomischen Untersuchungen des Stammes C38,383-RK2 (ATCC 39243) wurden detailliert im US-Patent 4487925 und in J. Antibiotics 40 (1987) 668-678 beschrieben. Der Stamm wurde als neuer Stamm Saccharothrix aerocolonigenes klassifiziert.
- Es wird angemerkt, daß die folgende Erfindung nicht auf die Verwendung dieses bestimmten bevorzugten Stammes ATCC 39243 oder auf Organismen, die vollkommen auf seine Beschreibung passen, beschränkt ist. Es wird ausdrücklich darauf hingewiesen, daß andere Rebeccamycin-produzierende Stämme oder Mutanten des beschriebenen Organismus, die auf konventionellem Weg, wie z.B. durch Röntgenstrahlen, Ultraviolettstrahlen, Behandlung mit Stickstofflost, Phagenbehandlung und dergleichen hergestellt werden können, eingeschlossen sind.
- Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Rebeccamycin-produzierender Stamm von Saccharothrix aerocolonigenes mit den kennzeichnenden Eigenschaften des Stammes C38,383-RK2 (ATCC 39243), oder eine Mutante oder Variante davon in einem konventionellen wässerigen Nährmedium, das mit dem geeigneten Tryptophan- Analogon ergänzt ist, kultiviert. Für eine optimale Herstellung der Verbindungen der Formeln VI und X sollte das Medium mit DL-4-Fluortryptophan ergänzt sein. Für eine optimale Herstellung der Verbindungen der Formel IV und IX sollte das Medium mit DL-5-Fluortryptophan ergänzt sein. Für eine optimale Herstellung der Verbindungen der Formel V und VIII sollte das Medium mit DL-6-Fluortryptophan ergänzt sein. Für eine optiniale Herstellung der Verbindungen der Formel VII und XI sollte das Medium mit DL-7-Fluortryptophan ergänzt sein. Die Organismus wird in einem Nährmedium wachsen gelassen, das bekannte Nährstoffquellen für Actinomyceten enthält. So wird der Organimus in einem Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, wie z.B. Sucrose, Lactose, Glucose, Rhamnose, Fructose, Glycerin oder lösliche Stärke enthält, gezüchtet. Das Medium sollte auch eine assimilierbare Stickstoffquelle enthalten, wie z.B. Fischmehl, Pepton, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Mais quellwasser, Aminosäuren oder Ammoniumsalze. Anorganische Nährstoffsalze können ebenfalls im Medium vorhanden sein, um Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Phosphat, Sulfat, Nitrat, Carbonat und ähnliche Ionen bereitzustellen. Spurenelemente, wie z.B. Kupfer, Mangan, Eisen, Zink usw., werden dem Medium, wenn gewünscht, zugegeben, oder sie können als Verunreinigungen anderer Bestandteile des Mediums vorhanden sein. Zur Herstellung großer Mengen des Antibiotikums werden bevorzugt submerse Bedingungen verwendet, obwohl für die Herstellung von begrenzten Mengen auch Oberflächenkulturen und Flaschen verwendet werden können. Die allgemeinen Verfahren, die für die Kultivierung anderer Actinomyceten verwendet werden, sind erfindungsgemäß anwendbar.
- Die Herstellung der erfindungsgemäßen Antibiotika kann bei irgendeiner Temperatur bewirkt werden, die für ein ausreichendes Wachstum des produzierenden Organismus erförderlich ist, z.B. 18 bis 39 ºC, und wird zweckmäßigerweise bei einer Temperatur von ca. 28 ºC durchgeführt. Die Fermentation kann in Flaschen oder in Laboratonums- oder industriellen Fermentern verschiedener Kapazität durchgeführt werden.
- Wenn eine Tankfermentation verwendet wird, ist es wünschenswert, ein vegetatives Inoculum in einer Nährlösung zu verwenden, indem man ein kleines Volumen des Kulturmediums mit einer Nährbodenkultur, einer Kälte-konservierten Kultur oder einer lyophilisierten Kultur des produzierenden Organismus beimpft. Nachdem man auf diese Weise ein lebensfähiges und aktives Inokulum erhalten hat, wird dieses in den zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antibiotikums in großem Maßstab mit einem Herstellungsmedium beschickten Fermentationstank aseptisch übertragen. Das Medium, in dem das vegetative Inokulum gezüchtet wird, kann das gleiche oder verschieden sein von dem, das im Tank verwendet wird, solange es ein gutes Wachstum des produzierenden Organismus bewirkt und mit dem geeigneten Fluortryptophan ergänzt ist. Außerdem kann mittels eines mechanischen Rührwerkes ein Schütteln/Rühren folgen. Wenn erforderlich, können auch Antischaummittel, wie z.B. Lardöl oder Silikonöl, zugefügt werden. Die Produktion des Antibiotikums wird mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder mittels konventioneller biologischer Tests verfolgt. Im allgemeinen wird eine optimale Herstellung des erfindungsgemäßen Antibiotikums nach Inkubation von ca. 6 Tagen erreicht.
- Die Isolierung und Reinigung der so erhaltenen Derivate kann gemäß konventioneller chromatographischer Verfahren durchgeführt werden.
- Die Verbindungen der Formel IV, V und VIII haben die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:
- Verbindung der Formel IV
- Beschreibung: Hellgelber amorpher Feststoff
- Summenformel: C&sub2;&sub6;H&sub1;&sub9;F&sub2;N&sub3;O&sub7;
- Molekulargewicht: 523,454
- Massenspektrum: Kratos MS 25 Massenspektrometer, FABMS 524 (M + H)&spplus;, 361 (M-162, Verlust von Glucose).
- Ultraviolett-Spektrum: Hewlett Packard 845A Diodenarray- Spectrophotometer. Konzentration 1,0 mg/100 ml MeOH.
- Neutrales λmax nm (E 1%/1 cm): 405, 322(457), 288, 277, 259, 230(348).
- Infrarot-Spektrum: Perkin-Elmer 1800 FTIR Spectrometer. KBr Pellet (cm&supmin;¹): 3340, 2915, 1752, 1708, 1628, 1591, 1484, 1462, 1392, 1331, 1292, 1247, 1191, 1112, 1081, 1052, 947, 904, 795, 762, 752, 752, 511.
- 360 MHz ¹H-NMR: Bruker Model AM-3000-Spektrometer. Duale Kohlenstoff-Protonen-Sonde, 5 mm. Lösungsmittel d&sub6;-DMSO. Beobachtete chemische Verschiebungen (ppm): 11,76 (s,1H), 11,23 (s,1H), 8,85 (dd,1H), 8,77(dd,1H), 8,01(dd,1H), 7,68(dd,1H), 7,46(m,2H), 6,29(d,1H), 6,12(t,1H), 5,45(d,1H), 5,17(d,1H), 4,95(d,1H), 4,07(d,1H), 3,95(m,2H), 3,81(d,1H), 3,59(m,2H).
- 90 MHz¹³C-NMR: Bruker Model AM-3000-Spektrometer. Protonenentkoppeltes Spektrum. Duale Kohlenstoff-Protonen-Sonde, 5 mm. Lösungsmittel d&sub6;-DMSO. Beobachtete chemische Verschiebungen (ppm): 170,9, 170,8, 157,0(d), 157,0(d), 138,6, 137,2, 130,7, 129,2, 121,7(d), 121,4(d), 121,3, 119,6, 116,6, 115,1, 115,0(d), 114,6(d), 113,3(d), 113,2(d), 109,1(d), 109,1(d), 84,8, 78,7, 76,5, 73,2, 67,6, 58,3. Löslichkeit: Löslich in DMSO, DMF, THF, Aceton, EtOAc, MeOH.
- Dünnschichtchromatographie (Rf-Werte): Normale Phase (Silicagel 60); EtOAc: 0,10. EtOAc-MeOH (9:1 v/v): 0,41. Umkehrphase (C&sub1;&sub8;); 0,1M NH&sub4;OAc-MeOH-CH&sub3;CN (2:4:4 v/v): 0,67
- Verbindung der Formel V
- Beschreibung: Hellgelber amorpher Feststoff
- Summenformel: C&sub2;&sub6;H&sub1;&sub9;F&sub2;N&sub3;O&sub7;
- Molekulargewicht: 523,454
- Massenspektrum: Kratos MS 25 Massenspektrometer, FABMS 524 (M + H)&spplus;, 361 (M-162, Verlust von Glucose).
- Ultraviolett-Spektrum: Hewlett Packard 845A Diodenarray- Spectrophotometer. Konzentration 1,0 mg/100 ml MeOH.
- Neutrales λmax nm (E 1%/1 cm): 398(60), 316(640), 280(259), 256(313), 226(526), 204(497).
- Infrarot-Spektrum: Perkin-Elmer 1800 FTIR Spectrometer. KBr Pellet (cm&supmin;¹): 3324, 2927, 1745, 1701, 1623, 1580, 1491, 1471, 1452, 1412, 1384, 1330, 1233, 1172, 1116, 1075, 1048, 1016, 963, 916, 829, 764, 745, 646, 635, 617, 498, 490.
- 360 MHz ¹H-NMR: Bruker Model AM-3000-Spektrometer. Duale Kohlenstoff-Protonen-Sonde, 5 mm. Lösungsmittel d&sub6;-DMSO. Beobachtete chemische Verschiebungen (ppm): 11,77 (s,1H), 11,18 (s,1H), 8,85 (dd,1H), 9,12(dd,1H), 9,05(dd,1H), 7,85(dd,1H), 7,43(dd,1H), 7,23(t,2H), 6,26(d,1H), 6,24(s,1H), 5,31(d,1H), 5,04(d,1H), 3,98(m,2H), 3,87(m,1H), 3,66(s,2H).
- 90 MHz ¹³C-NMR: Bruker Model AM-3000-Spektrometer. Protonenentkoppeltes Spektrum. Duale Kohlenstoff-Protonen-Sonde, 5 mm. Lösungsmittel d&sub6;-DMSO. Beobachtete chemische Verschiebungen (ppm): 170,8, 170,7, 161,8(d), 181,8(d), 143,2(d), 141,5(d), 130,1, 128,7, 126,0(d), 125,9(d), 120,9, 119,3, 118,2, 118,1, 117,7, 116,5, 108,8(d), 108,6(d), 98,9(d), 98,3(d), 84,7, 78,6, 76,5, 73,1, 67,5, 58,3. Löslichkeit: Löslich in DMSO, DMF, THF, MeOH, Aceton, EtOAc.
- Dünnschichtchromatographie (Rf-Werte): Normale Phase (Silicagel 60); EtOAc: 0,40. EtOAc-MeOH (9:1 v/v): 0,63. Umkehrphase (C&sub1;&sub6;); 0,1M NH&sub4;OAc-MeOH-CH&sub3;CN (2:4:4 v/v): 0,60
- Verbindung der Formel VIII
- Beschreibung: Hellgelber amorpher Feststoff
- Summenformel: C&sub2;&sub7;H&sub2;&sub1;F&sub2;N&sub3;O&sub7;
- Molekulargewicht: 537,481
- Massenspektrum: Kratos MS 25 Massenspektrometer, FABMS 538 (M + H)&spplus;, 361 (M-176, Verlust von 4-O-Methylglucose.
- Ultraviolett-Spektrum: Hewlett Packard 8452A Diodenarray- Spectrophotometer. Konzentration 1,2 mg/100 ml MeOH.
- Neutrales λmax nm (E 1%/1 cm): 398(103), 316(1050), 280(387), 256(454), 228(780).
- Infrarot-Spektrum: Perkin-Elmer 1800 FTIR Spectrometer. KBr Pellet (cm&supmin;¹): 3324, 2938, 1747, 1703, 1623, 1580, 1491, 1471, 1452, 1412, 1384, 1330, 1233, 1172, 1140, 1116, 1087, 1054, 963, 918, 828, 764, 649, 635, 618, 498.
- 360 MHz ¹H-NMR: Bruker Model AM-3000-Spektrometer. Duale Kohlenstoff-Protonen-Sonde, 5 mm. Lösungsmittel d&sub6;-DMSO.
- Beobachtete chemische Verschiebungen (ppm): 11,77 (s,1H), 11,18 (s,1H), 9,12(dd,1H), 9,05(dd,1H), 7,88(dd,1H), 7,41(dd,1H), 7,23(m,2H), 6,25(d,1H), 6,24(s,1H), 5,36(dd,1H), 5,31(d,1H), 5,04(d,1H), 3,97(m,2H), 3,60-3,95(m,4H).
- 90 MHz ¹³C-NMR: Bruker Model AM-3000-Spektrometer. Protonenentkoppeltes Spektrum. Duale Kohlenstoff-Protonen-Sonde, 5 mm. Lösungsmittel d&sub6;-DMSO. Beobachtete chemische Verschiebungen (ppm): 170,8, 170,7, 161,8(d), 161,7(d), 143,1(d), 141,5(d), 130,1, 128,7, 126,0(d), 125,9(d), 120,9, 119,4, 118,2, 118,1, 117,7, 116,5, 108,8(d), 108,6(d), 98,7(d), 98,3(d), 84,4, 77,2, 77,2, 76,2, 73,2, 59,9, 58,5 ppm.
- Löslichkeit: Löslich in DMSO, DMF, THF, Aceton, EtOAc, MeOH. Dünnschichtchromatographie (Rf-Werte): Normale Phase (Silicagel 60); EtOAc: 0,72. EtOAc-MeOH (9:1 v/v): 0,89. Umkehrphase (C&sub1;&sub8;); 0,1M NH&sub4;OAc-MeOH-CH&sub3;CN (2:4:4 v/v): 0,59.
- Biologische Eigenschaften:
- Repräsentative erfindungsgemäße Verbindungen wurden gegen transplantierte Mäuse-Leukämie P388 getestet, um die in vivo- Antitumorwirkung zu bestimmen (Tabellen 1-3). CDF&sub1;-Mäuse wurden intraperitoneal ("ip") mit 106 P388 Leukämiezellen, erhalten von DBA/2-Donormäusen&sub1; die diese transplantierbare Mäuseläukemie aufwiesen, implantiert. Die CDF&sub1;-leukämischen Mäuse wurden ip entweder mit Kochsalzlösung (Kontrollmäuse) oder Dosen der Verbindung der Formeln IV, V und VIII einmal am Tag 1 der post-Tumor-Inokulation behandelt. Diese Tiere wurden täglich beobachtet und ihr Tod aufgezeichnet. Als Mittel zur Erfassung der Wirkstofftoxizität wurden die Veränderungen des durchschnittlichen Körpergewichtes (vom Tag der Leukämie-Implantation bis zum Tag der letzten Behandlung) für alle Gruppen bestimmt. Als zusätzliches Mittel zur Einschätzung der Wirkstofftoxizität wurde die Zahl der lebenden Mäuse jeder Gruppe am Tag 5 nach der Tumorimplantation aufgezeichnet. Wenn mehr als eine Maus pro Behandlungsgruppe am Tag 5 gestorben war, wurde das therapeutische Ergebnis als nicht bedeutungsvoll angesehen. Jede Behandlungsgruppe bestand aus 4 bis 6 Mäusen; die Kontrollgruppen enthielten 10 Mäuse. Die Zahl der Mäuse, die bis zum Tag 30 (dem ersten Tag des Experiments) überlebten, wurde ebenfalls aufgezeichnet.
- Die therapeutische Wirksamkeit wurde ermittelt, indem man die mittlere Überlebenszeit ("MST") der mit den Verbindungen der Formeln IV, V und VIII behandelten Mäuse bestimmte und mit der MST von parallelen Kontrollmäusen verglich. Dieser Vergleich wurde durchgeführt, indem man die MST der ersten Gruppe durch die der letzten Gruppe dividierte und mit 100 multiplizierte, um einen als T/C-Prozentwert bezeichneten Parameter abzuleiten. Ein T/C-Prozentwert von ≥125% wurde als bedeutsamer Anstieg der Lebensdauer betrachtet, und deshalb als ein eine Wirksamkeit darstellendes Ergebnis.
- Wie in Tabelle 1 angegeben, ist die Verbindung der Formel IV gegen P388 Leukämie bei Dosismengen im Bereich von 10 bis 90 mg/kg wirksam. Die beste Wirkung wurde bei einer Dosis von 30 mg/kg erzielt und ergab einen T/C-Prozentwert von 175 %. Eine Toxizität wurde sogar bei der höchsten getesteten Dosis (90 mg/kg) nicht beobachtet.
- Wie die Tabelle 2 zeigt, ist die Verbindung der Formel V bei Dosen im Bereich von 0,8 bis 102,4 mg/kg gegen P388-Leukämie wirksam. Die beste Wirkung wurde bei einer Dosis von 102,4 mg/kg erreicht und zeigte einen T/C-Prozentwert von 178 %. Selbst bei der höchsten getesteten Dosis (102,4 mg/kg) wurde keine Toxizität beobachtet.
- Wie die Tabelle 3 zeigt, ist die Verbindung der Formel VIII bei Dosen im Bereich von 0,8 bis 102,4 mg/kg gegen P388- Leukämie wirksam. Die beste Wirkung wurde bei einer Dosis von 51,2 mg/kg erzielt und zeigte einen T/C-Prozentwert von 206 %. Selbst bei der höchsten getesteten Dosis (102,4 mg/kg) wurde keine Toxizität beobachtet. Tabelle 1 Wirksamkeit der Verbindung der Formel IV auf P388 Leukämiea (Tag 1 Behandlung)
- a Den Mäusen wurden 10&sup6; P388 Leukämiezellen implantiert, und die Behandlungen mit der Verbindung der Formel IV würde einen Tag später begonnen. Den Kontrollmäusen wurden Kochsalz-Injektionen verabreicht. Tabelle 2 Wirksamkeit der Verbindung der Formel V auf P388 Leukämie (Tag 1 Behandlung)
- a Den Mäusen wurden 10&sup6; P388 Leukämiezellen implantiert, und die Behandlungen mit der Verbindung der Formel V wurde einen Tag später begonnen. Den Kontrollmäusen wurden Kochsalz-Injektionen verabreicht. Tabelle 3 Wirksamkeit der Verbindung der Formel VIII auf P388 Leukämiea (Tag 1 Behandlung)
- a Den Mäusen wurden 10&sup6; P388 Leukämiezellen implantiert, und die Behandlungen mit der Verbindung der Formel VIII wurde einen Tag später begonnen. Den Kontrollmäusen wurden Kochsalz-Injektionen verabreicht.
- In den Rahmen der vorliegenden Erfindung fallen auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame oder Tumor-inhibierende Menge eines erfindungsgemäßen Rebeccamycin-Analogons, oder ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz davon, in Kombination mit einem inerten pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, umfassen.
- Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Antibiotikums oder eines pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur therapeutischen Behandlung eines tierischen (vorzugsweise Säugetier) Wirts.
- Beispiele für geeignete Zusammensetzungen umfassen feste Zusammensetzungen für die orale Verabreichung, wie z.B. Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver und Granulate, flüssige Zusammensetzung für die orale Verabreichung, wie z.B. Lösungen, Suspensionen, Syrupe und Elixire, und Präparate zur parenteralen Verabreichung, wie z.B. sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie können auch in Form steriler fester Zusammensetzungen hergestellt werden, die in sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einem anderen sterilen injizierbaren Medien kurz vor der Verwendung aufgelöst werden können.
- Es ist klar, daß die tatsächlichen bevorzugten Dosierungen der erfindungsgemäßen Rebeccamycin-Analoga variieren werden, abhängig von der speziellen verwendeten Verbindung, der speziellen Formulierung der Zusammensetzung, der Verabreichungsart und der speziellen Verabreichungsstelle, dem Wirt und der zu behandelnden Krankheit. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird die vielen Faktoren, die die Wirkung des Mittels modifizieren können, in Betracht ziehen, z.B. das Alter, das Körpergewicht, das Geschlecht, die Nahrung, die Zeit der Verabreichung, die Ausscheidungsrate, den Zustand des Patienten, die Wirkstoffkombinationen, die Empfindlichkeit und die Schwere der Erkrankung. Die Verabreichung kann kontiniuierlich oder periodisch innerhalb der maximal tolerierten Dosis durchgeführt werden. Ein Fachmann auf diesem Gebiet kann unter Verwendung üblicher Dosisbestimmungstests leicht die optimalen Anwendungsraten für bestimmte vorliegende Bedingungen bestimmen.
- Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die den Rahmen der Erfindung keinesfalls beschränken.
- Saccharothrix aerocolonigenes Stamm C38,383-RK2 wurde in einer Revco-Ultratieftemperaturgefriervorrichtung gelagert. Um eine Kälte-konservierte Kultur herzustellen, wurde Stamm 038,383-RK2 in Teströhrchen auf Nährböden aus Hefe-Malz- Extrakt-Agar, ergänzt mit CaCO&sub3;, bestehend aus
- Dextrose 4,0 g
- Hefeextrakt 4,0 g
- Malz-Extrakt 10 g
- CaCO&sub3; 1,5 g
- Agar 15 g
- Deionisiertes Wasser auf 1 l
- übertragen.
- Der Agarnährboden wurde bei 28 ºC 7-10 Tage lang inkubiert. Eine vegetative Kultur wurde hergestellt durch Übertragung des Oberflächenwachstums von der Nährbodenkultur in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben, der 100 ml eines sterilen vegetativen Mediums enthielt, bestehend aus
- Cerelose (Corn Products) 30 g
- Pharmamedia (Traders Oil Mill Co.) 10 g
- Nutrisoy (Archer Daniels Midland Co.) 10 g
- CaCO&sub3; 3 g
- Deionisiertes Wasser auf 1 l
- Diese vegetative Kultur wurde bei 28 ºC während 48 Stunden auf einem Schüttelrotor bei 250 Umdrehungen/min inkubiert. Die vegetative Kultur wurde mit einem gleichen Volumen an Kälte-konservierter Lösung aus
- Sucrose 100 g
- Glyerin 200 g
- Deionisiertes Wasser auf 1 l
- gemischt
- Portionen von 4 ml dieser Mischung wurden in ein steriles Tieftemperatur-Gefäß (5 ml Inhalt, Corning) übertragen und in einem Trockeneis/Aceton-Bad tiefgefroren. Die tiefgeforenen vegetativen Kulturen wurden dann bei -80 ºC in einer Revco-Ultratieftemperaturgefriervorrichtung gelagert.
- Die vegetative Kultur wurde hergestellt durch Übertragung von 4 ml der Kälte-konservierten Kultur in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben, der 100 ml eines sterilen vegetativen Mediums mit der gleichen Zusammensetzung wie der des im Beispiel 1 beschriebenen vegetativen Mediums enthielt. Die vegetative Kultur wurde bei 28 ºC 48 Stunden lang auf einem Schüttelrotor mit 250 Umdrehungen/min inkubiert.
- 3 ml der vegetativen Kultur des Beispiels 2 wurden in 500 ml Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 100 ml des folgenden Produktionsmediums enthielten, inokuliert
- Staclipse J-UP-Stärke (A.E. Staley) 10 g
- KH&sub2;PO&sub4; 2 g
- MgSO&sub4; 1 g
- L-Threonin 2,5 g
- CaCO&sub3; 2 g
- Deionisiertes Wasser auf 1 l
- Die Produktionskultur wurde auf einem Schüttelrotor bei 250 Umdrehungen/min bei 28 ºC inkubiert. Nach 48- stündiger Fermentation wurde DL-5-Fluortryptophan zur Kultur bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben. Die Kultur wurde bei 28 ºC unter Schütteln bei 250 Umdrehungen/min während weiterer 4 Tage inkubiert. Die Produktion der Verbindung der Formel IV wurde mittels HPLC verfolgt. Die optimale Produktion der Verbindung der Formel IV bei einer Konzentration von 23-32 mg/ml wurde im allgemeinen nach 6 Tagen Fermentation erhalten (d.h. 4 Tage nach Zugabe des DL-5-Fluortryptophan).
- 3 ml der vegetativen Kultur des Beispiels 2 wurde in 500 ml Erlenmeyer-Kolben, von denen jeder 100 ml des Produktionsmediums mit der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 3 beschrieben enthielt, inokuliert.
- Die Produktionskultur wurde bei 28 ºC auf einem Schüttelrotor bei 250 Umdrehungen/min inkubiert. Nach 48-stündiger Fermentation wurde DL-6-Fluortryptophan bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zur Kultur zugegeben. Die Kultur wurde zusätzliche 4 Tage bei 28 C unter Schütteln bei 250 Umdrehungen/min inkubiert. Die Produktion der Verbindungen der Formel V und VIII wurde mittels HPLC verfolgt. Die optimale Produktion der Verbindung der Formel V und VIII wurde im allgemeinen nach 6-tägiger Fermentation (d.h. 4 Tage nach Zugabe von DL-6-Fluortryptophan) bei einer Konzentration von 36-58 µg/ml bzw. 31-42 µg/ml beobachtet.
- Die Lösungsmittel wurden vor der Verwendung nicht redestilliert. Methanol, Aceton, Ethylacetat, Isopropylether, Chloroform, Tetrahydrofuran, Ethylether und Hexan waren von ACS-Reagensqualität. Wasser für die HPLC bezeichnet innerbetriebliches deionisiertes Wasser aus einem Barnstead Nanopure II-System. Tetrahydrofuran, Methanol und Acetonitril für die HPLC waren Lösungsmittel mit B&J Brand HPLC-Qualität. Ammoniumacetat war von Fisher HPLC-Qualität.
- Die Normalphasen-Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde an Silicagel 60, F-254-Platten (EM Reagentien, Cat. #5765, 5x10 cm, 0,25 mm dick) durchgeführt. Die Umkehrphasen-TLC wurde mit Whatman MKC&sub1;&sub8;-Platten (Cat. #4803-110, 0,2 mm dick) durchgeführt. Die Platten wurden in zylindrischen Whatman- Gefäßen mit Deckeln und 10 ml Elutionsmittel entwickelt. Rebeccamycin-Analoge wurden im normalen Licht als gelbe Zonen sichtbar, oder als gelb fluorizierende Zonen im 254 nm oder 366 nin Ultraviolettlicht.
- Zu den vollständigen Kulturlösungen wurde Dicalite (speed plus)-Filterhilfsmittel zugegeben. Nach kurzem Rühren wurden die Kulturlösungen an großen Büchner-Trichtern oder an einer Tolhurst Centerslung Centrifugal Filter Unit (Model 1815, Ametek, Inc.) filtriert. Die Filtrate wurden verworfen. Die Mycel-Filterhäute wurden in THF oder THF-Aceton-Mischungen eine Stunde lang gerührt, abfiltriert, und das Dicalite außerdem mit Aceton gespült, bis es unter UV-Licht nicht mehr gelb fluoreszierte. Die vereinigten Filtrate wurden unter vermindertem Druck eingedampft und rohe Extrakte erhalten.
- Eine Vakuum-Flüssigchromatographie (VLC)-Vorrichtung besteht aus einem Büchner-Trichter (Kontes, Art. #K-954100), der eine eingeschmolzene gesinterte Glasscheibe (M-Porosität) enthielt eine seitliche Schlauchverbindung für Vakuum und eine untere 24/40-Verbindung zum Anbringen von Aufnahmebehältern. Zunächst wurden die am wenigsten polaren Elutionslösungsmittel unter Vakuum durchgesaugt, um eine dicht gepackte 5 cm hohe Absorptionsmittelschicht auszubilden. Proben wurden auf Absorptionsmittel vorabsorbiert und auf die Trichter als Aufschlämmungen aufgebracht, oder in einer Lösung des am wenigsten polaren Elutionslösungsmittel. Es wurde eine stufenweise Gradientenelution durchgeführt, wobei bestimme Volumina von Elutionsmitteln steigender Polarität die Fraktionen bildeten. Der Trichter wurde nach jedem Elutionsmittelvolumen trockengesaugt. Die Fraktionen wurden eingedampft und auf der Basis einer TLC-Analyse vereinigt.
- Die Vorrichtung für die Ausschußchromatographie bestand aus den folgenden Komponenten: einer Glenco-Säule (2,5 I.D. x 100 cm), ausgestattet mit Lösungsmittel-beständigem Teflon und Platten; einer Fluid Metering, Inc. FMI- Laboratoriumspumpe (Model RP-G150); einem Glenco- Glassbehälter (500 ml); einem Isco Model 328-Fraktionssammler. Die Säulen wurden mit einer Aufschlämmung von in Elutionsmittel vorgequollenem Sephadex LH-20 (Pharmacia) beschickt. Das Lösungsmittel wurde durch die Säule abwärts mit einer durch die Laboratoriumspumpe gesteuerten Geschwindigkeit hindurchgeführt.
- Die folgenden Komponenten wurden verwendet, um ein halbpräparatives HPLC-System zu erstellen; eine Waters Assodates Model 590 Solvent Delivery System-Pumpe; ein Knauer Model 87 Variable Wavelength Detector; ein Waters Associates Model SR-204 Strip Chart Recorder (Schreibstreifengerät); eine Whatman Partisil 10 ODS-3-Säule (10 mm x 50 cm); eine Rohrleitung aus rostfreiem Stahl (316 stainless steel) (0,23 mm Innendurchmesser).
- Die gesamte Kulturlösung (5 l) wurde mit Dicalite filtriert und die Mycelhaut durch Rühren in THF (2 l) während 1 Stunde extrahiert. Nach nochmaligem Filtrieren und einer zusätzlichen Spülung mit THF (1 l) wurden die vereinigten Filtrate unter vermindertem Druck eingedampft und ergaben 4,5 g Rdhextrakt. Der Extrakt wurde an 6,5 g Lichroprep SI 60 Silicagel (EM Science, Art. 9336 15-25 µm) absorbiert und in einen 60 ml VLC-Trichter, der zusätzliche 24,5 g Silicagel enthielt, aufgebracht. Es wurde eine Hexan-Ethylacetat- Gradientenelution durchgeführt (200 ml Volumina), gefolgt von einer Waschung mit 200 ml THF. Die THF-Waschung (156 mg) wurde in 4 ml THF gelöst und auf eine Säule, die 160 g mit THF equilibriertes Sephadex LH-20 enthielt (Schichtenhöhe 90 cm, Schichtvolumen 430 ml) aufgebracht.
- Durchflußgeschwindigkeit 3,75 ml/min. Visuell konnte eine gelbe Hauptbande (62 mg), die in dem ersten Viertel des zweiten Schichtvolumens eluiert wurde, festgestellt werden. Die Endreinigung wurde mittels Umkehrphasen (C18)-HPLC- Chromatographie mit einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min (0,1 M NH&sub4;OAc-THF (60-40)) durchgeführt. Die Bestimmung wurde bei 320 nm durchgeführt. Bei 39 Minuten eluierte die Hauptkomponente (23 mg), bezeichnet als Verbindung der Formel IV.
- Die vollständige Kulturlösung (2 l) wurde unter Verwendung von Dicalite-Filterhilfsmittel filtriert. Die Mycel-Haut wurde nach Rühren in THF (2 l) während 45 Minuten futriert, und mit einem zusätzlichen Volumen an THF (1,5 l) gespült. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft und ergab 3,39 g Rohextrakt. Der Rohextrakt wurde mit 5 x 50 ml Volumina THF verrieben, die vereinigt und eingedampft wurden und 0,74 g von THF-löslichem Rückstand ergaben. Diese Masse enthielt die Hauptmenge der gelb-fluoreszierenden Materialien. Das THF-lösliche Material wurde auf 2 g Silicagel H (Merck, 10-40 µm) absorbiert und auf einen 30 ml VLC-Trichter, der zusätzliche 11 g Silicagel H enthielt, aufgebracht. Unter Verwendung von 100 ml-Volumina Elutionsmittel wurde eine Hexan/Ethylacetat-Gradientenelution durchgeführt. Auf diese Weise wurden die beiden Rebeccamycin- Analogen sauber getrennt. Die weniger polare gelbe Zone (141 mg) eluierte mit Hexan-Ethylacetat (1:1) und das polarere Analoge (105 mg) mit Hexan-Ethylacetat (1:3).
- Das polare Analoge (105 mg) wurde in 2 ml THF gelöst und auf eine Säule, die 180 g in THF vorgequollenes Sephadex LH-20 (Schichthöhe 90 cm, Schichtvolumen 430 ml) enthielt, aufgebracht. Die Fließgeschwindigkeit betrug 4 ml/min. Die bei 1,25-Schichtvolumina eluierte gelbe Hauptbande konnte visuell bestimmt werden, und ergab die Verbindung der Formel V (77 mg).
- Das weniger polare Analoge von VLC (141 mg) wurde in 2 ml MeOH gelöst und auf eine Säule aufgebracht, die 110 g in MeOH vorgequollenes Sephadex LH-20 (Schichthöhe 80 cm, Schichtvolumen 400 ml) enthielt. Die Fließgeschwindigkeit betrug 3,5 ml/min. Die am Ende des vierten Schichtvolumens eluierte gelbe Hauptzone ergab die Verbindung der Formel VIII (70 mg).
Claims (9)
1. Rebeccamycin-Analoga der Formel:
worin X&sub1; und X&sub2; unabhängig voneinander für Fluor oder
Wasserstoff stehen, vorausgesetzt, daß X&sub1; und X&sub2; nicht
gleichzeitig für Wasserstoff stehen, sowie pharmazeutisch
verträgliche Säureadditionssalze davon.
2. Rebeccamycin-Analoga der Formel:
worin X&sub1; und X&sub2; unabhängig voneinander für Fluor oder
Wasserstoff stehen, vorausgesetzt, daß X&sub1; und X&sub2; nicht
gleichzeitig für Wasserstoff stehen, sowie pharmazeutisch
verträgliche Säureadditionssalze davon.
3. Verbindungen nach Anspruch 1 der folgenden Formeln:
4. Verbindungen nach Anspruch 2 der folgenden Formeln:
5. Verfahren zur Herstellung der Rebeccamycin-Analoga der
Ansprüche 1 bis 4 oder eines pharmazeutisch verträglichen
Säureadditionssalzes davon, wobei man einen
Rebeccamycinproduzierenden Saccharothrix aerocolonigenes-Stamm in
einem wäßrigen Nährmedium in Gegenwart von
DL-4-Fluortryptophan, DL-5-Fluortryptophan, DL-6-Fluortryptophan
oder DL-7-Fluortryptophan so lange kultiviert, bis der
Organismus in dem Kulturmedium eine bedeutende Menge des
gewünschten Rebeccamycin-Analogons produziert hat, und das
gewünschte Rebeccamycin-Analogon in im wesentlichen reiner
Form aus dem Kulturmedium gewinnt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der
Rebeccamycinproduzierende Stamm Saccharothrix aerocolonigenes ATCC
39243 ist.
7. Pharmazeutisches Mittel, umfassend eine wirksame,
Tumorinhibierende Menge wenigstens einer Verbindung nach einem
der Ansprüche 1 bis 4, die mit einem pharmazeutisch
verträglichen, im wesentlichen nicht-toxischen Träger oder
Exzipienten assoziiert ist.
8. Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels
nach Anspruch 7, wobei man wenigstens eine Verbindung nach
einem der Ansprüche 1 bis 4 in einem pharmazeutisch
verträglichen, im wesentlichen nicht-toxischen Träger oder
Exzipienten aufnimmt.
9. Verwendung wenigstens einer Verbindung nach einem der
Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines pharmazeutischen
Mittels zur therapeutischen Behandlung eines von einem
Tumor befallenen Wirtssäugetiers.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48943090A | 1990-03-06 | 1990-03-06 | |
| US64875191A | 1991-02-05 | 1991-02-05 |
Publications (2)
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