DE3436137C2

DE3436137C2 - Antibiotika BBM-2478A und BBM-2478B, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Mittel

Info

Publication number: DE3436137C2
Application number: DE3436137A
Authority: DE
Inventors: Masataka Konishi; Koko Sugawara; Takeo Miyaki; Hiroshi Kawaguchi
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1983-10-03
Filing date: 1984-10-02
Publication date: 1993-12-02
Anticipated expiration: 2004-10-03
Also published as: IT8422961A0; CY1534A; GR80551B; IE57825B1; ES536455A0; US4518589A; FI79141C; AU3354884A; SE460481B; SE8404929L; ZA847723B; IT1176854B; NL8403002A; FR2555586B1; PT79310B; MY101664A; GB8424810D0; PT79310A; AT381507B; IE842511L

Description

Die Erfindung betrifft die Antibiotika BBM-2478A und B, Verfahren zu deren Herstellung und diese Antibiotika enthaltende pharmazeutische Mittel.

Erfindungsgemäß werden zwei antibiotisch wirksame Verbindungen bereitgestellt, die Glokoside darstellen. Diese Glykoside bestehen aus einem Aglykon, nämlich Chartarin, d. h. dem Aglykon von Chartreusin, und einer oder zwei Zuckereinheiten. Das Antibiotikum BBM-2478B weist eine Zuckereinheit der Formel

auf, die an das Aglykon gebunden ist. Das andere erfindungsgemäße Antibiotikum BBM 2478A hingegen weist zusätzlich die Aminozuckereinheit der folgenden Formel auf:

Das antibiotisch wirksame Chartreusin ist beispielsweise beschrieben in J. Am. Chem. Soc. 75: 4011-4012 (1953) und Helv. Chim. Acta 47: 1459-1484 (1964). Es weist denselben Aglykonteil auf wie die erfindungsgemäßen Antibiotika, enthält jedoch zwei andere Zuckereinheiten, d. h. D-Fucose und D-Digitalose. Chartreusin besitzt folgende Strukturformel:

Chartreusin kann man durch Fermentation von Streptomyces chartreusis, Streptomyces Sp. Nr. 747 (S. viridis), Streptomyces Sp. 6A36 (S. viridochromogenes) und zweier Actinomycetesstämme, die mit streptomyces Sp. X-3988 und S-465 bezeichnet sind. Chartreusin ist dieselbe Verbindung wie das Antibiotikum 747 und das Antibiotikum X-465A.

Gegenstand der Erfindung ist ein antibiotisch wirksamer Komplex, der mit BBM-2478 bezeichnet ist. Diesen Komplex erhält man durch Kultivieren eines Actinomycetesstammes, der mit Stamm J907-21 (ATCC 39 417) bezeichnet ist, oder durch Kultivieren von Varianten oder Mutanten davon in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält. Die Kultivierung führt man bei submersen aeroben Bedingungen durch, bis man eine erhebliche Menge des BBM-2478-Komplexes in dem genannten Kulturmedium erhalten hat. Anschließend gewinnt man den BBM-2478-Komplex aus dem Kulturmedium. Dieser BBM-2478- Komplex enthält zwei bioaktive Bestandteile, nämlich die Antibiotika BBM-2478A und BBM-2478B, die man mit Hilfe üblicher chromatographischer Verfahren auftrennen und im in wesentlichen reiner Form isolieren kann.

BBM-2478A und B wirken antibakteriell gegen aerobe, grampositive Bakterien und anaerobe Bakterien. BBM-2478A inhibiert auch das Wachstum maligner Tumore bei experimentell erzeugten Tiertumoren.

Von den Figuren zeigt

Fig. 1 das Infrarotspektrum von BBM-2478A,

Fig. 2 das Infrarotspektrum von BBM-2478B,

Fig. 3 das ¹H-NMR-Spektrum (80 MHz) von BBM-2478A in CD₃OD und

Fig. 4 das ¹³C-NMR-Spektrum (20 MHz) von BBM-2478A in d₆-DMSO.

Gegenstand der Erfindung sind somit antibiotisch wirksame Glykoside, die in der vorliegenden Anmeldung mit BBM-2478A und BBM-2478B bezeichnet sind. Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zu deren Herstellung durch Fermentation eines Actinomycetesstammes, der mit Stamm J907-21 bezeichnet ist. Dieser produzierende Organismus wurde aus einer Bodenprobe isoliert, welche in El Salvador gefunden wurde. Dieser Sturm ist derzeit nur insofern klassifiziert worden, als daß es sich um einen nicht-Streptomyces Actinomycetesstamm handelt. Eine biologisch reine Kultur dieses Organismus wurde auf übliche Weise hergestellt und bei der American Type Culture Collection, Washington, D.C., unter der Nummer ATCC 39417 hinterlegt.

Taxonomie der produzierenden Kultur

Der Stamm J907-21 bildet häufig verzweigte, nicht-fragmentierende vegetative Mycele aus, ist jedoch nicht in der Lage, ein richtiges Luftmycel zu tragen. Dieser Stamm bildet, soweit bis jetzt festgestellt wurde, keine Sporen aus. Da dieser Stamm meso-Diaminopimelinsäure in der Zellwand und Madurose in dem Hydrolysat der gesamten Zelle enthält, wird dieser Stamm J907-21 als "Zellwand Typ III_B" eingeordnet. Der Stamm J907-21 trägt keine morphologisch ausgeprägten Körper, wie eine Sporenkette oder ein Sporangium. Der Stamm J907-21 kann daher derzeit nur als nicht-Streptomyces Actinomycetesstamm klassifiziert werden.

Morphologie

Der Stamm J907-21 bildet lange, häufig verzweigte vegetative Mycele (0,4 µm breit), die nicht in stab- oder coccenförmige Zellen fragmentieren. Auf einigen Agarmedien bilden sich gelegentlich rudimentäre kurze Luftmycele, ein richtiges Luftmycel bildet sich jedoch auf allen beschriebenen Medien nicht aus. Soweit festgestellt wurde, bilden sich keine Sporen-bildenden Körper und Sporen aus.

Eigenschaften der Kultur

Der Stamm wächst, wie in der Tabelle 1 gezeigt, auf natürlichen organischen Medien mäßig, während er auf den meisten chemisch definierten Medien nur wenig wächst. Obwohl der Stamm J907-21 kein wirkliches Luftmycel ausbildet, bilden sich auf den ISP-Nummern 2 und 4 Medien und Bennett′s Agar rudimentäre kurze Luftmycele teilweise aus. Auch auf dem ISP-Nummer 7 Medium, dem Cobalamin oder ein Vitaminkomplex zugegeben worden war, bildet sich ebenfalls ein rudimentäres Luftmycel aus. Auf den meisten Agarmedien ist die rückseitige Farbe der vegetativen Mycele schwach gelb bis braun (verschiedene Schattierungen). Auf dem ISP-Nummer 2 Medium und VDYA (V8 juice-dextrose-yeast extract agar) bildet sich ein tiefrotes Mycelpigment. Auf den ISP-Nr. 1, 6 und 7 Medien bildet sich kein melanoides Pigment. Die Kolonie auf ISP- Nr. 2 Medium ist sehr hoch, steif und gefaltet.

Physiologische Charakteristika

Bei 28°C und 37°C ist das Wachstum am größten. Bei 7°C und 45°C findet kein Wachstum statt. Ein Wachstum findet somit zwischen 15°C und 43°C statt. Aus L-3,4- Dihydroxy-phenylalanin (L-DOPA) wird kein Melanin gebildet- Der Stamm J907-21 verträgt die Anwesenheit von Natriumchlorid in einer Konzentration von 4% oder weniger, jedoch nicht in einer Konzentration von 5%. Er ist ferner empfindlich gegenüber Lysozym. Der Stamm J907-21 verwertet fast alle Pentosen und Hexosen. Die physiologischen Charakteristika und die Verwertung von Kohlenhydraten sind in den Tabellen 2 und 3 gezeigt.

Aminosäuren in der Zellwand und Zuckerbestandteile in der gesamten Zelle

Die Zusammensetzung der Aminosäuren in der Zellwand wurde untersucht nach den Verfahren, die beschrieben sind von Becker et al. in appl. Microbiol. 13: 236-243 (1965) und von Yamaguchi in J. Bacteriol. 89: 444-453 (1965). Die Zusammensetzung wurde ferner mit Hilfe einer Aminosäureanalysiervorrichtung bestimmt. Die Zuckerbestandteile des Hydrolysats der gesamten Zelle wurden nach den Verfahren identifiziert, die beschrieben sind von Lechevalier und Lechevalier in Chemical Methods As Criteria For the Separation Of Norcardiae From Other Actinomycetes, Biology Of The Actinomycetes And Related Organismus 11: 78-92 (1976). Die Zellwand vom Stamm J907-21 enthält meso-Diaminopimelinsäure und geringe Mengen Glycin. In dem Hydrolysat der gesamten Zelle sind Glykose, Mannose, Madurose und Ribose vorhanden. Aufgrund der oben aufgeführten Zusammensetzung der Zellwand und der Zuckerbestandteile der gesamten Zelle gehört der Stamm J907-21 zu dem Zellwandtyp III_B.

Taxonomie

Der Stamm J907-21 ist ein mesophiler, gram-positiver Actinomycetesstamm, der gelegentlich rudimentäre kurze Luftmycele ausbildet, jedoch nicht die Fähigkeit besitzt, ein wirkliches Luftmycel, einen sporentragenden Körper und Sporen zu bilden. Der Stamm J907-21 hat eine Zellwand vom Typ III_B. Bekannte Actinomycetesstämme mit der Zellwand vom Typ III_B sind beispielsweise die Genera Actinomadura, Microbispora, Streptosporangium, Spirillospora, Planomonospora, Planobispora und Dermatophilus.

Das vegetative Mycel vom Genus Dermatophilus, das von seiner Art her ein obligater Krankheitserreger für Tiere ist, besitzt sowohl quer- als auch längsverlaufende Septa. Der Stamm J907-21 unterscheidet sich somit deutlich von dem Genus Dermatophilus. Die übrigen sechs Genera sind dadurch charakterisiert, daß sie auf dem Luftmycel Sporenträger (Sporangium) oder Arthrosporen tragen. Es wurde berichtet, daß viele Stämme dieser sechs Genera im Gegensatz zu den Streptomycesspezien bei der Sporulation mehr oder weniger wählerisch sind. Der Stamm J907-21 gehört daher wahrscheinlich zu einem der oben genannten sechs Genera. Es wurde berichtet, daß der Genus Actinomadura, der zu den genannten sechs Genera gehört, an vielen Stellen in der Welt im Erdreich gefunden werden kann. Gordon beschreibt im J. Gen. Microbiol. 109: 69-78 (1978) die physiologische Charakterisierung von 14 Taxonomien von Nocardiae induzierenden Actinomadura madurae. Auf Basis der physiologischen Untersuchungen von Gordon wurde der Stamm J907-21 mit A. madurae (Tabelle 4) verglichen. Der Stamm J907-21 ist mit Actinomadura madurae (Ähnlichkeit von 85,7%) mehr verwandt als mit den anderen mit den Zelltypen III_C und IV (Ähnlichkeit: 54,8% bis 76,9%). Jedoch wurden die physiologischen Verwandtschaften unter den sechs Genera vom Zellwandtyp III_B nicht untersucht, da sie sich morphologisch klar voneinander unterscheiden. Der Stamm J907-21 kann somit nur als nicht sporenbildender nicht-Streptomycesstamm klassifiziert werden.

Tabelle 1

Charakteristika* der Kultur des Stammes Nr. J907-21

Tabelle 2

Physiologische Charakteristika des Stammes Nr. J907-21

Tabelle 3

Verwertung von Kohlenhydraten durch den Stamm Nr. J907-21

Tabelle 4

Vergleich der diagnostischen physiologischen Eigenschaften von Stamm J907-21 und Actinomadura madurae

Wie auch bei anderen Organismen können die Charakteristika des Stammes J907-21 verändert werden. So kann man beispielsweise künstliche Varianten und Mutanten des Stammes J907-21 durch Behandlung mit verschiedenen bekannten Mutagenen erhalten. Dazu zählen beispielsweise UV-Strahlen, Röntgenstrahlen, Wellen hoher Frequenz, radioaktive Strahlen und Chemikalien. Erfindungsgemäß werden alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten (im folgenden als Mutanten bezeichnet) des Stammes J907-21, die das Antibiotikum BBM-2478 produzieren, umfaßt.

Herstellung der Antibiotika

Die erfindungsgemäßen Antibiotika BBM-2478 kann man herstellen, indem man den Stamm J907-21 (ATCC 39 417) oder einen BBM-2478-produzierenden Mutanten davon bei submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert. Den produzierenden Organismus läßt man in einem Nährmedium wachsen, das assimilierbare Kohlenstoffquellen enthält, beispielsweise assimilierbare Kohlenhydrate. Als Beispiele geeigneter Kohlenstoffquellen kann man nennen. Glycerin, Arabinose, Xylose, Glukose, Fruktose, Mannose, lösliche Stärke, Mannit und Zellobiose. Das Nährmedium sollte auch eine assimilierbare Stickstoffquelle enthalten, beispielsweise Fischmehl, Soyabohnenmehl, Maisquellwasser, Peptone, Fleischextrakt, Erdnußmehl, Hefeextrakt oder Ammoniumsalze. Falls erforderlich, können auch anorganische Salze, beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat oder Phosphat hinzugegeben werden. Spurenelemente, beispielsweise Kupfer, Mangan, Eisen oder Zink können gewünschtenfalls zu dem Medium gegeben werden. Sie können jedoch auch in Form von Verunreinigungen der anderen Bestandteile der Medien zugegeben werden. Als Inkubationstemperatur wählt man jede Temperatur, bei der der produzierende Stamm wachsen kann, z. B. von 15°C bis 43°C. Vorzugsweise führt man die Fermentation bei 25 bis 35°C, insbesondere bevorzugt bei 27 bis 32°C durch. Ein neutraler oder fast neutraler pH des Mediums ist bevorzugt. Man kultiviert im allgemeinen etwa 6 bis 10 Tage. Eine optimale Produktion erreicht man gewöhnlich in etwa 6 bis 7 Tagen. Zur Herstellung verhältnismäßig geringer Mengen kann man Schüttelflaschen- und Oberflächenkulturen einsetzen. Für die Herstellung größerer Mengen verwendet man vorzugsweise eine submerse aerobe Kultur in sterilen Tanks. Führt man eine Tankfermentation durch, dann ist es wünschenswert, ein vegetatives Inocolum in einer Nährbrühe herzustellen, indem man die Kulturbrühe mit einer Spore des Organismus animpft. Hat man ein junges aktives vegetatives Inocolum errhalten, dann überführt man das Inoculum aseptisch in das Medium des Fermentationstanks. Die Tanks und Flaschen kann man dadurch belüften, daß man sterile Luft durch oder auf die Oberfläche des Fermentationsmediums leitet. Man kann außerdem durch einen mechanischen Rührer rühren. Man kann auch Antischaummittel, beispielsweise Specköl zugeben, falls dies erforderlich ist.

Die Produktion von BBM-2478 in dem Fermentationsmedium kann man während der Fermentation bequem durch einen Papier-Disk-Agardiffusionsassay unter Verwendung von Micrococcus luteus PCI 1001 Testorganismus verfolgen.

Isolierung der BBM-2478 Antibiotika

Nachdem man eine optimal wirksame Brühe erhalten hat, trennt man das Mycel und ungelöste Bestandteile nach üblichen Verfahren, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, von der Fermentationsbrühe ab. Die Antibiotika in dem Mycelkuchen kann man dadurch gewinnen, daß man die Mycelkuchen mit Methanol extrahiert, unlösliche Bestandteile abfiltriert und den Methanolextrakt zu einer wäßrigen Lösung konzentriert. Die aktiven Bestandteile in der überstehenden Brühe kann man gewinnen, indem man mit n-Butanol extrahiert und den Butanolextrakt zu einer wäßrigen Lösung konzentriert. Die wäßrigen, die BBM-2478A und B Antibiotika enthaltenden Methanol- und Butanolextrakte kann man dann nach üblichen chromatographischen Verfahren reinigen, wobei man gereinigtes BBM-2478A und B erhält. Ein bevorzugtes Reinigungsverfahren ist im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben.

Physiko-chemische Eigenschaften der BBM-2478 Antibiotika

Man erhält BBM-2478A und B als gelblich-bis orangegefärbte kristalline Feststoffe. Die beiden BBM-2478- Bestandteile kann man dünnschichtchromatographisch (TLC) wie in der Tabelle 5 gezeigt, von Chartreusin unterscheiden. BBM-2478A löst sich leicht in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Dioxan und saurem Wasser. In Methanol, Ethanol und Chloroform ist es wenig löslich und in den anderen organischen Lösungsmitteln unlöslich. Die Löslichkeit von BBM-2478B ähnelt der von BBM-2478A. BBM-2478B ist jedoch in saurem Wasser unlöslich. BBM-2478A und B geben mit Eisen-III Chlorid und Anthronreagentien positive Ergebnisse. 2478A ist im Ninhydrintest positiv, während BBM-2478B in diesem Test negativ ist. Tollen′s und Sakaguchi-Tests sind mit beiden Bestandteilen negativ. Die physico-chemischen Eigenschaften von BBM-2478A und 2478B sind in der Tabelle 6 zusammengefaßt. Die UV-Spektren der beiden Bestandteile ähneln einander, wobei in neutralen und sauren Lösungen Maxima bei 236, 266, 398 und 422 nm und in alkalischer Lösung Maxima bei 240, 268 und 435 nm beobachtet werden. Diese Spektren ähneln dem von Chartreusin stark. Die IR-Spektren von BBM-2478 A und B sind jeweils in den Fig. 1 und 2 wiedergegeben. Die ¹H-NMR und ¹³C-NMR-Spektren von BBM-2478A sind in den Fig. 3 und 4 gezeigt.

Tabelle 5

Dünnschichtchromatographie von BBM-2478A und B und Chartreusin

Tabelle 6

Physiko-chemische Eigenschaften von BBM-2478A und B

Strukturuntersuchungen mit den BBM-2478 Antibiotika

Das ¹³C-NMR-Spektrum von BBM-2478A zeigt die Anwesenheit von 33 Kohlenstoffatomen, darunter vier C-CH₃, eine -OCH₃, neun CH-, eine C, fünf -CH = und 13 C=Gruppen. Aufgrund dieser ¹³C-NMR- Spektraldaten und der Elementaranalyse von BBM-2478A wurde die Summenformel C₃₃H₃₅NO₁₃ abgeleitet. BBM-2478A wurde eine Stunde mit 0,4 N methanolischer Chlorwasserstoffsäure am Rückfluß erhitzt. Ausgefallene gelbe Kristalle wurden abfiltriert und das Filtrat wurde im Vakuum zu einem Sirup eingeengt, der Ninhydrin-positive Zuckerfragmente enthält. Es wurde festgestellt, daß es sich bei dem kristallinen Material um Chartarin, d. h. dem Aglykon von Chartreusin handelt. Dies wurde aufgrund vergleichender Spektralanalysen mit einer authentischen Probe fetgestellt.

Das in dem wäßrigen Konzentrat enthaltene Zuckerfragment war die anomere Mischung eines Disaccharids (Verbindung I), die chromatographisch auf Amberlite® CG-50 (NH₄⁺ Form) in etwa gleichen Mengen α und β Methylglykoside (Ia und Ib) aufgetrennt wurde. Aufgrund des Massenspektrums (M⁺+1 : 1 : m/z 352) und der ¹³C-NMR-Daten wurde den Verbindungen Ia und Ib die Summenformel C₁₅H₂₉NO₈ zugeordnet. Die physiko-chemischen Eigenschaften sind in Tabelle 7 aufgeführt. Die Verbindungen Ia und Ib konnten nicht weiter hydrolysiert werden und verursachten bei sauren Bedingungen eine solche Zersetzung der erhaltenen Zuckerfragmente, daß die Glykosidbindung gespalten wurde. Eine Mischung der Verbindungen Ia und Ib (370 mg) wurde in Methanol zu einem mono-N-Acetylderivat (460 mg, M⁺+1 : m/z 394) acyliert, welches mit 4,5N methanolischer Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert wurde. Das Produkt wurde an einer Silikagelsäure chromatographiert, wobei die untere Phase CHCl₃-MeOH-c.NH₄OH (6 : 1 : 1) war. Es wurden die α- und β-Anomere eines N-Acetylamino-Zuckers (Verbindung N-Ac-IIa, 140 mg und N-AC-IIb, 22 mg) und ein neutraler Zucker (Verbindung IIIa, 85 mg und IIIb, 79 mg) erhalten. Nach Behandlung mit gesättigter Ba(OH)₂-Lösung wurde N-AC-IIa quantitativ in die freie Aminoform (Verbindung IIa) überführt. Die physiko-chemischen Daten von IIa, IIIa und IIIb sind in der Tabelle 8 zusammengefaßt. Das NMR-Spektrum der Verbindung IIa zeigte, daß es sich um Methyl-2-amino-2,6-dideoxy-3-O-methyl-α-D-galactopyranosid handelte. Wie in der Tabelle 8 gezeigt, zeigt das NMR-Spektrum IIa neben zwei Signalen für OCH₃ und einem Signal für C-CH₃ die Signale von 5 Ringprotonen. Eine Analyse erster Ordnung der Ringprotone ergibt die folgenden Kopplungskonstanten: J_1-2=3,8, J_2-3=10,5, J_3-4= 3,0, J_4-5 1,0 und J_5-6=6,4 Hz. diese Ergebnisse stimmen mit der zugeordneten Struktur überein. Auch die physiko-chemischen Daten für die N,O-Diacetylverbindung IIa (Fp. 163 bis 164°C und [α]:+154° (c 0,3; CHCL₃)) entsprechen denen, die von M.B Perry in Can. J. Chem. 52: 3251-3255 (1974) für Methyl-2-acetamido-4-O-acetyl-2,6- dideoxy-3-O-methyl-α-D-galactopyranosid berichtet werden.

Das ¹H-NMR-Spektrum der Verbindung IIIa zeigt die folgenden Kopplungskonstanten:
J_1-2=4,5, J_4-5<1,0 und J_5-6=6,7 Hz, während das NMR-Spektrum der Verbindung IIIb die folgenden Kopplungskonstanten zeigt:
J_1-2=7,8, J_4-5<1,0 und J_5-6=6,5 Hz. In beiden Spektren war kein Ringproton an C₃ zu sehen. Aufgrund der Spektralanalysen handelt es sich bei den Verbindungen IIIa und IIIb um das α- bzw. β-Methylglykolsid von 6- Deoxy-3-C-methylgulopyranosid (Methylvirenosid) oder von 6-Deoxy-3-C-methylgalactopyranosid. Das Dünnschichtchromatogramm und das NMR-Spektrum einer autentischen Probe von Methyl-β-D-virenosid unterschied sich von denen der Verbindung IIIb. Die Signale für H₁ und H₅ von Methylvirenosid wurden nämlich bei wesentlich niedrigerem Feld beobachtet als die der Verbindung IIIb. Dies deutet darauf hin, daß sich die C₃-OH-Gruppe von Methylvirenosid axial angeordnet ist, während die entsprechende Gruppe der Verbindung IIIb equatorial angeordnet ist. Auf Basis der Werte für die optische Drehung für die Verbindungen IIIa und IIIb und der für die Verbindung IIIa (-1309°) beobachteten Δ[M]^CuAmWerte wurde der Verbindung III eine D-Konfiguration zugeordnet. Bei den Verbindungen IIIa und IIIb handelt es sich somit um methyl-6-deoxy- 3-C-methyl-α- und β-D-Galactopyranosid.

Die Bindung der beiden Zuckermoleküle wurde durch Massenspektren der Verbindungen Ia und Ib und deren Acetate bestimmt. Es wurden Ionenfragmente beobachtet, die einer Sequenz II→III des Disaccharids zugeordnet werden können. Das 200 MHz ¹H-NMR-Spektrum und mit der N,O-Triacetyl Verbindung Ia durchgeführte Entkopplungsexperimente ergaben, daß das Zuckermolekül II über eine α-Glykosidbindung an die C₂-OH-Gruppe der Verbindung III gebunden ist. Die Verbindungen Ia und Ib besitzen somit die nachstehend wiedergegebenen Strukturen:

Die bei verschiedenen pH-Werten aufgenommen UV-spektren von BBM-2478A sind denen von Chartreusin sehr ähnlich. Dies deutet darauf hin, daß die Disaccharideinheit von BBM-2478A über dieselbe Hydroxylgruppe wie beim Chartreusin an Chartarin gebunden ist. Die IR-Spektren von BBM-2478A und Chartreusin in Chloroform ergaben dasselbe Muster für die Carbonylabsorption, was obige Zuordnung unterstützt. Im NMR-Spektrum von N-Acetyl-BBM-2478A ergab das anomere Proton der Verbindung III ein Dublett mit einem Abstand von J=8,0 Hz. Daraufhin wurde dem Antibiotikum die β-Pyranosidkonformation der Verbindung III zugeordnet.

Aufgrund der Elementaranalyse wurde BBM-2478B die Bruttoformel C₂₆H₂₂O₁₀ zugeordnet. Nach milder, saurer Methanolyse ergab BBM-2478B Chartarin und neutrale Zucker (IIIa und IIIb), die mit denen identisch sind, die von BBM-2478A erhalten wurden. Bei BBM-2478B handelt es sich somit offensichtlich um das Analogen von BBM-2478A, jedoch ohne die Aminozuckereinheit (II). BBM-2478A und B besitzen somit die folgenden Strukturen:

Tabelle 7

Physiko-chemische Eigenschaften der Verbindungen Ia und Ib

Biologische Eigenschaften

Die minimale Hemmkonzentration (minimale inhibierende Konzentration (MIC)) von BBM-2478 wurde im Vergleich zu Chartreusin gegenüber verschiedenen gram-positiven und gram-negativen Bakterien und Pilzen sowie einigen anaeroben Organismen gemäß der Serien-zweifach-Agar-Verdünnungsmethode bestimmt. Ein Nähr-Agar-Medium wurde für gram-positive und gram-negative Bakterien eingesetzt. für anaerobe Organismen wurde GAM Agar-Medium und für Pilze Sabouraud-Agar-medium eingesetzt. Wie aus der Tabelle 9 ersichtlich, sind BBM-2478A, B und Chartreusin in ähnlicher Weise antibakteriell wirksam gegen grampositive Bakterien und anaerobe Organismen, während sie gegenüber gram-negativen Bakterien und Pilzen inaktiv sind. Die Wirksamkeit von BBM-2478A gegen Staphylokokken war zwei bis vier Mal größer als die Wirkung von BBM-2478B oder Chartreusin.

Tabelle 9

Antibakterielle Aktivität von BBM-2478A und B

Die Antitumoraktivität von BBM-2478A wurde im Vergleich zu Chartreusin an Mäusen bestimmt. Diese Wirkung wurde gegen Lymphozyten-Leukämie P388, lymphoide Leukämie L12110 und melanotisches Melanom B16 getestet. Dazu wurden BDF₁ Mäusen Tumore mit Inoculumgrößen von 10⁶, 10⁵ und 10⁶ Zellen pro Maus intraperitoneal implantiert. Die Testverbindungen wurden in 0,9%iger Kochsalzlösung gelöst, welche 10% Dimethylsulfoxid enthält. Abgestufte Dosen des Antibiotikums wurden 24 Stunden nach der Tumorimplantation intraperitoneal verabreicht. Die Dosen wurden einmal täglich neun Tage lang (qd 1→9) verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabellen 10, 11 und 12 gezeigt. BBM-2478A war in etwa 10 bis 30 Mal wirksamer als Chartreusin in bezug auf die minimal wirksame Dosis. Die mit BBM-2478A erzielten T/C-Werte waren bei allen getesteten Tumoren größer als die von Chartreusin. Es wurde ferner gefunden, daß BBM-2478B keine Antitumorwirksamkeit besitzt. Die akute Toxizität von BBM-2478A wurde durch eine einzelne intraperitoneale Verabreichung an Mäuse (ddY Stamm) bestimmt. Die LD₅₀ betrug 38 mg/kg.

Wie oben gezeigt, besitzen BBM-2478A und B eine starke antibakterielle Wirksamkeit gegen aerobe gram-positive Bakterien und anaerobe Bakterien. Sie sind somit zur therapeutischen Behandlung von Infektionskrankheiten bei Säugetieren (Mensch und Tier) und anderen Tieren nützlich, die durch derartige Bakterien hervorgerufen werden. Diese Verbindungen können außerdem als antibakterielle Wirkstoffe für andere übliche Anwendungszwecke eingesetzt werden. Sie können beispielsweise zum Desinfizieren von medizinischen und zahnmedizinischen Ausrüstungen verwendet werden. Die signifikante Antitumorwirkung von BBM-2478A gegenüber experimentellen Tumoren, getestet an Mäusen, deutet darauf hin, daß BBM-2478A auch zur Inhibierung des Wachstums von Tumoren bei Säuretieren therapeutisch nützlich ist.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können somit zur Behandlung von bakteriellen Infektionen verwendet werden. Dazu verabreicht man eine antibakterielle Dosis von BBM-2478A oder BBM-2478B entweder als solche oder in Form eines pharmazeutischen Mittels an den Wirt. Außerdem kann man die Verbindung BBM-2478A zur Bekämpfung maligner Tumore bei Säugetieren (Mensch und Tier) verwenden. Dazu verabreicht man eine wirksame Dosis von BBM-2478A.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein pharmazeutisches Mittel, das eine wirksame antibakterielle Menge an BBM-2478A oder BBM-2478B zusammen mit einem inerten pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthält. Dieses Mittel kann in jeder pharmazeutischen, zur parenteralen Verabreichung geeigneten Form vorliegen. Zur parenteralen Verabreichung geeignete pharmazeutische Mittel sind beispielsweise sterile, wäßrige oder nichtwäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie können auch in Form steriler, fester Mittel vorliegen, die unmittelbar vor der Verwendung in sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder irgendeinem anderen sterilen injizierbaren Medium gelöst werden.

Es versteht sich, das die vorzugsweise zu verabreichenden Mengen der BBM-2478-Antibiotika von verschiedenen Faktoren abhängt, z. B. von den eingesetzten Bestandteilen, der bestimmten Formulierung, der Anwendungsart, dem speziellen Situs, dem Wirt und der zu behandelnden Krankheit. Der Fachmann muß dabei viele Faktoren berücksichtigen, welche die Wirkung eines Arzneimittels beeinflussen. Dazu zählen beispielsweise das Alter, das Körpergewicht, das Geschlecht, der Verabreichungszeitpunkt, die Verabreichungsart, die Ausscheidungsgeschwindigkeit, der Zustand des Wirts, die Arzneimittelkombination, die Reaktionsempfindlichkeit und die Schwere der Krankheit. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können kontinuierlich oder in Abständen verabreicht werden.

Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Dabei sind die Temperaturen in Grad Celcius angegeben, sofern nichts anderes ausgeführt ist. Amberlite® CG-50 für ein schwach saures Kationenaustauschharz vom Carbonsäuretyp. Diaion® HP-20 für ein nicht-ionisches, makroverzweigtes Polymerharz.

Beispiel 1 Fermentation von BBM-2478A und B

Eine gut-gewachene Schrägkultur des Actynomycetes-Stammes Nr. J907-21 wurde zum Inokulieren eines vegetativen Mediums eingesetzt, das aus 3% löslicher Stärke, 1% Bacto-Leber, 0,5% Fischmehl, 0,3% NaCl, 0,1% (NH₄)₂SO₄ und 0,6% CaCO₃ bestand, wobei der pH vor der Sterilisierung auf 7,0 eingestellt wurde. Das vegetative Medium wurde 27 Stunden auf einem Drehschüttler (250 min^-1) bei 28°C inkubiert. 5 ml der Kultivierung wurden in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben überführt, der 100 ml eines Fermentationsmediums enthielt, das dieselbe Zusammensetzung wie das vegetative Medium besaß. Die Fermentation wurde 7 bis 10 Tage auf einem Drehschüttler bei 28°C durchgeführt. Die antibiotische Aktivität der Fermentationsbrühe wurde mittels der Papier-Disk-Agardiffusionsmethode unter Verwendung von Mikrococcus luteus PCI 1001 als Testorganismus durchgeführt. Nach 6- bis 7tägiger Fermentation erreichte die antibiotische Produktivität ein Maximum von 150 mcg/ml.

Beispiel 2 Isolierung und Reinigung von BBM-2478A und B

Die in Beispiel 1 erhaltene Brühe (20 l, pH 6,8) wurde von dem Mycelkuchen und der überstehenden Flüssigkeit mit Hilfe einer Zentrifuge vom Sharpless-Typ (Kokusan Nr. 4A) abgetrennt. Der Mycelkuchen wurde dreimal mit jeweils 5 l Methanol extrahiert. Nach Abfiltrieren der unlöslichen Betandteile wurden die methanolischen Extrakte vereinigt und im Vakuum zu einer wäßrigen Lösung eingeengt. Die überstehende Flüssigkeit der Fermentationsbrühe wurde mit 20 l n-Butanol extrahiert. Der Extrakt wurde im Vakuum zu einer wäßrigen Lösung eingeengt. Die beiden wäßrigen Konzentrate wurden vereinigt und auf eine Diaion® HP-20 ⌀5,5×60 cm) gegeben, die nacheinander mit 5 l Wasser, 5 l 50%igem wäßrigen Methanol und 6 l 80%igem wäßrigen Methanol entwickelt wurde. Die BBM-2478 enthaltenen Fraktionen wurden mit Hilfe eines Papierscheibenassays unter Verwendung von B. subtilis M45 (Rec^-) als Testorganismus überrwacht. die mit 80% wäßrigem Methanol eluierten aktiven Fraktionen wurden zusammengegeben, bei vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Es wurden so 4,5 g eines gelben Feststoffs aus dem rohen BBM-2478 Komplex erhalten. Dieser rohe Komplex wurde auf eine Silikagelsäule (⌀3,5×55 cm) gegeben, die mit Chloroform vorgewaschen wurde. Die aktiven Bestandteile wurden mit einer Chloroform-Methanolmischung eluiert, wobei die Methanolkonzentration stufenweise erhöht wurde (5-10% v/v). Die ersten, mit 5% Methanol eluierten aktiven Fraktionen wurden gesammelt, im Vakuum eingeengt und lyophilisiert. Man erhielt so BBM-2478B (72 mg). Die mit 10% Methanol eluierten, zweiten aktiven Fraktionen wurden in ähnlicher Weise aufgearbeitet. Man erhielt so 2,5 g eines halbreinen Feststoffes von BBM-2478A. Letzterer Feststoff wurde an Silikagel weiter chromatographiert (Flüssigkeitschromatogramm bei mittlerem Druck; Säule: ⌀11×500 mm; Pumpe: Druck 80-90 psi (5,5-6,2 bar)). Elution mit Chloroform-Methanol (97 : 3; v/v) ergab aktive Fraktionen, die nach Einengen im Vakuum einen homogenen Feststoff von BBM-2478A ergaben (1,30 g). Dieser Feststoff wurde aus Methanol kristallisiert und ergab gelblich-orangene Stäbchen von BBM-2478A Monohydrat.

Claims

1. Antibiotikum BBM-2478A der Formel:

2. Antibiotikum BBM-2478B der Formel:

3. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika BBM-2478A und BBM-2478B gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm J907-21 (ATCC 39 417) oder eine BBM-2478A oder BBM-2478B produzierende Mutante davon in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, bei submersen aeroben Bedingungen kultiviert und dann das Antibiotikum BBM-2478A oder BBM-2478B aus dem Kulturmedium gewinnt.

4. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend das Antibiotikum BBM- 2478A gemäß Anspruch 1 oder das Antibiotikum BBM-2478B gemäß Anspruch 2 oder eine Mischung davon zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.