FI79141B - Foerfarande foer framstaellning av antibiotika bbm-2478a och bbm-2478b. - Google Patents

Description

1 79141

Menetelmä antibioottien BBM-2478A ja BBM-2478B valmistami seksi

Keksinnön kohteena on menetelmä antibiootin 5 BBM-2478A, jonka kaava on HO ^ l L CH3 ° HO . \ |

' 0 OH

CH^ 6

15 3 V I

NH 2 20 CH30 ^

OH

ja antibiootin BBM-2478B, jonka kaava on 25 HO 3 30 vm! ° j^i Ί H '—tsA °γ^\Αο

35 | 0H

2 79141 valmistamiseksi.

Keksinnön mukaiset kaksi antibioottiyhdistettä ovat glykosidejä, jotka koostuvat aglykonista, chartariinista, joka on chartreusiinin aglykoni, ja yhdestä tai kahdesta 5 sokeriosasta. BBM-2478B sisältää yhden sokeriosan, jonka kaava on

HO

10 ho Λ— ch3 oh liittyneenä aglykoniin, ja toinen keksinnön mukainen antibiootti BBM-2478A sisältää lisäksi aminosokerin, jonka 15 kaava on

OH

Vö-o

CH3°—*-tsA

20 H2N

Chartresiini-antibiootissa, joka on esitetty esimerkiksi julkaisuissa J. Am. Chem. Soc. 75: 4011-4012 (1953) ja Helv. Chim. Acta 47: 1459-1484 (1964), on sama 25 aglykoniosa kuin esillä olevissa antibiooteissa, mutta se sisältää kaksi erilaista sokeria, nimittäin D-fukoosin ja D-digitaloosin. Chartresiinin rakenne on seuraava 3 79141

OH

H3C0 I

A/y D-digi taloosi s my- / />0-CH3 » -Ah rVv 0H JL A il3 3 o D-fukoosi 15 5 Γ Π OH 0 ja sitä valmistetaan fermentoimalla mikro-organismeja 20 Streptomyces chartreusis, Streptomyces Sp. no. 747 (S. vi-ridis), Streptomyces Sp. 6A36 (S. viridochromogenes) ja kahta aktinomykeetteihin kuuluvaa kantaa, joita merkitään Streptomyces Sp. X-3988 ja S-465. Chartresiini on ilmeisesti sama kuin antibiootti 747 ja antibiootti X-465A.

25 Keksinnön mukaisesti uutta antibioottikompleksia BBM-2478 tuotetaan viljelemällä aktinomykeettikantaa J907-21 (ATCC 39417) vesipitoisessa ravintoalustassa, joka sisältää assimiloituvia hiilen ja typen lähteitä, pinnan-alaisviljelmänä aerobisissa olosuhteissa, kunnes organismi 30 on tuottanut viljelyalustaan olennaisen määrän BBM-2478-kompleksia, ja ottamalla talteen BBM-2478-kompleksi vil-jelyalustasta. BBM-2478 kompleksi sisältää kaksi bioaktiivista antibioottikomponenttia, BBM-2478A ja BBM-2478B, jotka erotetaan toisistaan uuttamalla ja puhdistetaan ta-35 vanomaisin kromatografisin menetelmin.

4 79141 BBM-2478A ja B ovat antibakteerisesti aktiivisia aerobisia gram-positiivisia bakteereja ja anaerobisia bakteereja vastaan. BBM-2478A estää myös eläimillä kokeellisesti aikaansaatujen pahanlaatuisten kasvainten kasvua.

5 Kuvio 1 esittää BBM-2478A:n infrapuna-absorptio- spektrin.

Kuvio 2 esittää BBM-2478B:n infrapuna-absorptio-spektrin.

Kuvio 3 esittää BBM-2478A:n protoni-magneettisen 10 resonanssispektrin (80 MHz) CD3OD:ssä.

Kuvio 4 esittää BBM-2478A:n 13C-ydinmagneettisen resonanssispektrin (20 MHz) d6-DMS0:ssa.

Antibioottia tuottava aktinomykeettikanta J907-21 eristettiin maanäytteestä El Salvadorissa, ja se on nykyi-15 sin luokiteltu ainoastaan ei-Streptomyces-aktinomykeetti-kannaksi. Tämän organismin biologisesti puhdas viljelmä on valmistettu tavanomaisilla menetelmillä ja tallennettu laitokseen the American Type Culture Collection, Washington, D.C. tunnuksella ATCC 39417.

20 Kanta J907-21 muodostaa hyvin haarautuneita, ei- fragmentoituvia vegetatiivisia rihmastoja, mutta siltä puuttuu kyky muodostaa todellisia ilmarihmastoja. Nykyisen tutkimuksen mukaan se ei muodosta itiöitä. Koska kanta J907-21 sisältää soluseinämässä meso-diaminopirneliinihap-25 poa ja koko solun hydrolysaatissa maduroosia, se sijoitetaan soluseinämätyyppiin IIIB. Kanta J907-21 ei muodosta mitään morfologisesti tärkeitä osia, kuten itiöketjuja ja itiöpesäkkeitä. Näin ollen tällä hetkellä kanta J907-21 voidaan luokitella ainoastaan aktinomykeettikannaksi, joka 30 ei ole Streptomyces.

Kanta J907-21 muodostaa pitkiä hyvin haarautuvia vegetatiivisia rihmastoja (paksuus 0,4 pm), jotka eivät fragmentoidu sauva- tai kokkoidisoluksi. Joillakin agar-alustoilla muodostuu toisinaan surkastuneita lyhyitä il-35 marihmastoja, mutta todellista ilmarihmastoa ei muodostu millään kuvatuista kasvualustoista.

Il 5 79141

Kuten taulukosta 1 nähdään, kanta kasvaa kohtalaisesti luonnollisilla orgaanisilla alustoilla, mutta heikosti useimmilla kemiallisesti määritellyillä alustoilla. Vaikka kanta J907-21 ei muodosta todellista ilmarihmastoa, 5 niin surkastuneita lyhyitä ilmarihmastoja muodostuu osittain alustoilla ISP no 2 ja no 4 ja Bennett'in agarilla. Surkastunutta ilmarihmastoa muodostuu myös alustalla ISP no 7, johon on lisätty kobalamiinia tai vitamiinikomplek-sia. Vegetatiivisen rihmaston kääntöpuoli on useimmilla 10 agaralustoilla vaaleankeltaisesta erilaisiin ruskean sävyihin. Alustoilla ISP no 2 ja VDYA (V8-mehu-dekstroosi-hiivauute-agar) muodostuu syvän punertavaa rihmastopig-menttiä. Alustoilla ISP no 1, no 6 ja no 7 ei muodostu melanoidipigmenttiä. Alustoilla ISP no 2 pesäkkeet ovat 15 erittäin kohollaan, jäykkiä ja poimuuntuneita.

Maksimikasvu havaitaan 28°C:ssa ja 37°C:ssa.

7°C:ssa ja 45°C:ssa ei havaita kasvua. Kasvualue on 15-43°C. L-3,4-dihydroksifenyylialaniinista (L-dopa) ei muodostu melaniinia. Kanta J907-21 kestää natriumkloridipi-20 toisuutta 4 % ja sen alle, mutta ei 5 %, ja on herkkä ly-sotsyymille. Kanta J907-21 pystyy käyttämään hyväkseen lähes kaikkia pentooseja ja heksooseja. Fysiologiset tunnusmerkit on esitetty taulukossa 2 ja hiilihydraattien hyväksikäyttö taulukossa 3.

25 Soluseinämän aminohappokoostumus tutkittiin mene telmällä, jonka ovat kuvanneet Becker et ai., Appi. Microbiol. 13: 236-243 (1965), ja Yamaguchi, J. Bacteriol. 89: 444-453 (1965), sekä myös aminohappoanalysaattorilla (Hitachi 0342U malli). Koko solun hydrolysaatin sokerikompo-30 nentit identifioitiin menetelmällä, jonka ovat esittäneet Lechevalier ja Lechevalier, Chemical Methods as Criteria for Separation of Nocardiae from Other Actinomycetes. Biology of Actinomycetes and Related Organisms 11: 78-92 (1976). Kannan J907-21 soluseinämä sisältää mesodiaminopi-35 meliinihappoa ja vähäisen määrän glysiiniä. Koko solun hydrolysaatissa on todettu glukoosia, mannoosia, maduroo- e 79141 siä ja riboosia. Yllä mainittu soluseinämän koostumus ja koko solun sokerikomponentit osoittavat kannan J907-21 kuuluvan soluseinämätyyppiin IIIB.

Kanta J907-21, joka on mesofiilinen, gram-positii-5 vinen aktinomykeetti, muodostaa toisinaan surkastuneita lyhyitä ilmarihmastoja, jolloin siltä kuitenkin puuttuu kyky muodostaa todellista ilmarihmastoa, itiöpesäkkeitä ja itiöitä. Kannan J907-21 soluseinämä on tyyppiä IIIB. Tunnettuja aktinomykeettejä, joiden soluseinämä on tyyppiä 10 IIIB, ovat sukuihin Actinomadura, Microbispora, Streptos-porangium, Spirillospora, Planomonospora, Planobispora ja Dermatophilus kuuluvat lajit. Luonteeltaan aina eläinpato-geenisen suvun Dermatophilus vegetatiivisessa rihmastossa on sekä poikittaisia että pitkittäisiä väliseiniä. Kanta 15 J907-21 eroaa siten selvästi suvusta Dermatophilus. Jäl jellä oleville kuudelle suvulle on tyypillistä, että niiden ilmarihmastossa on itiörakkula (sporangium) tai art-rospori. Streptomyces-lajeista poiketen useiden näiden 6 suvun kantojen ilmoitetaan olevan enemmän tai vähemmän 20 niukasti itiöitä muodostavia. Siten kanta J907-21 kuuluu todennäköisesti johonkin näistä edellä mainituista kuudesta suvusta. Näistä 6 suvusta suvun Actinomadura on ilmoitettu olevan maailmassa laajalle levinnyt mullassa esiintyvä suku. Gordon, J. Gen. Microbiol. 109: 69-78 (1978) 25 luetteli Nocardiaen 14 fysiologista taksonomista tunnusmerkkiä, jotka johtivat lajiin Actinomadura madurae. Perustuen Gordon'in fysiologisiin tutkimuksiin kantaa J907-21 verrattiin lajiin A. madurae (taulukko 4). Kanta J907-21 muistutti lähemmin lajia Actinomadura madurae (sa-30 mankaltaisuus 85,7 %) kuin muita soluseinämätyypin IIIC ja IV omaavia lajeja (samankaltaisuus 54,8 - 76,9 %). Fysiologista sukulaisuutta kuuteen soluseinämätyypin IIIB omaavaan sukuun ei ole kuitenkaan todettu, koska nämä eroavat täysin morfologisesti kannasta J907-21. Kanta J907-21 voi-35 daan siten luokitella ainoastaan itiöitä muodostamattomak-si ei-Streptomyces-kannaksi.

li 7 79141

Taulukko 1

Kannan no J907-21 viljelyominaisuudet* Tryptoni-hiivauuteliemi G**: heikko; hyötäleisiä, (ISP no 1) vaaleankeltaisia 5 pellettejä D : ei ole

Sakkaroosi-nitraattiagar G : heikko (Czapek'in agar) R : kellertävän valkeasta (92)*** 10 vaalean oliivinruskeaan (94) A : ei ole D : ei ole

Glukoosi-asparagiiniagar G : heikko R : kellertävän valkeasta (92) 15 kohtalaisen oliivinruskeaan (95) A : ei ole D : ei ole

Glyseroli-asparagiiniagar G ; heikko 20 (ISP no 5) R : vaaleanharmahtavan kellertävän ruskeasta (79) tumman harmahtavan kellertävänruskeaan (81) A : ei ole 25 D : kohtalaisen kellertävän ruskea (77)

Epäorgaaniset suolat -tärkkelysagar G : heikko (ISP no 4) R : harmahtavan kellertävän 30 ruskea (80) A ; hyvin vähän tai ei lainkaan; jos muodostuu, se on surkastunutta, kellertävän valkoista (92) 35 D : tumman harmahtavan kellertävän ruskea (81) 8 79141

Tyrosiiniagar (ISP no 7) G : kohtalainen R : harmahtavan keltaisesta (90) syvän kellertävän ruskeaan (75) 5 A : ei ole D : ei ole

Ravintoagar G : heikko R : syvän keltaisesta (85) tumman oliivin ruskeaan (96) 10 A : ei ole D : ei ole

Hiivauute-mallasuute- G : kohtalainen agar (ISP no 2) R : tumman harmahtavan keltaisesta (91) 15 tumman oliivinruskeaan (96) A : hyvin vähän tai ei lainkaan; jos muodostuu, se on surkastunutta, vaalean harmahtavan kellertävän 20 ruskeata (79) D : tummankellertävän ruskea (78)

Kaurajauhoagar G : kohtalainen (ISP no 3) R : kellertävän valkoisesta (92) 25 harmahtavan keltaiseen (90) A : ei ole D : ei ole

Bennett'in agar G ; kohtalainen R : tumman harmahtavan 30 keltaisesta (91) tumman oliivinruskeaan (96) A : hyvin vähän tai lainkaan; jos muodostuu se on surkastunutta, kellertävän 35 valkoista (92) D ; syvän keltainen (85)

II

9 79141

Peptoni-hiivauute- G : kohtalainen rauta-agar R : vaalean oliivinruskeasta (ISP no 6) (94) syvän kellertävän ruskeaan (75) 5 A : ei ole D : loistavan oranssinkeltainen (67) VDYA-agar G : runsas (Papavizas, 1964) R : kirkkaan syvänpunaisesta 10 (14) mustanpunaiseen (21) A : ei ole D : tummanpunainen (16)

Maissijauhoagar G : runsas (Riker & Riker, 1936) R : syvän kellertävän ruskeasta 15 (75) tumman kellertävän ruskeaan (78) A : ei ole D : vahvan ruskea (55) C-2-agar G : heikko 20 Nonomura, 1971) R : vaalean kellertävän ruskeasta (76) syvän kellertävän ruskeaan (75) A : hyvin vähän tai ei lainkaan; jos muodostuu, se on 25 surkastunutta, valkoista (263) D : ei ole

Peruna-porkkana-agar G : heikosta kohtalaiseen (Cross et. ai., 1963) R : harmahtavan keltaisesta (90) 30 tumman kellertävän ruskeaan (78) A : ei ole D : tumman kellertävän vaaleanpunainen (30) 10 791 41

Pesäkealustalla ISP no 2: hyvä kasvu, erittäin kohonnut, kova poimuuntunut läpimitta 3-5 mm, punertavan musta (24) pinnan väri, ilmarihmastoa ei muodostu 5 tai se on surkastunutta * havaittu 3 viikon inkuboinnin jälkeen 28°C:ssa ** lyhenteet: G = kasvu; R = kääntöpuolen väri; A = ilmarihmasto; D = diffundoituva pigmentti 10 *** väri ja suluissa oleva numero noudattavat väristandar- dia "Kelly, K.L. & D.B. Judd: ISCC-NBS color-name charts illustrated with Centroid Colors. U.S. Dept, of Comm. Cir. 553, Washington, D.C., Nov., 1975".

Taulukko 2 15 Kannan no J907-21 fysiologiset ominaisuudet

Koe Tulos Menetelmä tai alusta

Kasvun läm- Maksimikasvu Bennett'in agar pötila-alue 28-37°C.

Kasvualue 15-43°C.

20 7°C:ssa ja 45°C:ssa ei kasvua.

Gelatiinin nesteytyy 1 % mallasuutetta, 0,4 % nesteytys hiivauutetta, 0,4 % glukoosia 20 % gelatiinia 25 Tärkkelyk- hydrolysoituu Tärkkelysagarlevy sen hydro-lyysi

Reaktio ei koaguloidu Difco rasvaton maito rasvatto- ja peptonisoituu 30 massa mai- täydellisesti dossa

Melanoidi- negatiivinen Tyrosiiniagar, peptoni- pigmentin hiivauute-rauta-agar ja muodostus tryptoni-hiivauuteliemi li n 79141

Tyrosinaa- negatiivinen Arai'n menetelmä* sireaktio

Nitraatin negatiivinen 0,5 % hiivauutetta, 1 % pelkistys glukoosia, 0,5 % KN03, 5 0,1 % CaC03 pH-tole- kasvaa pH-alueella Hiivauute-mallasuuteagar ranssi 5,0-11,0. Ei kasva pH 4,5:ssä.

NaCl-to- kasvaa NaCl-pitoi- Perusalusta: 1 % hiiva-10 leranssi suudessa 4 % tai uutetta, 2 % liukoista alle. Ei kasva NaCl- tärkkelystä, 1,5 % agaria pitoisuudessa 5 %.

Lysot- herkkä. Ei kasva Tryptikaasi-soijaliemi+ syymi- lysotsyymipitoisuu- 1,5 % agar.

15 tolerans- suudessa 0,001 %. si * Arai, T. and Y. Mikami: Chromogenicity of Streptomyces. Appi. Microbiol. 23: 402-406, 1972.

12 791 41

Taulukko 3

Kannan no J907-21 hiilihydraattien hyväksikäyttö glyseroli + d(-)-arabinoosi + 5 1(+)-arabinoosi + d-ksyloosi + d-riboosi + 1-ramroosi + d-glukoosi + 10 d-galaktoosi + d-fruktoosi + d-mannoosi + 1 (-)-sorboos i sakkaroosi 15 laktoosi sellobioosi + melibioosi trehaloosi + raffinoosi 20 d(+)-meletsitoosi liukoinen tärkkelys + selluloosa dulsitoli inositoli + 25 d-mannitoli + d-sorbitoli salisiini +

Havainnot tehty 3 viikon inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa. Peruskasvatusalusta: Pridham-Gottlieb+epäorgaaninen kasva-30 tusalusta lyhenteet: + : positiivinen hyväksikäyttö negatiivinen hyväksikäyttö li 13 791 41

Taulukko 4

Kannan J907-21 ja Actinomadura madurae-organismin diagnostis- fysiologisten ominaisuuksien vertailu_

Pilkkomistuotteet: Kanta J907-21 Actinomadura* 5 _ madurae (47)**

Adeniini +

Kaseiini + +

Hypoksantiini + +

Tyrosiini + + 10 Urea

Ksantiini Kestää:

Lysotsyymia

Rifampiinia + V

15 Hydrolyysituotteet:

Eskuliini + +

Hippuraatti + Tärkkelys + +

Hapon muodostus: 20 Arabinoosi + +

Sellobioosi + +

Glukoosi + +

Glyseroli + +

Inositoli + V

25 Laktoosi - V

Mannitoli + +

Mannoosi + +

Meletsitoosi - -

Melibioosi 30 Raffinoosi

Ramnoosi + +

Sorbitoli

Trehaloosi + +

Ksyloosi + + 14 791 41

Actinomadura*

Hyväksikäyttö: Kanta J907-21 madurae (47)**

Bentsoaatti

Sitraatti - V

5 Mukaatti

Sukkinaatti + V

Tartraatti

Nitriittiä nitraatista - +

Kestää 8h 50°C:ssa - + 10 +: positiivinen, negatiivinen, V: 15-84 % kannoista positiivisia * Gordonin et ai. tiedot 15 ** Tutkittujen kantojen lukumäärä

Keksinnön mukaisia BBM-2478 antibiootteja tuotetaan viljelemällä kantaa J907-21 (ATCC 39417) pinnanalaisissa aerobisissa olosuhteissa vesipitoisessa ravintoalustassa. 20 Organismia kasvatetaan ravintoalustassa, joka sisältää assimiloituvaa hiilen lähdettä, esimerkiksi assimiloituvaa hiilihydraattia. Esimerkkejä sopivista hiilen lähteistä ovat glyseroli, arabinoosi, ksyloosi, glukoosi, fruktoosi, mannoosi, liukoinen tärkkelys, mannitoli ja sellobioosi.

25 Ravintoalustan tulisi sisältää myös assimiloituvaa typen lähdettä, kuten kalajauhoa, soijapapujauhoa, maissin lio-tuslientä, peptoneja, lihauutetta, maa-pähkinäjauhoa, hii-vauutetta tai ammoniumsuoloja. Tarvittaessa on lisättävä epäorgaanisia suoloja, kuten natriumkloridia, kaliumklori-30 dia, magnesiumsulfaattia, kalsiumkarbonaattia, fosfaatteja ym. Alustaan lisätään haluttaessa hivenaineita, kuten kuparia, mangaania, rautaa, sinkkiä ym., tai niitä joutuu ravintoväliaineeseen muiden aineosien epäpuhtauksina. Inkubointilämpötila voi olla mikä tahansa lämpötila, jossa li is 79141 tuottava kanta pystyy kasvamaan, esim. 15-43°C, mutta edullisesti fermentointi suoritetaan 25-35°C:ssa, erityisesti 27-32°C:ssa. Alustan pH on edullisesti neutraali tai lähes neutraali ja antibioottia tuotetaan yleensä noin 5 6-10 vuorokauden ajan. Tavallisesti optimituotto saadaan noin 6-7 vuorokaudessa. Suhteellisesti pienten määrien valmistukseen voidaan käyttää ravistuspulloja ja pintavil-jelmiä, mutta suurempien määrien valmistuksessa on edullisempaa käyttää pinnanalaista aerobista viljelmää sterii-10 Iissä tankissa. Tankkifermentoinnin suorittamista varten tuotetaan edullisesti vegetatiivinen ymppi ravintoliemessä ymppäämällä liemiviljelmä organismin itiöllä, ja kun on saatu tuore vegetatiivinen ymppi, siirtämällä ymppi aseptisesti fermentointitankin alustaan. Tankkien ja pullojen 15 ilmastointi voidaan suorittaa puhaltamalla steriiliä ilmaa fermentointialustan lävitse tai pinnalle. Lisäsekoitukseen voidaan käyttää mekaanista sekoitinta. Tarvittaessa voidaan myös lisätä vaahdonestoainetta, kuten laardiöljyä.

BBM-2478:n muodostumista fermentointialustassa voi-20 daan helposti seurata fermentoinnin kuluessa paperikiekko-agar-diffuusiokokeella käyttäen koeorganismia Micrococcus luteus PCI 1001.

Kun viljelyliemen optimipitoisuus on saavutettu, huovasto ja liukenemattomat jäännökset erotetaan fermen-25 tointiliemestä tavanomaisin menetelmin, kuten suodattamalla tai linkoamalla. Huovastokakun sisältämä antibiootti voidaan ottaa talteen uuttamalla huovastokakku metanolil-la, suodattamalla pois liukenematon aines ja konsentroimalla metanoliuute vesiliuokseksi. Viljelyliemen aktiivi-30 aine voidaan ottaa talteen uuttamalla n-butanolilla ja konsentroimalla butanoliuutteet vesiliuokseksi. BBM-2478A ja B antibiootteja sisältäville vesipitoisille metanoli-ja butanoliuutteille suoritetaan sitten tavanomaisia kromatografisia puhdistustoimenpiteitä puhtaan BBM-2478-A:n ie 79141 matografisia puhdistustoimenpiteitä puhtaan BBM-2478-A:n ja B:n saamiseksi. Edullinen puhdistusmenetelmä on kuvattu jäljempänä esimerkissä 2.

BBM-2478 A ja B saatiin kellertävän oranssinvärisi-5 nä kiteisinä kiinteinä aineina. Molemmat BBM-2478-kompo-nentit eroavat chartresiinista ohutkerroskromatografiässä (TLC), kuten taulukosta 5 voidaan nähdä. BBM-2478A on helppoliukoinen dimetyylisulfoksidiin, dimetyyliformami-diin, dioksaaniin ja happopitoiseen veteen, jonkin verran 10 liukoinen metanoliin, etanoliin ja kloroformiin ja liukenematon muihin orgaanisiin liuottimiin. BBM-2478B:n liukoisuus on muuten samanlainen kuin BBM-2478A:n, mutta se on liukenematon happopitoiseen veteen. BBM-2478A ja B antavat positiivisen reaktion ferrikloridi- ja antronirea-15 genssien kanssa. BBM-2478A:11a on positiivinen ninhydrii-nireaktio, kun sensijaan BBM-2478B:n reaktio samassa kokeessa on negatiivinen. Molempien komponenttien Tolien- ja Sakaguchireaktiot ovat negatiivisia. BBM-2478A:n ja B:n fysikaaliskemialliset ominaisuudet on koottu taulukkoon 20 6. Molempien komponenttien UV-spektrit ovat samankaltai set: niissä on maksimit 236, 266, 398 ja 422 nm neutraalissa ja happamessa liuoksessa ja maksimit 240, 268 ja 435 nm alkalisessa liuoksessa. Nämä spektrit muistuttavat läheisesti chartresiinin spektriä. BBM-2478A:n ja B:n IR-25 spektrit on esitetty kuvioissa 1 ja 2. BBM-2478A:n pro toni- (PMR) ja 13C-NMR- (CMR) spektrit on vastaavasti esitetty kuvioissa 3 ja 4.

Taulukko 5 BBM-2478A:n ja B:n ja chartresiinin TLC 30 Si02 Si02 CHC1-, -MeOH (7:3) EtOAc-MeOH (1:1) BBM-2478A Rf 0,37 0,16 BBM-2478B 0,78 0,57

Chartresiini 0,65 0,48 i7 791 41

Taulukko 6

BBM-2478A:n ja B:n fysikaalis-kemialliset ominaisuudet: BBM-2478A BBM-2478B

Luonne Keltainen amorfinen Keltainen amorfinen 5 j auhe j auhe

Sp. 225 - 226°C 271 - 272°C (haj.) [a]^6 (c, 0,5,

pyrididini) + 124°C - 8°C

UV λ MeOH nm (ΕΪ * ) 10 236 (590) 236 (740) 266 (550) 266 (700) 333 (100) 333 (118) 378 (132) 378 (169) 398 (205) 398 (255) 15 422 (225) 422 (290)

Analyysi Saatu: C 59,28 C 63,07 H 5,40 H 4,51 N 2,06

Laskettu kaavalle: 20 c33h35no13-h2o c26h2 2 01 0 C 59,01 C 63,16 H 5,55 H 4,48 N 2,09 BBM-2478A:n CMR-spektri osoittaa rakenteessa olevan 25 33 hiiliatomia, joihin sisältyy 4 C-CH3, 1-0CH3, 9 ^CH-, 1 , 5 -CH= ja 13 >C= -ryhmää. Näistä CMR-spektrin tu loksista yhdessä mikroanalyysitulosten kanssa saatiin antibiootin BBM-2478A:n molekyylikaavaksi C33H35N033. BBM-2478A hydrolysoitiin 0,4-M HCl-metanoliliuoksella kuumen-30 taen palautusjäähdyttäen tunnin ajan. Saostuneet keltaiset kiteet suodatettiin ja suodos konsentroitiin vakuumissa siirapiksi, joka sisälsi ninhydriini-positiivisia sokeri-fragmentteja. Kiteinen aine identifioitiin chartariiniksi, chartresiinin aglykoniksi vertaamalla sen ja autenttisen 35 näytteen spektrianalyysejä.

1 R n /^141

Chartariini 10

Vesipitoisen konsentraatin sisältämä sokerifrag-mentti oli disakkaridin (yhdiste I) anomeerinen seos, jos-15 ta erotettiin kromatografisesti Amberlite CG-50:llä (NH4 + -muoto) a- ja β-metyyliglykosidit suunnilleen yhtä suurina määrinä. Massaspektrin M++l:m/z 352) ja CMR-spektrin mukaan yhdisteiden Ia ja Ib molekyylikaavat olivat kumpikin Cx5H29NOg. Yhdisteiden Ia ja Ib fysikaalis-kemialliset 20 ominaisuudet on koottu taulukkoon 7. Yhdisteiden Ia ja Ib edelleen hydrolysoiminen hapon avulla ei onnistunut, vaan aiheutti muodostuneiden sokerifragmenttien laajaa hajoamista, kun käytettiin niin vahvaa happokäsittelyä, että glykosidisicios katkesi. Kaavojen Ia ja Ib seos (370 mg) 25 asetyloitiin metanolissa, jolloin saatiin mono-N-asetyyli-johdannainen (460 mg, M*+l:m/z 394), joka hydrolysoitiin 4,5-m HCl-metanoliliuoksella. Tuote kromatografoitiin si-likageelikolonnissa CHC13-MeOH-väkevä NH4OH-seoksen (6:1:1) alemmalla faasilla, jolloin saatiin N-asetyyliami-30 nosokerin a- ja β-anomeerit (yhdiste N-Ac-IIa, 140 mg ja N-Ac-IIb, 22 mg) ja neutraalin sokerin a- ja β-anomeerit (yhdiste lila, 85 mg ja Illb 79 mg). Käsiteltäessä yhdistettä N-Ac-IIa kyllästetyllä Ba(OH)2-liuoksella yhdiste muuttui kvantitatiivisesti vapaaksi aminoyhdisteeksi (yh-35 diste Ha). Yhdisteiden Ha, Ula ja Illb fysikaalis-ke-

II

19 791 41 mialliset tunnukset on esitetty taulukossa 8. Analyysin ja NMR-spektrin perusteella Ha määritettin metyyli-2-ami-no-2,6-dideoksi-3-0-metyyli-a-D-galaktopyranosidiksi. Kuten taulukosta 8 nähdään, Ha sisältää 5 rengasprotonia, 5 2 OCH3-signaalia ja yhden C-CH3-signaalin. Rengasprotonien ensimmäisen kertaluvun analyysi osoitti kytkentävakiot Jj.2*23,8, J2 3=10,5, J3_4=3,0, 04_5<1,0 ja 05_6=6,4 Hz, jotka ovat yhtäpitäviä esitetyn rakenteen kanssa. Lisäksi N,0-diasetyyli-IIa:n fysikaalis-kemialliset tunnukset (mp. 10 163-164°C ja [a]33:+154° (c, 0,3, CHC13 )) ovat samankal taiset kuin M.B. Perryn (Can. J. Chem. 52: 3251-3255 (1974 ) metyyli-2-asetamido-4-0-asetyyli-2,6-dideoksi-3-0-metyyli-a-D-galaktopyranosidille ilmoittamat.

15 0H

L ch3

Y\\ Ha: Rx = 0CH3 , R2 = H

ch3oA-A IIb: R. « R> - nhJA^ R2 20 R1 lila:n PMR-spektri osoitti kytkentävakioiden olevan 0^2=4,5, J4_5<1,0 ja J5_6=6,7 Hz, ja IIIb:n kytkentävakioiden olevan 03.2=7,8, 04.5<1,0 ja 05.6=6,5 Hz. Kumman-25 kin spektri osoitti C3:n rengasprotonin puuttuvan. Spektrianalyysi osoitti lila:n ja IIIb:n olevan 6-deoksi-3-C-metyyligulopyranosidin (metyylivirenosidi) tai 6-deoksi- 3-C-metyyli-galaktopyranosidin a- ja vastaavasti β-metyy-liglykosidi. Metyyli-p-D-virenosidin autenttisen näytteen 30 osoitettiin TLC-analyysillä ja NMR-spektrillä olevan eri yhdiste kuin Illb: metyylivirenosidin Η3- ja H6-signaalit havaittiin huomattavasti alemmassa kentässä kuin vastaavat IIIb:n signaalit, mikä osoittaa, että metyylivirenosidin . . C3-OH on orientoitunut aksiaalisesti kun sensijaan IIIb:n 35 C3-OH on orientoitunut ekvatoriaalisesti. IIIa:n ja IIIb:n 20 7 9 1 41 optisen kiertokyvyn ja Illarn Δ[Μ]εuAm-arvon (1309°) perusteella yhdisteen III konfiguraatio on D-konfiguraatio. Siten lila ja Illb määritettiin metyyli-6-deoksi-3-C-me-tyyli-α- ja β-galaktopyranosideiksi.

5 OH

V - T3

\ M Ula: R, = OCH, , R-, = H

\ 0 HO —Λ__\ Illb: R, = H, R, = 0CH-.

Ri

Molempien sokerien sidoskohdat määritettiin Ia:n ja Ib:n ja niiden asetaattien massaspektrien avulla, joissa todettiin disakkaridisekvenssistä II -» III johtuvia 15 fragmentti-ioneja. N,0-triasetyyli-Ia:n 200 MHz PMR-spekt-ri ja suoritettu pilkkominen osoittivat, että sokeri II liittyi III:n C2-OH-ryhmään α-glykosidisidoksella, joten yhdisteiden Ia ja Ib kaavoiksi määritettiin seuraavat:

HO

20 I

l. CH3 ho V4- 0 L C„3 CH3a—K \ i,

H2N η HO

25 \ ch3 J

\ J Ri

Ia: Rx = OCH3 , R2 = H ^------0

Ib: Rj = H, R2 = OCH3 30 Eri pH-arvoissa mitatut BBM-2478A:n UV-spektrit ovat hyvin samankaltaisia kuin chartresiinilla. Tämän perusteella oletetaan, että BBM-2478A:n disakkaridiosa on liittynyt samaan chartariinin hydroksyyliryhmään kuin chartresiinissa. BBM-2478A:n ja chartresiinin IR-spektrit 35 kloroformissa osoittivat karbonyyliabsorption samaa mal- 21 79141 lia, mikä tukee edellä olevaa johtopäätöstä. N-asetyyli-BBM-2478A:n NMR-spektrissä III:n anomeerinen protoni aiheutti dubletin, jonka tilavakio J=8,0 Hz, jonka perusteella antibiootin pääteltiin olevan konformaatioltaan 5 III:n β-pyranosidi.

Mikroanalyysin perusteella BBM-2478B:n molekyyli-kaavaksi määritettiin C26H220X0. Lievällä happamella meta-nolyysillä BBM-2478B:stä saatiin chartariinia ja neutraaleja sokereita (lila ja Illb), jotka olivat identtisiä 10 BBM-2478A:sta saatujen kanssa. BBM-2478B on siten ilmei sesti BBM-2478A:n analogi, jossa ei ole aminosokeriosaa (II). BBM-2478A:n ja B:n rakenteiksi määrättiin siten seu-raavat: U r*

l 32M"2478A

u**3 0 "-J

NH2 CH3 CH-P^

J

OH

22 7 9 1 41 νγΝ I ΒΒΜ-2478Β

5 HO CX

w xXx «λ_~λ yys 10 CH3 ---

II

23 79 1 41

Taulukko 7

Yhdisteiden Ia ja Ib fysikaalis-kemialliset ominaisuudet Yhdiste Ia Yhdiste Ib 5 Luonne valkea jauhe valkea jauhe

S.p. 79 - 82*C 80 - 83*C

[aJD (c lf0, HjO) +211' +116' 10 TLC n-BuOH-AcOH-H20 Rf 0,19 0,15 (63:10:27)

Molekyy likaava C15H29N08 C15H29N08

Massa spektri (m/z) 352 (M +1* 352 <M +15 319 319 15 235 235 160 160 PMR (60 MHz D20:ssa) S 1,25 (3H, d) 1,23 (3H, d) (ppm) 1,28 OH, d) 1,26 (3H, d) 1,37 (3H, s) 1,29 (3H, s) 2Q 3,03 (1H, d-d) 3,07 (1H, d-d) 3,41 (3H, s) 3,44 (3H, s) 3,46 (3H, s) 3,54 (3H, s) 3,6 -4,5 (6H, n) 3,4-4,4 (6H, m) 4,90 (lH,drJ-4,3 Hz) 4,50 (lH,d,J-8,0 H2) 4,98 (lH,d,J»3,5 Hz) 5,09 (lH,d,J«3,5 Hz) 1 5 24 791 41

Taulukko 8

Yhdisteiden Ha, lila ja Illb fysikaalis-kemialliset ominaisuudet 5 Ha_ lila_ Illb_ vaaleankeltainen siirappi vaaleankeltainen vaaleankeltainen Luonne siirappi siirappi [e] +106MC 0,2,MeoH) +152Mc 0,5,CHC13) -33» (c 0,5.CHCI3) TX.C s Rf 10 CHCl3-MeOH-NH4OH 0,67 °/35 0,22 (2:l:l)alempi faasi n-Bu0H-Ac0H-H20 _ 0,20 °f47 °/40 (62:10:27)

Molekyy likaava c8h1?no4 csal6°5 C8H16°5 15 PMR, 60 MHz D 0:ssa V6 <d'3H'6'4>1 ^27 (d'3H'6?75 1J27 (s'3H) { fppa) 2 2,97 (d-d,1H,3,8610,5) 1,34 (s,3H) 1,28 (d,3H,6,5) 3,41 (S,3H) 3,38 <s,3H) 3,45 (br-s.lH) 3 43 (s#3H) 3,48 (br—S/lH) 3,52 (d,lti,7,8) 3 45 (d-d,lH,3;04l0,5) 3,83 (d,IB,4,5) 3,60 (s, 3H) 4j 00 (q,lH,6,4) 4,18 (q»lH,6,7) 4,00 (q,lH,6,5) 20 4,02 (br-d,1H,3,0) 4,75 (d,lH,4,5) 4,39 (d,lH.7,8) 4,72 (d,lH,3,8) li kerrannaisuus, protoni, J(Hz) 2 25 79141 BBM-2478:n minimiestokonsentraatio (MIC) määritettiin useita erilaisia gram-positiivisia ja gram-negatii-visia bakteereja ja sieniä vastaan sekä joitakin anaerobisia organismeja vastaan kaksinkertaisella agarlaimennus-5 sarjamenetelmällä käyttäen vertailuun chatresiinia. Gram- positiivisten ja gram-negatiivisten bakteerien kokeissa käytettiin ravintoagar-alustaa, anaerobisten organismien kokeissa GAM-agar-alustaa ja sienten kokeissa Sabouraud-agar-alustaa. Kuten taulukosta 9 voidaan nähdä, 10 BBM-2478A:11a ja B:llä ja chartresiinilla on samankaltai nen antibakteerinen spektri gram-positiivisia bakteereja ja anaerobisia organismeja vastaan, jolloin ne olivat inaktiivisia gram-negatiivisia bakteereja ja sieniä vastaan. BBM-2478A:n anti-stafylokokki-aktiivisuus oli 2-4 kertai-15 nen BBM-2478B:n tai chartresiinin vastaavaan aktiivisuuteen verrattuna.

Taulukko 9 BBM-2478A:n ja B:n antibakteerinen aktiivisuus MIC (pg/ml) 20 Koeorganismi BBM-2478A BBM-2478B Chartresiini

Staphylococcus aureus 209P 1,6 3,1 3,1

Staphylococcus aureus Smith 0,8 6,3 6,3 25 Bacillus subtilis PCI 219 0,8 0,8 0,4

Micrococcus luteus PCI 1001 0,8 3,1 0,8

Micrococcus flavus 30 D12 0,8 1,6 0,4

Escherichia coli NIHJ 100 >100 >100

Klebsiella pneumoniae

Dll 100 >100 >100 35 Pseudomonas aeruginosa D15 100 >100 >100 26 7 9 1 41

Koeorganismi BBM-2478A BBM-2478B Chartresiini

Candida albicans IAM 4888 >100 >100 >100

Cryptococcus neofor- 5 mans D49 >100 >100 >100

Aspergillus fumigatus IAM 2530 >100 >100 >100

Trichophyton menta- grophytes D155 >100 >100 >100 10 Bacteroides fragilis 12,5 6,3

Clostridium difficile 12,5 25

Clostridium per- fringens 6,3 1,6

Proplonibacterium 15 acnes 6,3 3,1 BBM-2478A:n kasvaintenvastainen aktiivisuus määritettiin lymfosyyttistä leukemiaa P388, lymfoidileukemiaa L1210 ja melanoottista melanoomaa B16 vastaan hiirillä 20 käyttäen vertailuun chartresiinia. Kasvaimet istutettiin intraperitoneaalisesti BDF1 -hiiriin vastaavina määrinä ΙΟ6, 105 ja 106 solua hiirtä kohti. Koeyhdisteet liuotettiin 0,9-%:iseen suolaliuokseen, joka sisälsi 10 % dime-tyylisulfoksidia, ja antibioottia annostettiin asteittain 25 alenevina annoksina intraperitoneaalisesti 24 tuntia kasvaimen istuttamisen jälkeen. Käsittelyjä annettiin kerran päivässä 9 vrk ajan (qd l-*9). Tulokset nähdään taulukoissa 10, 11 ja 12. BBM-2478A:n aktiivisuus oli noin 10-30-ker-tainen chartresiinin aktiivisuuteen verrattuna, kun ver-30 tailuun käytettiin minimi-teho-arvoja, ja kaikkia kokeiltuja kasvaimia vastaan saadut T/C-arvot olivat parempia kuin chartresiinilla. BBM-2478B:llä ei havaittu kasvain-tenvastaista aktiivisuutta. BBM-2478A:n akuutti myrkyllisyys määritettiin hiirillä (ddY-kanta) yhdellä ainoalla 35 intraperitoneaalisella annoksella, LD50 oli 38 mg/kg.

27 791 41

Taulukko 10 BBM-2478A:n vaikutus P388-leukemiaan

Keskim.pai-Hengissä olevia Annos, ip · MST T/C non muutos päivänä 5 (mg A g/vrk*) (päiviä) (¾) päivänä 5(g) 5 45 BBM-2478A 3 20,0 -1,0 S/5 0/5 1 21,5 (539) +0,8 6/6 0/5 0,3 17,0 CTes) +1,8 6/6 0/6 0;1 14,5 (Tel) +1,2 6/6 0/6 0,03 10,0 111 +2,3 6/6 0/6 0,01 10,0 111 +2,0 6/6 0/6 10

Chartresi im 10 19,5 (217) +1,3 6/6 0/6 3 15,0 (167) +1,5 6/6 0/6 1 14,0 (156) +1,3 6/6 0/6 0,3 10,5 117 +2,0 6/6 0/6 0,1 9,0 100 +2,8 6/6 0/6 15 Väliaine - 9,0 - +2,4 12/12 0/12 * qd 1 - 9 •♦Ympäröidyt tulokset osoittavat merkitsevää kasvaintenvas-taista vaikutusta 20 28 791 41

Taulukko 11 BBM-2478A:n vaikutus LI21Q-leukemiaan

Keskim.pai- Hengissä olevia Annos, ip. T/c nonmuutos päivänä 5 (?3Λ9Λί&*) (Päiviä 1 (¾) päivänä 5/ai 5 4 7 BBM-2478A 3 12,0 (Ud)** -0,1 6/6 0/6 1 11,0 (UI) +0,8 6/6 0/6 0,3 10,5 (Up +1, 3 6/6 0/6 0,1 8,0 100 +2,6 6/6 0/6 0,03 8,0 100 +2,9 6/6 0/6 ,p 0,01 8,0 100 +3,2 6/6 0/6

Chartres i in i 10 11,5 (UT) +1,3 6/6 0/6 3 9,0 113 +1,4 6/6 0/6 1 9,0 113 +1,9 6/6 0/6 0,3 8,0 100 +3,2 6/6 0/6 0,1 8,0 100 +3,1 6/6 0/6 15 Väliaine - 2,0 - +2,8 12/12 0/12 * qd 1 - 9 ** Ympäröidyt· tulokset osoittavat merkitsevää kasvainten- vastaista vaikutusta.

20 29 79 1 41

Taulukko 12 BBM-2478A:n vaikutus B16-melanomaan

Keskim.painon Hengissä olcvi

Annos, id. MST τ/r ..... .......

' F ... .. muutos päivä- päivänä (maAq/vrk *) (Palvia (%) nä 5 (g) 5 45 5 " BBM-2478A 3 41,5 (296/** +1,5 6/6 0/6 1 34,5 (246) +2,2 6/6 0/6 0,3 25,5 (182) +2,5 6/6 0/6 0,1 18,5 (Op +2,5 6/6 0/6 0,03 16,0 114 +2,0 6/6 0/6 10

Chartresiini 10 25^0 (l7?) +1,7 6/6 0/6 3 20,5 Cl4 6j +2,3 6/6 0/6 1 16,0 114 +2,3 6/6 1/6 0,3 14,0 100 +1,8 6/6 0/6 Väliaine * " +2,1 10/10 0/10 15 * gd - 9

Ympäröidyt tulokset osoittavat merkitsevää kasvaintenvastaista vaikutusta .

30 7 91 41

Kuten edellä olevasta nähdään, BBM-2478A:11a ja B:llä on vahva antibakteerinen aktiivisuus aerobisia gram-positiivisia bakteereja ja anaerobisia bakteereja vastaan, joten ne ovat käyttökelpoisia tällaisten bakteerien ai-5 heuttamien tartuntatautien käsittelyssä nisäkkäillä ja muilla eläimillä. Lisäksi nämä yhdisteet sopivat muihin antibakteeristen aineiden tavanomaisiin käyttötarkoituksiin, kuten desinfiointiaineisiin ja hampaiden hoitoväli-neisiin.

10 BBM-2478A:n merkitsevä kasvaintenvastainen aktiivi suus hiirillä kokeellisesti aikaansaaduissa kasvainsystee-meissä osoittaa BBM-2478A:n olevan myös terapeuttisesti käyttökelpoinen nisäkkäiden kasvainten kasvua estävänä aineena.

15 Antibiootteja voidaan käyttää farmaseuttisina koos tumuksina, jotka sisältävät antibakteerisesti vaikuttavan määrän BBM-2478A:ta tai BBM-2478B:tä yhdessä inertin, farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai laimentimen kanssa. Tällaiset koostumukset voidaan valmistaa mihin tahansa 20 farmaseuttiseen muotoon, joka sopii parenteraaliseen lää-keantoon.

Parenteraaliseen lääkeantoon käytettävät valmisteet : käsittävät steriilejä, vesipitoisia tai vedettömiä liuok sia, suspensioita ja emulsioita. Ne voidaan valmistaa myös 25 steriilien kiinteiden koostumusten muotoon, jotka ennen käyttöä voidaan liuottaa steriiliin veteen, fysiologiseen suolaliuokseen tai muuhun steriiliin injektoitavaan väliaineeseen.

On huomattava, että käytetty edullinen määrä BBM-30 2478 antibiootteja riippuu käytetystä komponentista, koos tumuksen formulaatiosta, lääkkeenantotavasta ja käsiteltävän potilaan tilanteesta, potilaasta ja taudista. Alan asiantuntija ottaa tällöin huomioon monet lääkintään vaikuttavat tekijät, esimerkiksi potilaan iän, kehon painon, 35 sukupuolen, ravintovalion, lääkkeen annostuksen ajankohdan, annostustavan, lääkkeen erittymisen, muiden lääkkei-

II

31 79141 den vaikutuksen, potilaan herkkyyden ja taudin vakavuuden. Lääkeanto voidaan suorittaa jatkuvana tai jaksottain siedettävän maksimiannoksen määräämissä rajoissa. Alan asiantuntija voi varmistaa optimaalisen annostusmäärän tietyis-5 sä olosuhteissa käyttäen tavanomaisia annoksen määritys-kokeita, joissa otetaan huomioon edellä esitetyt ohjeet.

Seuraavat esimerkit esitetään keksinnön valaisemiseksi, eikä niiden tarkoituksena ole rajoittaa keksinnön suojapiiriä. Kaikki lämpötilat ovat Celcius-asteina, jol-10 lei muuta mainita. Amberlite CG-50 on firman Rohm & Haas, Philadelphia, Pa., USA, tavaramerkki, ja se on heikosti hapan kationinen karboksyylihappotyyppiä oleva ionin vaihtohartsi. Diaion HP-20 on firman Mitsubishi Chemical Industries, Japani, tavaramerkki, ja se on ei-ioninen 15 makroretikulaarinen polymeerihartsi.

Esimerkki 1 BBM-2478A;n ja B:n fermentolnti

Hyvin kasvanutta aktinomykeettikannan nro J907-21 vinoviljelmää käytettiin ymppäämään vegetatiivista alus-20 taa, joka sisälsi 3 % liukoista tärkkelystä, 1 % Bacto-maksauutetta (Difco), 0,5 % kalajauhetta, 0,3 % NaCl, 0,1 % (NH4 )2S04 ja 0,6 % CaC03 ja jonka pH ennen sterilointia oli säädetty arvoon 7,0. Vegetatiivista alustaa inkuboitiin 28°C:ssa kiertoravistimessa (250 r/min) 72 25 tuntia, sitten 5 ml kasvustoa siirrettiin 500 ml:n erlen-meyeriin, joka sisälsi 100 ml fermentointialustaa, jonka koostumus oli sama kuin vegetatiivisella alustalla. Fer-mentointi suoritettiin kiertoravistimessa 28°C:ssa 7-10 vuorokauden ajan. Fermentointiliemen antibioottiaktiivi-30 suus määritettiin paperikiekko-agardiffuusiomenetelmällä käyttäen koeorganismia Micrococcus luteus PCI 1001. 6-7 vuorokauden fermentoinnin jälkeen antibiootin tuotto saavutti maksimiarvon 150 pg/ml.

35 32 7 91 41

Esimerkki 2 BBM-2478A:n ja B:n eristäminen ja puhdistaminen

Esimerkissä 1 valmistettu talteenotettu liemi (20 1, pH 6,8) jaettiin huovastokakuksi ja supernatantiksi 5 Sharplesstyypin lingossa (Kokusan nro 4A). Huovastokakku uutettiin metanolissa (3 x 5 1). Liukenematon aines poistettiin metanoliuutteista ja yhdistetyt uutteet konsentroitiin vakuumissa vesiliuokseksi. Fermentointiliemen su-pernatantti uutettiin n-butanolilla (20 1), ja uute haih-10 dutettiin vakuumissa vesiliuokseksi. Molemmat vesipitoiset konsentraatit yhdistettiin ja vietiin Diaion HP-20 hartsia (Mitsubishi Chem. Industries, Tokio) sisältävään kolonniin (0 5,5 cm, korkeus 60 cm), joka kehitettiin peräkkäin vedellä (5 1), 50 %:isella vesipitoisella metanolilla (5 1) 15 ja 80-%:isella vesipitoisella metanolilla (6 1). BBM- 2478:aa sisältävät fraktiot määritettiin paperikiekkomene-telmällä käyttäen koeorganismia B. subtilis M45 (Rec‘). Aktiiviset fraktiot eluoituivat 80-%:isella vesipitoisella metanolilla, ne yhdistettiin, haihdutettiin alennetussa 20 paineessa ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 4,5 g keltaista kiinteätä raakaa BBM-2478-kompleksia. Raakakomplek-si vietiin silikageelikolonniin (Φ 3,5, korkeus 55 cm), joka oli esipesty kloroformilla, ja aktiivinen aine eluoi-tiin kloroformimetanoliseoksella, jonka metanolikonsent-25 raatiota suurennettiin asteittain (5 10 tilav./tilav-%).

Ensimmäiset aktiiviset fraktiot eluoituivat 5-%:isella metanolilla, ne koottiin, konsentroitiin vakuumissa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 72 mg BBM-2478B:tä. Seu-raavat aktiiviset fraktiot eluoituivat 10-%:isella metano-30 liseoksella, eluaattia käsiteltiin samalla tavalla, jolloin saatiin puolipuhdasta kiinteätä BBM-2478A:ta (2,51 g). Se puhdistettiin edelleen kromatografioimalla silikageelillä käyttäen keskipaineista nestekromatografiaa (kolonni: Kiriyma Φ 11, korkeus 500 mm; pumppu: FMI Lab 35 pump, paine: 551 621 kPa). Eluoimalla kloroformi-metano-li-seoksella (97:3 tilavuusosia) saatiin aktiiviset frak- 33 791 41 tiot, joista konsentroimalla vakuumissa saatiin homogeeninen kiinteä BBM2478A (1,30 g). Se kiteytettiin metano-lista, jolloin saatiin kellertävän oranssinvärisiä sauva-maisia BBM-2478A-monohydraatti kiteitä.

5

Claims (5)

1. 34 79 1 41 Patenttivaatimus Menetelmä antibiootin BBM-2478A, jonka kaava on HO ^ I I oh °Yr x° i.rtV o Vv \ x°
2. 15 NH2—^_^7^Y~CH3 CH30 I OH 20 ja antibiootin BBM-2478B, jonka kaava on HO 3 '^r^\ ! ° L
3. 25 V\CH3 I OH 30 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään aktinomykeettikantaa J907-21 (ATCC 39417) vesipitoisessa 35 ravintoalustassa, joka sisältää assimiloituvia hiilen ja li 35 79141 typen lähteitä, pinnanalaisissa aerobisissa olosuhteissa, kunnes mainittu organismi on tuottanut viljelyalustaan olennaisen määrän BBM-2478-antibioottikompleksia, minkä jälkeen BBM-2478-antibioottikompleksi otetaan talteen vil-5 jelyalustasta, ja antibioottikomponentit ΒΒΜ-2478Δ ja BBM-2478B erotetaan uuttamalla ja puhdistetaan kromatografisin menetelmin. 36 791 41 Förfarande för framställning av antibiotikumet BBM-2478A med formeln 5 HO ^ I 10 HO “—S--—. \ J ' ^ 0 OH CH3 \ Ύ[
4. 15 K \ n:h 2 ch3 CH O | 2 n ^ I zu OH och antibiotikumet BBM-2478B med formeln H,C^
5. 25 HO ^ | 30 °^Η~~3 | OH *· 35 kännetecknat därav, att actinomycesstammen - J907-21 (ATCC 39417) odlas i ett vattenhaltigt naringsme-