DE3436137C2 - Antibiotika BBM-2478A und BBM-2478B, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Mittel - Google Patents
Antibiotika BBM-2478A und BBM-2478B, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische MittelInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Antibiotika BBM-2478A und B, Verfahren zu
deren Herstellung und diese Antibiotika enthaltende
pharmazeutische Mittel.
Erfindungsgemäß werden zwei antibiotisch wirksame Verbindungen
bereitgestellt, die Glokoside darstellen. Diese
Glykoside bestehen aus einem Aglykon, nämlich Chartarin,
d. h. dem Aglykon von Chartreusin, und einer oder zwei
Zuckereinheiten. Das Antibiotikum BBM-2478B weist eine
Zuckereinheit der Formel
auf, die an das Aglykon gebunden ist. Das andere erfindungsgemäße
Antibiotikum BBM 2478A hingegen weist zusätzlich
die Aminozuckereinheit der folgenden Formel auf:
Das antibiotisch wirksame Chartreusin ist beispielsweise
beschrieben in J. Am. Chem. Soc. 75: 4011-4012 (1953) und
Helv. Chim. Acta 47: 1459-1484 (1964). Es weist denselben
Aglykonteil auf wie die erfindungsgemäßen Antibiotika,
enthält jedoch zwei andere Zuckereinheiten, d. h. D-Fucose
und D-Digitalose. Chartreusin besitzt folgende Strukturformel:
Chartreusin kann man durch Fermentation von Streptomyces
chartreusis, Streptomyces Sp. Nr. 747 (S. viridis),
Streptomyces Sp. 6A36 (S. viridochromogenes) und zweier
Actinomycetesstämme, die mit streptomyces Sp. X-3988 und
S-465 bezeichnet sind. Chartreusin ist dieselbe Verbindung
wie das Antibiotikum 747 und das Antibiotikum X-465A.
Gegenstand der Erfindung ist ein antibiotisch wirksamer
Komplex, der mit BBM-2478 bezeichnet ist. Diesen Komplex
erhält man durch Kultivieren eines Actinomycetesstammes,
der mit Stamm J907-21 (ATCC 39 417) bezeichnet ist, oder
durch Kultivieren von Varianten oder Mutanten davon in
einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff-
und Stickstoffquellen enthält. Die Kultivierung führt
man bei submersen aeroben Bedingungen durch, bis man eine
erhebliche Menge des BBM-2478-Komplexes in dem genannten
Kulturmedium erhalten hat. Anschließend gewinnt man den
BBM-2478-Komplex aus dem Kulturmedium. Dieser BBM-2478-
Komplex enthält zwei bioaktive Bestandteile, nämlich die
Antibiotika BBM-2478A und BBM-2478B, die man mit Hilfe
üblicher chromatographischer Verfahren auftrennen und
im in wesentlichen reiner Form isolieren kann.
BBM-2478A und B wirken antibakteriell gegen aerobe, grampositive
Bakterien und anaerobe Bakterien. BBM-2478A
inhibiert auch das Wachstum maligner Tumore bei experimentell
erzeugten Tiertumoren.
Von den Figuren zeigt
Fig. 1 das Infrarotspektrum von BBM-2478A,
Fig. 2 das Infrarotspektrum von BBM-2478B,
Fig. 3 das ¹H-NMR-Spektrum (80 MHz) von BBM-2478A
in CD₃OD und
Fig. 4 das ¹³C-NMR-Spektrum (20 MHz) von BBM-2478A
in d₆-DMSO.
Gegenstand der Erfindung sind somit antibiotisch wirksame
Glykoside, die in der vorliegenden Anmeldung mit
BBM-2478A und BBM-2478B bezeichnet sind. Gegenstand der
Erfindung ist ferner ein Verfahren zu deren Herstellung
durch Fermentation eines Actinomycetesstammes, der mit
Stamm J907-21 bezeichnet ist. Dieser produzierende Organismus
wurde aus einer Bodenprobe isoliert, welche in
El Salvador gefunden wurde. Dieser Sturm ist derzeit
nur insofern klassifiziert worden, als daß es sich um
einen nicht-Streptomyces Actinomycetesstamm handelt.
Eine biologisch reine Kultur dieses Organismus wurde
auf übliche Weise hergestellt und bei der American Type
Culture Collection, Washington, D.C., unter der Nummer
ATCC 39417 hinterlegt.
Der Stamm J907-21 bildet häufig verzweigte, nicht-fragmentierende
vegetative Mycele aus, ist jedoch nicht in
der Lage, ein richtiges Luftmycel zu tragen. Dieser Stamm
bildet, soweit bis jetzt festgestellt wurde, keine Sporen
aus. Da dieser Stamm meso-Diaminopimelinsäure in der
Zellwand und Madurose in dem Hydrolysat der gesamten
Zelle enthält, wird dieser Stamm J907-21 als "Zellwand
Typ IIIB" eingeordnet. Der Stamm J907-21 trägt keine
morphologisch ausgeprägten Körper, wie eine Sporenkette
oder ein Sporangium. Der Stamm J907-21 kann daher derzeit
nur als nicht-Streptomyces Actinomycetesstamm klassifiziert
werden.
Der Stamm J907-21 bildet lange, häufig verzweigte vegetative
Mycele (0,4 µm breit), die nicht in stab- oder
coccenförmige Zellen fragmentieren. Auf einigen Agarmedien
bilden sich gelegentlich rudimentäre kurze Luftmycele,
ein richtiges Luftmycel bildet sich jedoch auf allen beschriebenen
Medien nicht aus. Soweit festgestellt wurde,
bilden sich keine Sporen-bildenden Körper und Sporen aus.
Der Stamm wächst, wie in der Tabelle 1 gezeigt, auf natürlichen
organischen Medien mäßig, während er auf den
meisten chemisch definierten Medien nur wenig wächst.
Obwohl der Stamm J907-21 kein wirkliches Luftmycel ausbildet,
bilden sich auf den ISP-Nummern 2 und 4 Medien
und Bennett′s Agar rudimentäre kurze Luftmycele teilweise
aus. Auch auf dem ISP-Nummer 7 Medium, dem Cobalamin
oder ein Vitaminkomplex zugegeben worden war, bildet
sich ebenfalls ein rudimentäres Luftmycel aus. Auf den
meisten Agarmedien ist die rückseitige Farbe der vegetativen
Mycele schwach gelb bis braun (verschiedene Schattierungen).
Auf dem ISP-Nummer 2 Medium und VDYA (V8
juice-dextrose-yeast extract agar) bildet sich ein tiefrotes
Mycelpigment. Auf den ISP-Nr. 1, 6 und 7 Medien
bildet sich kein melanoides Pigment. Die Kolonie auf ISP-
Nr. 2 Medium ist sehr hoch, steif und gefaltet.
Bei 28°C und 37°C ist das Wachstum am größten. Bei
7°C und 45°C findet kein Wachstum statt. Ein Wachstum
findet somit zwischen 15°C und 43°C statt. Aus L-3,4-
Dihydroxy-phenylalanin (L-DOPA) wird kein Melanin gebildet-
Der Stamm J907-21 verträgt die Anwesenheit von
Natriumchlorid in einer Konzentration von 4% oder weniger,
jedoch nicht in einer Konzentration von 5%. Er ist
ferner empfindlich gegenüber Lysozym.
Der Stamm J907-21 verwertet fast alle Pentosen und Hexosen.
Die physiologischen Charakteristika und die Verwertung
von Kohlenhydraten sind in den Tabellen 2 und 3
gezeigt.
Die Zusammensetzung der Aminosäuren in der Zellwand wurde
untersucht nach den Verfahren, die beschrieben sind
von Becker et al. in appl. Microbiol. 13: 236-243 (1965)
und von Yamaguchi in J. Bacteriol. 89: 444-453 (1965).
Die Zusammensetzung wurde ferner mit Hilfe einer Aminosäureanalysiervorrichtung
bestimmt.
Die Zuckerbestandteile des Hydrolysats der gesamten Zelle
wurden nach den Verfahren identifiziert, die beschrieben
sind von Lechevalier und Lechevalier in Chemical Methods
As Criteria For the Separation Of Norcardiae From Other
Actinomycetes, Biology Of The Actinomycetes And Related
Organismus 11: 78-92 (1976). Die Zellwand vom Stamm J907-21
enthält meso-Diaminopimelinsäure und geringe Mengen Glycin.
In dem Hydrolysat der gesamten Zelle sind Glykose,
Mannose, Madurose und Ribose vorhanden. Aufgrund der
oben aufgeführten Zusammensetzung der Zellwand und der
Zuckerbestandteile der gesamten Zelle gehört der Stamm
J907-21 zu dem Zellwandtyp IIIB.
Der Stamm J907-21 ist ein mesophiler, gram-positiver
Actinomycetesstamm, der gelegentlich rudimentäre kurze
Luftmycele ausbildet, jedoch nicht die Fähigkeit besitzt,
ein wirkliches Luftmycel, einen sporentragenden Körper
und Sporen zu bilden. Der Stamm J907-21 hat eine Zellwand
vom Typ IIIB. Bekannte Actinomycetesstämme mit der
Zellwand vom Typ IIIB sind beispielsweise die Genera
Actinomadura, Microbispora, Streptosporangium, Spirillospora,
Planomonospora, Planobispora und Dermatophilus.
Das vegetative Mycel vom Genus Dermatophilus, das von
seiner Art her ein obligater Krankheitserreger für Tiere
ist, besitzt sowohl quer- als auch längsverlaufende Septa.
Der Stamm J907-21 unterscheidet sich somit deutlich von
dem Genus Dermatophilus. Die übrigen sechs Genera sind
dadurch charakterisiert, daß sie auf dem Luftmycel Sporenträger
(Sporangium) oder Arthrosporen tragen. Es wurde
berichtet, daß viele Stämme dieser sechs Genera im Gegensatz
zu den Streptomycesspezien bei der Sporulation mehr
oder weniger wählerisch sind. Der Stamm J907-21 gehört
daher wahrscheinlich zu einem der oben genannten sechs
Genera. Es wurde berichtet, daß der Genus Actinomadura,
der zu den genannten sechs Genera gehört, an vielen Stellen
in der Welt im Erdreich gefunden werden kann. Gordon
beschreibt im J. Gen. Microbiol. 109: 69-78 (1978) die
physiologische Charakterisierung von 14 Taxonomien von
Nocardiae induzierenden Actinomadura madurae. Auf Basis
der physiologischen Untersuchungen von Gordon wurde der
Stamm J907-21 mit A. madurae (Tabelle 4) verglichen.
Der Stamm J907-21 ist mit Actinomadura madurae (Ähnlichkeit
von 85,7%) mehr verwandt als mit den anderen mit
den Zelltypen IIIC und IV (Ähnlichkeit: 54,8% bis 76,9%).
Jedoch wurden die physiologischen Verwandtschaften unter
den sechs Genera vom Zellwandtyp IIIB nicht untersucht, da
sie sich morphologisch klar voneinander unterscheiden.
Der Stamm J907-21 kann somit nur als nicht sporenbildender
nicht-Streptomycesstamm klassifiziert werden.
Wie auch bei anderen Organismen können die Charakteristika
des Stammes J907-21 verändert werden. So kann man beispielsweise
künstliche Varianten und Mutanten des Stammes
J907-21 durch Behandlung mit verschiedenen bekannten
Mutagenen erhalten. Dazu zählen beispielsweise UV-Strahlen,
Röntgenstrahlen, Wellen hoher Frequenz, radioaktive
Strahlen und Chemikalien. Erfindungsgemäß werden alle
natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten (im
folgenden als Mutanten bezeichnet) des Stammes J907-21,
die das Antibiotikum BBM-2478 produzieren, umfaßt.
Die erfindungsgemäßen Antibiotika BBM-2478 kann man herstellen,
indem man den Stamm J907-21 (ATCC 39 417) oder
einen BBM-2478-produzierenden Mutanten davon bei submersen
aeroben
Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium
kultiviert. Den produzierenden Organismus läßt man in
einem Nährmedium wachsen, das assimilierbare Kohlenstoffquellen
enthält, beispielsweise assimilierbare Kohlenhydrate.
Als Beispiele geeigneter Kohlenstoffquellen kann
man nennen. Glycerin, Arabinose, Xylose, Glukose, Fruktose,
Mannose, lösliche Stärke, Mannit und Zellobiose.
Das Nährmedium sollte auch eine assimilierbare Stickstoffquelle
enthalten, beispielsweise Fischmehl, Soyabohnenmehl,
Maisquellwasser, Peptone, Fleischextrakt, Erdnußmehl,
Hefeextrakt oder Ammoniumsalze. Falls erforderlich,
können auch anorganische Salze, beispielsweise Natriumchlorid,
Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat oder
Phosphat hinzugegeben werden. Spurenelemente, beispielsweise
Kupfer, Mangan, Eisen oder Zink können gewünschtenfalls
zu dem Medium gegeben werden. Sie können
jedoch auch in Form von Verunreinigungen der anderen Bestandteile
der Medien zugegeben werden. Als Inkubationstemperatur
wählt man jede Temperatur, bei der der produzierende
Stamm wachsen kann, z. B. von 15°C bis 43°C. Vorzugsweise
führt man die Fermentation bei 25 bis 35°C, insbesondere
bevorzugt bei 27 bis 32°C durch. Ein neutraler
oder fast neutraler pH des Mediums ist bevorzugt. Man
kultiviert im allgemeinen etwa 6 bis 10 Tage. Eine optimale
Produktion erreicht man gewöhnlich in etwa 6 bis
7 Tagen. Zur Herstellung verhältnismäßig geringer Mengen
kann man Schüttelflaschen- und Oberflächenkulturen einsetzen.
Für die Herstellung größerer Mengen verwendet
man vorzugsweise eine submerse aerobe Kultur in sterilen
Tanks. Führt man eine Tankfermentation durch, dann ist
es wünschenswert, ein vegetatives Inocolum in einer Nährbrühe
herzustellen, indem man die Kulturbrühe mit einer
Spore des Organismus animpft. Hat man ein junges aktives
vegetatives Inocolum errhalten, dann überführt man das
Inoculum aseptisch in das Medium des Fermentationstanks.
Die Tanks und Flaschen kann man dadurch belüften, daß
man sterile Luft durch oder auf die Oberfläche des Fermentationsmediums
leitet. Man kann außerdem durch einen
mechanischen Rührer rühren. Man kann auch Antischaummittel,
beispielsweise Specköl zugeben, falls dies erforderlich ist.
Die Produktion von BBM-2478 in dem Fermentationsmedium
kann man während der Fermentation bequem durch einen
Papier-Disk-Agardiffusionsassay unter Verwendung
von Micrococcus luteus PCI 1001 Testorganismus verfolgen.
Nachdem man eine optimal wirksame Brühe erhalten hat,
trennt man das Mycel und ungelöste Bestandteile nach
üblichen Verfahren, beispielsweise durch Filtrieren oder
Zentrifugieren, von der Fermentationsbrühe ab. Die Antibiotika
in dem Mycelkuchen kann man dadurch gewinnen,
daß man die Mycelkuchen mit Methanol extrahiert, unlösliche
Bestandteile abfiltriert und den Methanolextrakt
zu einer wäßrigen Lösung konzentriert. Die aktiven Bestandteile
in der überstehenden Brühe kann man gewinnen,
indem man mit n-Butanol extrahiert und den Butanolextrakt
zu einer wäßrigen Lösung konzentriert. Die wäßrigen,
die BBM-2478A und B Antibiotika enthaltenden Methanol-
und Butanolextrakte kann man dann nach üblichen chromatographischen
Verfahren reinigen, wobei man gereinigtes
BBM-2478A und B erhält. Ein bevorzugtes Reinigungsverfahren
ist im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben.
Man erhält BBM-2478A und B als gelblich-bis orangegefärbte
kristalline Feststoffe. Die beiden BBM-2478-
Bestandteile kann man dünnschichtchromatographisch (TLC)
wie in der Tabelle 5 gezeigt, von Chartreusin unterscheiden.
BBM-2478A löst sich leicht in Dimethylsulfoxid,
Dimethylformamid, Dioxan und saurem Wasser. In Methanol,
Ethanol und Chloroform ist es wenig löslich und in den
anderen organischen Lösungsmitteln unlöslich. Die Löslichkeit
von BBM-2478B ähnelt der von BBM-2478A. BBM-2478B
ist jedoch in saurem Wasser unlöslich. BBM-2478A und
B geben mit Eisen-III Chlorid und Anthronreagentien positive
Ergebnisse. 2478A ist im Ninhydrintest positiv,
während BBM-2478B in diesem Test negativ ist. Tollen′s
und Sakaguchi-Tests sind mit beiden Bestandteilen negativ.
Die physico-chemischen Eigenschaften von BBM-2478A und
2478B sind in der Tabelle 6 zusammengefaßt. Die UV-Spektren
der beiden Bestandteile ähneln einander, wobei in
neutralen und sauren Lösungen Maxima bei 236, 266, 398
und 422 nm und in alkalischer Lösung Maxima bei 240,
268 und 435 nm beobachtet werden. Diese Spektren ähneln
dem von Chartreusin stark. Die IR-Spektren von BBM-2478
A und B sind jeweils in den Fig. 1 und 2 wiedergegeben.
Die ¹H-NMR und ¹³C-NMR-Spektren von BBM-2478A sind in
den Fig. 3 und 4 gezeigt.
Das ¹³C-NMR-Spektrum von BBM-2478A zeigt die Anwesenheit
von 33 Kohlenstoffatomen, darunter
vier C-CH₃, eine -OCH₃, neun CH-, eine C,
fünf -CH = und 13 C=Gruppen. Aufgrund dieser ¹³C-NMR-
Spektraldaten und der Elementaranalyse von BBM-2478A
wurde die Summenformel C₃₃H₃₅NO₁₃ abgeleitet.
BBM-2478A wurde eine Stunde mit 0,4 N methanolischer
Chlorwasserstoffsäure am Rückfluß erhitzt. Ausgefallene
gelbe Kristalle wurden abfiltriert und das Filtrat wurde
im Vakuum zu einem Sirup eingeengt, der Ninhydrin-positive
Zuckerfragmente enthält. Es wurde festgestellt, daß es
sich bei dem kristallinen Material um Chartarin, d. h. dem
Aglykon von Chartreusin handelt. Dies wurde aufgrund
vergleichender Spektralanalysen mit einer authentischen
Probe fetgestellt.
Das in dem wäßrigen Konzentrat enthaltene Zuckerfragment
war die anomere Mischung eines Disaccharids (Verbindung
I), die chromatographisch auf Amberlite® CG-50
(NH₄⁺ Form) in etwa gleichen Mengen α und β Methylglykoside
(Ia und Ib) aufgetrennt wurde. Aufgrund des Massenspektrums
(M⁺+1 : 1 : m/z 352) und der ¹³C-NMR-Daten wurde
den Verbindungen Ia und Ib die Summenformel C₁₅H₂₉NO₈
zugeordnet. Die physiko-chemischen Eigenschaften sind
in Tabelle 7 aufgeführt. Die Verbindungen Ia und Ib konnten
nicht weiter hydrolysiert werden und verursachten bei
sauren Bedingungen eine solche Zersetzung der erhaltenen
Zuckerfragmente, daß die Glykosidbindung gespalten wurde.
Eine Mischung der Verbindungen Ia und Ib (370 mg) wurde in
Methanol zu einem mono-N-Acetylderivat (460 mg, M⁺+1 : m/z
394) acyliert, welches mit 4,5N methanolischer Chlorwasserstoffsäure
hydrolysiert wurde. Das Produkt wurde an
einer Silikagelsäure chromatographiert, wobei die untere
Phase CHCl₃-MeOH-c.NH₄OH (6 : 1 : 1) war. Es wurden die α- und
β-Anomere eines N-Acetylamino-Zuckers (Verbindung
N-Ac-IIa, 140 mg und N-AC-IIb, 22 mg) und ein neutraler
Zucker (Verbindung IIIa, 85 mg und IIIb, 79 mg) erhalten.
Nach Behandlung mit gesättigter Ba(OH)₂-Lösung wurde
N-AC-IIa quantitativ in die freie Aminoform (Verbindung
IIa) überführt. Die physiko-chemischen Daten von IIa,
IIIa und IIIb sind in der Tabelle 8 zusammengefaßt.
Das NMR-Spektrum der Verbindung IIa zeigte, daß es sich
um Methyl-2-amino-2,6-dideoxy-3-O-methyl-α-D-galactopyranosid
handelte. Wie in der Tabelle 8 gezeigt, zeigt das
NMR-Spektrum IIa neben zwei Signalen für OCH₃ und einem
Signal für C-CH₃ die Signale von 5 Ringprotonen. Eine
Analyse erster Ordnung der Ringprotone ergibt die folgenden
Kopplungskonstanten: J1-2=3,8, J2-3=10,5, J3-4=
3,0, J4-5 1,0 und J5-6=6,4 Hz. diese Ergebnisse stimmen
mit der zugeordneten Struktur überein. Auch die
physiko-chemischen Daten für die N,O-Diacetylverbindung IIa
(Fp. 163 bis 164°C und [α]:+154° (c 0,3; CHCL₃))
entsprechen denen, die von M.B Perry in Can. J. Chem. 52:
3251-3255 (1974) für Methyl-2-acetamido-4-O-acetyl-2,6-
dideoxy-3-O-methyl-α-D-galactopyranosid berichtet werden.
Das ¹H-NMR-Spektrum der Verbindung IIIa zeigt die folgenden
Kopplungskonstanten:
J1-2=4,5, J4-5<1,0 und J5-6=6,7 Hz, während das NMR-Spektrum der Verbindung IIIb die folgenden Kopplungskonstanten zeigt:
J1-2=7,8, J4-5<1,0 und J5-6=6,5 Hz. In beiden Spektren war kein Ringproton an C₃ zu sehen. Aufgrund der Spektralanalysen handelt es sich bei den Verbindungen IIIa und IIIb um das α- bzw. β-Methylglykolsid von 6- Deoxy-3-C-methylgulopyranosid (Methylvirenosid) oder von 6-Deoxy-3-C-methylgalactopyranosid. Das Dünnschichtchromatogramm und das NMR-Spektrum einer autentischen Probe von Methyl-β-D-virenosid unterschied sich von denen der Verbindung IIIb. Die Signale für H₁ und H₅ von Methylvirenosid wurden nämlich bei wesentlich niedrigerem Feld beobachtet als die der Verbindung IIIb. Dies deutet darauf hin, daß sich die C₃-OH-Gruppe von Methylvirenosid axial angeordnet ist, während die entsprechende Gruppe der Verbindung IIIb equatorial angeordnet ist. Auf Basis der Werte für die optische Drehung für die Verbindungen IIIa und IIIb und der für die Verbindung IIIa (-1309°) beobachteten Δ[M]CuAmWerte wurde der Verbindung III eine D-Konfiguration zugeordnet. Bei den Verbindungen IIIa und IIIb handelt es sich somit um methyl-6-deoxy- 3-C-methyl-α- und β-D-Galactopyranosid.
J1-2=4,5, J4-5<1,0 und J5-6=6,7 Hz, während das NMR-Spektrum der Verbindung IIIb die folgenden Kopplungskonstanten zeigt:
J1-2=7,8, J4-5<1,0 und J5-6=6,5 Hz. In beiden Spektren war kein Ringproton an C₃ zu sehen. Aufgrund der Spektralanalysen handelt es sich bei den Verbindungen IIIa und IIIb um das α- bzw. β-Methylglykolsid von 6- Deoxy-3-C-methylgulopyranosid (Methylvirenosid) oder von 6-Deoxy-3-C-methylgalactopyranosid. Das Dünnschichtchromatogramm und das NMR-Spektrum einer autentischen Probe von Methyl-β-D-virenosid unterschied sich von denen der Verbindung IIIb. Die Signale für H₁ und H₅ von Methylvirenosid wurden nämlich bei wesentlich niedrigerem Feld beobachtet als die der Verbindung IIIb. Dies deutet darauf hin, daß sich die C₃-OH-Gruppe von Methylvirenosid axial angeordnet ist, während die entsprechende Gruppe der Verbindung IIIb equatorial angeordnet ist. Auf Basis der Werte für die optische Drehung für die Verbindungen IIIa und IIIb und der für die Verbindung IIIa (-1309°) beobachteten Δ[M]CuAmWerte wurde der Verbindung III eine D-Konfiguration zugeordnet. Bei den Verbindungen IIIa und IIIb handelt es sich somit um methyl-6-deoxy- 3-C-methyl-α- und β-D-Galactopyranosid.
Die Bindung der beiden Zuckermoleküle wurde durch Massenspektren
der Verbindungen Ia und Ib und deren Acetate
bestimmt. Es wurden Ionenfragmente beobachtet, die einer
Sequenz II→III des Disaccharids zugeordnet werden können.
Das 200 MHz ¹H-NMR-Spektrum und mit der N,O-Triacetyl
Verbindung Ia durchgeführte Entkopplungsexperimente ergaben,
daß das Zuckermolekül II über eine α-Glykosidbindung
an die C₂-OH-Gruppe der Verbindung III gebunden ist.
Die Verbindungen Ia und Ib besitzen somit die nachstehend
wiedergegebenen Strukturen:
Die bei verschiedenen pH-Werten aufgenommen UV-spektren
von BBM-2478A sind denen von Chartreusin sehr ähnlich.
Dies deutet darauf hin, daß die Disaccharideinheit von
BBM-2478A über dieselbe Hydroxylgruppe wie beim Chartreusin
an Chartarin gebunden ist. Die IR-Spektren von
BBM-2478A und Chartreusin in Chloroform ergaben dasselbe
Muster für die Carbonylabsorption, was obige Zuordnung
unterstützt. Im NMR-Spektrum von N-Acetyl-BBM-2478A ergab
das anomere Proton der Verbindung III ein Dublett mit
einem Abstand von J=8,0 Hz. Daraufhin wurde dem Antibiotikum
die β-Pyranosidkonformation der Verbindung
III zugeordnet.
Aufgrund der Elementaranalyse wurde BBM-2478B die Bruttoformel
C₂₆H₂₂O₁₀ zugeordnet. Nach milder, saurer
Methanolyse ergab BBM-2478B Chartarin und neutrale Zucker
(IIIa und IIIb), die mit denen identisch sind, die von
BBM-2478A erhalten wurden. Bei BBM-2478B handelt es sich
somit offensichtlich um das Analogen von BBM-2478A, jedoch
ohne die Aminozuckereinheit (II). BBM-2478A und B besitzen
somit die folgenden Strukturen:
Die minimale Hemmkonzentration (minimale inhibierende
Konzentration (MIC)) von BBM-2478 wurde im Vergleich zu
Chartreusin gegenüber verschiedenen gram-positiven und
gram-negativen Bakterien und Pilzen sowie einigen anaeroben
Organismen gemäß der Serien-zweifach-Agar-Verdünnungsmethode
bestimmt. Ein Nähr-Agar-Medium wurde
für gram-positive und gram-negative Bakterien eingesetzt.
für anaerobe Organismen wurde GAM Agar-Medium und für
Pilze Sabouraud-Agar-medium eingesetzt. Wie aus der
Tabelle 9 ersichtlich, sind BBM-2478A, B und Chartreusin
in ähnlicher Weise antibakteriell wirksam gegen grampositive
Bakterien und anaerobe Organismen, während sie
gegenüber gram-negativen Bakterien und Pilzen inaktiv
sind. Die Wirksamkeit von BBM-2478A gegen Staphylokokken
war zwei bis vier Mal größer als die Wirkung von
BBM-2478B oder Chartreusin.
Die Antitumoraktivität von BBM-2478A wurde im Vergleich
zu Chartreusin an Mäusen bestimmt. Diese Wirkung wurde
gegen Lymphozyten-Leukämie P388, lymphoide Leukämie
L12110 und melanotisches Melanom B16 getestet. Dazu wurden
BDF₁ Mäusen Tumore mit Inoculumgrößen von 10⁶, 10⁵ und
10⁶ Zellen pro Maus intraperitoneal implantiert. Die
Testverbindungen wurden in 0,9%iger Kochsalzlösung gelöst,
welche 10% Dimethylsulfoxid enthält. Abgestufte
Dosen des Antibiotikums wurden 24 Stunden nach der Tumorimplantation
intraperitoneal verabreicht. Die Dosen wurden
einmal täglich neun Tage lang (qd 1→9) verabreicht.
Die Ergebnisse sind in Tabellen 10, 11 und 12 gezeigt.
BBM-2478A war in etwa 10 bis 30 Mal wirksamer als
Chartreusin in bezug auf die minimal wirksame Dosis.
Die mit BBM-2478A erzielten T/C-Werte waren bei allen
getesteten Tumoren größer als die von Chartreusin. Es
wurde ferner gefunden, daß BBM-2478B keine Antitumorwirksamkeit
besitzt. Die akute Toxizität von BBM-2478A
wurde durch eine einzelne intraperitoneale Verabreichung
an Mäuse (ddY Stamm) bestimmt. Die LD₅₀ betrug 38 mg/kg.
Wie oben gezeigt, besitzen BBM-2478A und B eine starke
antibakterielle Wirksamkeit gegen aerobe gram-positive
Bakterien und anaerobe Bakterien. Sie sind somit zur therapeutischen
Behandlung von Infektionskrankheiten bei
Säugetieren (Mensch und Tier) und anderen Tieren nützlich,
die durch derartige Bakterien hervorgerufen
werden. Diese Verbindungen können außerdem als
antibakterielle Wirkstoffe für andere übliche Anwendungszwecke
eingesetzt werden. Sie können beispielsweise zum
Desinfizieren von medizinischen und zahnmedizinischen
Ausrüstungen verwendet werden. Die signifikante Antitumorwirkung
von BBM-2478A gegenüber experimentellen Tumoren,
getestet an Mäusen, deutet darauf hin, daß BBM-2478A
auch zur Inhibierung des Wachstums von Tumoren bei Säuretieren
therapeutisch nützlich ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können somit zur Behandlung
von bakteriellen Infektionen verwendet werden.
Dazu verabreicht man eine antibakterielle Dosis von
BBM-2478A oder BBM-2478B entweder als solche oder in Form
eines pharmazeutischen Mittels an den Wirt. Außerdem
kann man die Verbindung BBM-2478A zur Bekämpfung maligner
Tumore bei Säugetieren (Mensch und Tier) verwenden.
Dazu verabreicht man eine wirksame Dosis von BBM-2478A.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein pharmazeutisches
Mittel, das eine wirksame antibakterielle Menge an
BBM-2478A oder BBM-2478B zusammen mit einem inerten pharmazeutisch
verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel
enthält. Dieses Mittel kann in jeder pharmazeutischen,
zur parenteralen Verabreichung geeigneten Form vorliegen.
Zur parenteralen Verabreichung geeignete pharmazeutische
Mittel sind beispielsweise sterile, wäßrige oder nichtwäßrige
Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie können
auch in Form steriler, fester Mittel vorliegen,
die unmittelbar vor der Verwendung in sterilem Wasser,
physiologischer Kochsalzlösung oder irgendeinem anderen
sterilen injizierbaren Medium gelöst werden.
Es versteht sich, das die vorzugsweise zu verabreichenden
Mengen der BBM-2478-Antibiotika von verschiedenen Faktoren
abhängt, z. B. von den eingesetzten Bestandteilen,
der bestimmten Formulierung, der Anwendungsart, dem speziellen
Situs, dem Wirt und der zu behandelnden Krankheit.
Der Fachmann muß dabei viele Faktoren berücksichtigen,
welche die Wirkung eines Arzneimittels beeinflussen.
Dazu zählen beispielsweise das Alter, das Körpergewicht,
das Geschlecht, der Verabreichungszeitpunkt, die Verabreichungsart,
die Ausscheidungsgeschwindigkeit, der Zustand
des Wirts, die Arzneimittelkombination, die Reaktionsempfindlichkeit
und die Schwere der Krankheit. Die erfindungsgemäßen
Verbindungen können kontinuierlich oder
in Abständen verabreicht werden.
Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der
Erfindung. Dabei sind die Temperaturen in Grad Celcius
angegeben, sofern nichts anderes ausgeführt ist. Amberlite®
CG-50
für ein schwach saures Kationenaustauschharz
vom Carbonsäuretyp. Diaion® HP-20
für ein nicht-ionisches, makroverzweigtes Polymerharz.
Eine gut-gewachene Schrägkultur des Actynomycetes-Stammes
Nr. J907-21 wurde zum Inokulieren eines vegetativen
Mediums eingesetzt, das aus 3% löslicher Stärke, 1%
Bacto-Leber, 0,5% Fischmehl, 0,3% NaCl, 0,1%
(NH₄)₂SO₄ und 0,6% CaCO₃ bestand, wobei der pH vor der
Sterilisierung auf 7,0 eingestellt wurde. Das vegetative
Medium wurde 27 Stunden auf einem Drehschüttler (250 min-1)
bei 28°C inkubiert. 5 ml der Kultivierung wurden in
einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben überführt, der 100 ml
eines Fermentationsmediums enthielt, das dieselbe Zusammensetzung
wie das vegetative Medium besaß. Die Fermentation
wurde 7 bis 10 Tage auf einem Drehschüttler bei
28°C durchgeführt. Die antibiotische Aktivität der Fermentationsbrühe
wurde mittels der Papier-Disk-Agardiffusionsmethode
unter Verwendung von Mikrococcus luteus PCI
1001 als Testorganismus durchgeführt. Nach 6- bis 7tägiger
Fermentation erreichte die antibiotische Produktivität
ein Maximum von 150 mcg/ml.
Die in Beispiel 1 erhaltene Brühe (20 l, pH 6,8) wurde
von dem Mycelkuchen und der überstehenden Flüssigkeit
mit Hilfe einer Zentrifuge vom Sharpless-Typ (Kokusan
Nr. 4A) abgetrennt. Der Mycelkuchen wurde dreimal mit
jeweils 5 l Methanol extrahiert. Nach Abfiltrieren der
unlöslichen Betandteile wurden die methanolischen
Extrakte vereinigt und im Vakuum zu einer wäßrigen Lösung
eingeengt. Die überstehende Flüssigkeit der Fermentationsbrühe
wurde mit 20 l n-Butanol extrahiert. Der Extrakt
wurde im Vakuum zu einer wäßrigen Lösung eingeengt. Die
beiden wäßrigen Konzentrate wurden vereinigt und auf
eine Diaion® HP-20
⌀5,5×60 cm) gegeben, die nacheinander mit 5 l Wasser,
5 l 50%igem wäßrigen Methanol und 6 l 80%igem wäßrigen
Methanol entwickelt wurde. Die BBM-2478 enthaltenen Fraktionen
wurden mit Hilfe eines Papierscheibenassays unter
Verwendung von B. subtilis M45 (Rec-) als Testorganismus
überrwacht. die mit 80% wäßrigem Methanol eluierten aktiven
Fraktionen wurden zusammengegeben, bei vermindertem
Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Es wurden so 4,5 g
eines gelben Feststoffs aus dem rohen BBM-2478 Komplex
erhalten. Dieser rohe Komplex wurde auf eine Silikagelsäule
(⌀3,5×55 cm) gegeben, die mit Chloroform vorgewaschen
wurde. Die aktiven Bestandteile wurden mit einer
Chloroform-Methanolmischung eluiert, wobei die Methanolkonzentration
stufenweise erhöht wurde (5-10% v/v).
Die ersten, mit 5% Methanol eluierten aktiven Fraktionen
wurden gesammelt, im Vakuum eingeengt und lyophilisiert.
Man erhielt so BBM-2478B (72 mg). Die mit 10% Methanol
eluierten, zweiten aktiven Fraktionen wurden in ähnlicher
Weise aufgearbeitet. Man erhielt so 2,5 g eines halbreinen
Feststoffes von BBM-2478A. Letzterer Feststoff wurde
an Silikagel weiter chromatographiert (Flüssigkeitschromatogramm
bei mittlerem Druck; Säule: ⌀11×500 mm;
Pumpe: Druck 80-90 psi (5,5-6,2 bar)).
Elution mit Chloroform-Methanol (97 : 3; v/v)
ergab aktive Fraktionen, die nach Einengen im Vakuum
einen homogenen Feststoff von BBM-2478A ergaben (1,30 g).
Dieser Feststoff wurde aus Methanol kristallisiert und
ergab gelblich-orangene Stäbchen von BBM-2478A Monohydrat.
Claims (4)
1. Antibiotikum BBM-2478A der Formel:
2. Antibiotikum BBM-2478B der Formel:
3. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika BBM-2478A und
BBM-2478B gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß man den Stamm J907-21 (ATCC 39 417)
oder eine BBM-2478A oder BBM-2478B produzierende Mutante
davon in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare
Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, bei submersen
aeroben Bedingungen kultiviert und dann das Antibiotikum
BBM-2478A oder BBM-2478B aus dem Kulturmedium gewinnt.
4. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend das Antibiotikum BBM-
2478A gemäß Anspruch 1 oder das Antibiotikum BBM-2478B
gemäß Anspruch 2 oder eine Mischung davon zusammen mit
einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder
Verdünnungsmittel.
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