FR2555586A1 - Complexe antibiotique bbm-2478 - Google Patents

Abstract

COMPLEXE ANTIBIOTIQUE NOUVEAU DENOMME BBM-2478 PRODUIT PAR FERMENTATION D'UNE SOUCHE D'ACTINOMYCETE J907-21 (ATCC 39417). LE COMPOSE PEUT ETRE SEPARE PAR CHROMATOGRAPHIE EN DEUX COMPOSANTS BIOACTIFS DESIGNES BBM-2478A ET BBM-2478B, LE BBM-2478A DEPLOIE UNE ACTIVITE A LA FOIS ANTIBACTERIENNE ET ANTITUMEUR TANDIS QUE LE BBM-2478B PRESENTE UNE ACTIVITE ANTIBACTERIENNE.

Description

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COMPLEXE ANTIBIOTIQUE BBM-2478

L'invention concerne un complexe antibiotique antitumeur nouveau et elle concerne sa production, sa récupération et sa séparation en deux composants bioactifs. Les deux composés antibiotiques selon la présente invention sont des glycosides composés d'un aglycone, la chartarine, l'aglycone de la chartreusine et l'un ou l'autre de deux radicaux sucre. Le BBM-2478B possède un radical sucre de formule: H"

HO ST3

CH3 OH '

attaché à l'aglycone tandis que le BBM-2478A, l'autre antibiotique selon la présente invention, possède en outre le sucre aminé de formule: OH CH3H3

CH3 O

H0N

H2N

La chartreusine antibiotique décrite par exemple dans J. Am. Chem. Soc. 75, 4011-4012 (1953) et Helv. Chim. Acta 47, 1459-1484 (1964)

contient la même portion aglycone que les antibiotiques selon la pré-

sente invention mais elle contient deux sucres différents, c'est-à-dire le D-fucose et le D-digitalose. La chartreusine a la structure OH 3 Ddigitalose HO uo CH3 H HO CH3 OH D-fucose o. O et elle est produite par fermentation du Streptomyces chartreusis,

Streptomyces Sp. n 747 (S. viridis), Streptomyces Sp. 6A36 (S.

viridochromogenes) et par deux souches d'actinomycètes dénommées Streptomyces Sp. X-3988 et S-465. La chartreusine est apparemment

identique à l'antibiotique 747 et l'antibiotique X-465A.

La présente invention procure un nouveau complexe antibiotique dénommé BBM-2478, ce complexe étant produit en cultivant une souche d'actinomycète-dénommée souche J907-21 (ATCC 39417), ou des variations ou des mutants de celle-ci dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote dans des conditions aérobies submergées jusqu'à ce qu'une quantité substantielle de complexe BBM-2478

soit produite par cet organisme dans ce milieu de culture et ultérieure-

ment en récupérant le complexe BBM-2478 du milieu de culture. Le comple-

xe BBM-2478. contient deux composants bioactifs antibiotiques dénommés BBM-2478A et BBM-2478B que l'on peut séparer par des modes opératoires chromatographiques classiques et isolés sous une forme sensiblement pure. Les BBM-2478A et B présentent une activité antibactérienne contre

les bactéries gram-positives aérobies et les bactéries anaérobies.

Le BBM-2478A inhibe également la croissance des tumeurs malignes dans

les expériences sur les tumeurs animales.

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Description des dessins

- la figure 1 représente le spectre d'absorption infrarouge du

BBM-2478A,

- la figure 2 représente le spectre d'absorption infrarouge du

BBM-2478B,

- la figure 3 représente le spectre de résonance magnétique pro-

tonique (80 MHz) du BBM-2478A dans le CD30D; - la figure 4 montre le spectre de résonance magnétique nucléaire

en 13C (20 MHz) du BBM-2478A dans le d6-DMSO.

La présente invention concerne des antibiotiques à base de glyco-

side nouveaux dénommés ici BBM-2478A et BBM-2478B et elle concerne leur préparation par fermentation d'une souche d'actynomycète dénommée souche

J907-21.

L'organisme producteur, isolé à partir d'un échantillon de sol recueilli au Salvador, à été classifié actuellement seulement sous le

nom d'une souche actinomycète non-streptomyces. Une culture biologique-

ment pure de cet organisme a été préparé par des modes opératoires classiques et elle a été déposée à American Type Culture Collection,

Washigton, D.C. sous le n0 d'accès ATCC 39417.

Taxonomie de la culture de production La souche J907-21 forme des mycéliums végétatifs bien branchés ne se Fragmentanc pas, mais elle manque de la capacité de portée des mycéliums vraiment aériens. Telle que examinée jusqu'à maintenant, elle est asporogénique. Puisqu'elle contient de l'acide méso-diaminopimélique dans la paroi de la cellule et du madurose dans l'hydrolyzat de cellule complète, la souche J907-21 est classée dans les parois de cellules du type 111B. La souche J907-21 ne porte aucun corps morphologiquement

important tel que des chaînes de spores et de sporange. Ainsi, actuel-

7ement, la souche J907-21 ne peut être classifiée que comme une souche

d'actinomycéte non-streptomyces.

Mohologi_e La souche J907-21 forme des mycéliums végétatifs bien branchés allongés (0,4 m de largeur) qui ne se fragmentent pas en batonnets ou en cellules coccoYdes. Des mycéliums aériens courts rudimentaires se forment occasionnellement sur quelques milieux d'agar-agar, mais un mycélium aérien vrai ne se forme pas sur tous les milieux décrits. Des corps formant des spores et des spores ne sont pas observés dans les examens

réalisés jusqu'à maintenant.

Caractéristiques culturalles Comme indiqué sur le tableau I, la souche croit modérément sur des milieux organiques naturels mais faiblement sur la plupart des milieux chimiquement définis. Bien que la souche J907-21 ne forme pas un mycélium

aerien vrai, des mycéliums aériens courts rudimentaires se forment partiel-

lement sur les milieux ISP n 2 et 4 et l'agar-agar de Bennett. Le mycélium aerien rudimentaire se forme également sur le milieu ISP n 7 auquel on a ajouté, en supplément, de la cobalamine ou un complexe de vitamine. La couleur d'envers des mycéliums végétatifs va du jaune pale à diverses teintes de brun sur la plupart des milieux d'agar-agar. Un pigment mycélien rougeâtre foncé est produit sur le milieu ISP n02 et le VDYA (jus de V8-dextrose-levure-extrait d'agar-agar). Un pigment mélanoTde ne se produit pas sur les milieux ISP n l, 6 et 7. La colonie formee sur le

milieu ISP n 2 est extrêmement droite, rigide et pliee.

Caractéristiques physiologiques La croissance maximum s'observe à 28 C et 37 C. On n'observe pas de croissance à 7 C et 45 C. La croissance s'étend de 15 C à 43 C. La mélanine ne se forme pas à partir de L-3,4-dihydroxyphénylalanine (L-DOPA). La souche J907-21 est tolérante au chlorure de sodium à 4% ou moins, mais non à 5% et elle est sensible au lysozyme. La souche J907-21 utilise presque tous les pentoses et les hexoses. Les caractéristiques physiologiques et l'utilisation des hydrates de carbone sont indiquées

respectivement sur les tableaux 2 et 3.

Composants amino acides de la paroi de la cellule et composants en sucre de la cellule entière La composition en amino acide de la paroi de la cellule est

examinée selon les méthodes décrites par Becker et Col. dans Appl.

Microbiol. 13, 236-243 (1965) et par Yamaguchi dans J. Bacteriol. 89, 444453 (1965) et elle est également déterminée par l'analyseur d'amino acide (modèle Hitachi 0342U). Le composant en sucre dans l'hydrolyzat de cellule entière est identifié selon les modes opératoires décrits par Lechevalier et Lechevalier dans Chemical Methods As Criteria For The Separation of Nocardiae From Other Actinomycetes. Biology of The Actinomycetes And Related Organisms 11, 78-92 (1976). La paroi de la

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cellule de la souche J907-21 contient de l'acide méso-diaminopimélique et une petite quantité de glycine. L'hydrolysat de cellule entière révèle la présence de glucose, mannose, madurose et ribose. La composition de la paroi de cellule et les composants sucre de la cellule entière mentionnée ci-dessus indiquent que la souche J907-21 appartient

au paroi de cellule du type IIIB.

Taxinomie

La souche J907-21 qui est un actinomycète mésophilique gram-

positif forme occasionnellement des mycéliums aériens courts rudimentaires mais elle manque de la capacité de former un vrai mycélium aérien, un corps formant des pores et des spores. La souche J907-21 possède une paroi de cellule du type IIIB. Les actinomycetes connus qui ont des parois de cellule du type IIIB comprennent les genres Actinomadura, Microbispora, Streptosporangium, Spirillospora, Planomonospora, Planobispora et Dermatophilus. Le mycélium végétatif du genre

Dermatophilus qui est un pathogène animal obligatoire par nature compor-

te à la fois des septums transversaux et longitudinaux. De ce fait, la souche J907-21 se différencie clairement du genre Dermatophilus. Les six genres restants se distinguent en portant sur le mycélium aérien un vésicule sporulé (sporange) ou arthrospore. Cependant, à la différence des espèces de Streptomyces, de nombreuses souches de ces six genres

sont indiquées comme étant plus ou moins auxotrophes dans la sporula-

tion. La souche J907-21 appartient donc probablement à l'un des six genres mentionnés ci-dessus. Parmi ces six genres, le genre Actinomadura a été indiqué comme étant un habitant du sol largement répandu dans le monde. Gordon dans J. Gen. Microbiol 109, 69-78 (1978) a caractérisé physiologiquement quatorze groupes de Nocardiées induisant des Actinomadura madurae. Sur la base des examens physiologiques de Gordon, on a comparé la souche J907-21 avec A. madurae (tableau 4). La souche

J907-21 est apparentée plus étroitement à l'Actinomadura madurae (simi-

larité 85,7%) aux autres groupes possédant des parois de cellule de type

IIIC et IV (similarité: 54,8% - 76,9%). Cependant, les relations physio-

logiques entre les six genres possédant des parois de cellule de type

IIIB n'ont pas été établies parce qu'elles sont distinctement différen-

tes l'une de l'autre par leur morphologie. Ainsi, la souche J907-21 ne

peut qu'être classée comme un non Streptomyces asporogénique.

TABLEAU 1

Caractéristiques culturales de la souche no J907-21 bouillon d'extrait de tryptone- G: faible; floconneux, pellets levure (ISP n 1).............. jaune pâle D: néant

agar-agar sucrose-nitrate (agar-

agar de Czapek)................ G: faible R:blanc jaunâtre (92) à brun olive clair (94) A:néant D: néant agar-agar de glucose-asparagine. G:faible R:blanc jaunâtre (92) à brun olive modéré 95) A: néant D: néant agar-agar de glycérol-asparagine (ISP n 5)..................... G:faible R:brun jaunâtre grisâtre clair (79) à brun jaunâtre grisâtre foncé (81) A:néant D:brun jaunâtre modéré (77)

agar-agar sels minéraux-

amidon (ISP no 4).............. G:faible R:brun jaunâtre grisâtre (80) A:aucun ou très peu développé; s'il se forme, rudimentaire, blanc jaunâtre (92) D:brun jaunâtre grisâtre foncé (81) agar-agar de tyrosine (ISP n 7). G:modérée R:jaune grisâtre (90) à brun jaunâtre foncé (75) A: neant D: néant

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agar-agar nutriment............. G: faible R: jaune profond (85) à brun olive foncé (96) A: néant D: néant

agar-agar extrait de levure-

extrait de malt (ISP nG 2)..... G: modérée R: jaune grisâtre foncé (91) à brun olive foncé (96) A: aucun ou très peu développé; s'il se forme, rudimentaire, brun jaunâtre grisâtre clair (79) D: brun jaunâtre foncé (78) 15. agar-agar farine d'avoine (ISP n 3)..................... G: modérée R: blanc jaunâtre (92) à jaune grisâtre (90) A: néant D: néant agar-agar de Bennett........... G: modérée R: jaune grisâtre foncé (91) à brun olive foncé (96) A: aucun ou très peu développé; s'il se forme, rudimentaireD blanc jaunâtre (92) D: jaune profond (85) agar-agar peptoneextrait de levure-fer (ISP n 6).......... G modérée R: brun olive clair (94) à brun jaunâtre profond (75) A: néant D: jaune orange brillant (67) agar-agar VDYA (Papavizas, 1964). G abondante R rouge profond vif (14) à rouge noirâtre (21) A: néant D: rouge foncé (16) agar-agar farine de blé (Riker & Riker, 1936)............... G: abondante R: brun jaunâtre profond (75) à

brun jaunâtre foncé (78)-

A: néant D: brun intense (55) agar-agar C-2 (Nonomura, 1971) G: faible R: brun jaunâtre clair (76) à brun jaunâtre profond (75) A: aucun ou très peu développé; s'il se forme, rudimentaire, blanc (262) D: néant

agar-agar pomme de terre-

carotte (Cross et coll., 1963). G: faible à modérée R: jaune grisâtre {90) à brun jaunâtre foncé (78) A: néant

D: rose jaunâtre foncé (30).

Colonie sur milieu ISP n 2: bonne croissance, extrêmement dres-

see, dure et pliée; 3 à 5 mm de diamètre, couleur de surface noire rougeâtre (24), aucune formation de mycélium aérien ou formation

rudimentaire.

* observé après incubation à 28 C pendant 3 semaines, ** abréviations: G = croissance, R = couleur inverse A = mycélium aérien, D = pigment diffusable

*** les couleurs et nombres entre parenthèse suivent les stan-

dards de couleur de "Kelly K.L. & D.B. Judd: ISCC-NBS tableau

des noms de couleur illustré par des couleurs centrolides.

U.S. Dept. of Commerce Cir. 553, Washington, D.C., November,

1975".

JJ Jv v

TABLEAU 2

Caractéristiques physiologiques de la souche n J907-21 Test Réponse Méthode ou milieu Intervalle de température croissance maximum à 28 C à Agar de Bennet

de croissance 37 C. Intervalle de crois-

sance de 150 C à 43 C. Pas de

croissance à 7 C et 45 C.

Liquéfaction de la gélatine liquéfiée 1% d'extrait de malt,

0,4% d'extrait de levu-

re, 0,4% de glucose,

% de gelatine.

Hydrolyse de l'amidon hydrolysé plaque d'agar d'amidon.

Réactions dans le lait pas de coagulation et peptoni- lait ecrémé DIFCO.

écrémé sation complète Formation du pigment négatif agar de tyrosine, agar mélanoide de fer-extrait de levure-peptone et bouillon d'extrait de levure-tryptone. Réaction à la tyrosinase négative méthode d'Arai Réduction du nitrate négative 0,5% d'extrait de levure, 1% de glucose, 0, 5% de KN03, et 0,1% de CaC03O Tolérance au pH croissance pour un pH de agar d'extrait de ,0 à 11,0. malt-extrait de levure.

Pas de croissance à pH 4,5.

Tolérance au NaCI croissance à 4% de NaCI ou milieu de base: moins. 1% d'extrait de levure, Pas de croissance à 5% de 2% d'amidon soluble, NaCl. 1,5% d'agar

Tolérance au lysozyme sensible bouillon de soja trypti-

Pas de croissance à 0,001%4 case plus 1,5% d'agar.

de lysozyme.

* Arai, T. et Y. Mikamil Chromogénicité du Streptomyces.

Appl. Microbiol. 23, 402-406, 1972.

2S558 6

TABLEAU 3

UTILISATION DES HYDRATES DE CARBONE DE LA SOUCHE J907-21

GLYCEROL +

D-(-)-ARABINOSE +

L-(+)- ARABINOSE +

D-XYLOSE +

D-RIBOSE +

L-RHAMNOSE +

D-GLUCOSE +

D-GALACTOSE +

D-FRUCTOSE +

D-MANNOSE +

L-(-)-SORBOSE

SUCROSE

LACTOSE

CELLOBIOSE +

MELIBIOSE

TREHALOSE +

RAFFINOSE

D-(+)-MELEZITOSE

AMIDON SOLUBLE +

CELLULOSE

DULCITOL

INOSITOL +

D-MANNITOL +

D-SORBITOL

SALICIN

Observé après incubation à 37 C durant 3 semaines; milieu de base: milieu minéral Pridham-Gottlieb Abréviations: (+) = utilisation positive (-) = utilisation négative

TABLEAU 4

Comparaison des propriétés physiologiques de diagnostic entre la souche J907-21 et l'Actinomadura madurae Souche J907-21 Actinomadura

*

madurae (47) Décomposition de: Adénine................... + Caséine.......

.......... + + Hypoxanthine.............. + + Tyrosine.................. + +..DTD: Urée...................... -

Xanthine.................. Souche J907-21 Actinomadura madurae (47) i5 Résistance à: Lysozyme. Rifampin..............+ v Hydrolyse de: Aesculin..

............. + + Hippurate................ + Amidon.................... + + Acide à partir de: Arabinose.................+ + Cellobiose............DTD: ....+ + Glucose................... + + Glycérol.................. + Inositol.................. + v Lactose................... - v Mannitol......DTD: ............ + + Mannose................... + +..DTD: Mélézitose............... -

Mélibiose......-

Raffinose................. -

Rhamnose.................. + +

Sorbitol..................

Tréhalose.................+ + Xylose.................... + + Utilisation de: Benzoate.................. Citrate.................. v

Mucate.................... -

Succinate................. + v

Tartarte.................. -

Nitrite à partir de nitrate..... + Survie à 50 C, 8 heures......... + +: positif, -: négatif, v: 15 à 84% de souches positives

*: données de Gordon et coll.

**: nombre de souches examiné.

Comme dans le cas des autres organismes, les caractéristiques de la souche J907-21 sont sujettes à variation. Par exemple, des variantes et mutants artificiels de la souche J907-21 peuvent être obtenus par

traitement avec divers mutagènes connus tels que les rayons ultravio-

lets, rayons X, ondes à haute fréquence, rayons radio-actifs et produits chimiques. Toutes les variantes et mutants naturels et artificiels (ciaprès dénonmés mutants) de la souche J907-21 qui produisent les antibiotiques BBM-2478 doivent être compris dans le cadre de la présente invention. Production d'antibiotiques Les antibiotiques BBM-2478 selon la présente invention sont produits par culture de la souche 3907-21 (ATCC 39417) ou d'un mutant

produisant le BBM-2478 de celui-ci dans des conditions aérobies submer-

gées dans un milieu nutritif aqueux. L'organisme producteur est cultivé dans un milieu nutritif contenant une source de carbone assimilable, par exemple un hydrate de carbone assimilable. Des sources de carbone convenables comprennent par exemple: glycérol, arabinose, xylose, flucose, fructose, mannose, amidon soluble, mannitol et cellobiose. Le milieu nutritif doit également contenir une source d'azote assimilable telle que: farine de poisson, farine de soja, liqueur de décoction de blé, peptones, extrait de viande, farine d'arachide, extrait de levure ou sels d'ammonium. Des sels minéraux tels que chlorure de sodium, chlorure de potassium, sulfate de magnésium, carbonate de calcium, phosphate, etc. sont ajoutés si nécessaire. Des éléments sous forme de trace tels que cuivre, manganèse, fer, zinc, etc. sont ajoutés au milieu si on le souhaite ou ils peuvent être apportés sous la forme d'impuretés des autres constituants des milieux. La température d'incubation peut être une température quelconque à laquelle la souche productrice est capable de croître, par exemple de 15 à 43 C, mais il est préférable de conduire la fermentation à 25-35 C, notamment 27 à 32 C. Un pH neutre ou voisin de la neutralité est employé de préférence dans le milieu et la production d'antibiotique est généralement mise en oeuvre pendant une période d'environ 6 à 10 jours. Ordinairement, l'optimum de production est obtenu en 6 à 7 jours. Pour la préparation de quantités relativement

faibles, on peut employer des flacons secoués et des cultures de sur-

face, mais pour la préparation de quantités plus importantes, on préfère la culture aérobie submergée dans des réservoirs stériles. Lorsque l'on doit mettre en oeuvre la fermentation en réservoir, il est souhaitable

de produire un inoculum végétatif dans un bouillon nutritif par inocula-

tion du bouillon de culture avec une spore de l'organisme et, lorsque l'on a obtenu un inoculum végétatif actif jeune, on transfert l'inoculum

de façon aseptique dans le milieu du réservoir de fermentation. L'aéra-

tion dans les réservoirs et bouteilles peut être produite en introdui-

sant de façon forcée de l'air stérile à travers ou à la surface des milieu de fermentation. Une agitation supplémentaire peut être procurée par un agitateur mécanique. Des agents anti-mousse tels que de l'huile

de lard peuvent également être ajoutés si nécessaire.

La production de BBM-2478 dans le milieu de fermentation peut être facilement suivie au cours de la fermentation par l'essai de diffusion sur disque de papier agar-agar en utilisant le Micrococcus luteus

PCI 1001 comme organisme de test.

Isolement des antibiotiques BBM-2478 Après que l'on ait obtenu la puissance optimum du bouillon, le

mycélium et les résidus non dissous sont séparés du bouillon de fermen-

tation par des moyens classiques tels que filtration ou centrifugation.

L'antibiotique du gâteau mycélien peut être récupéré en extrayant le gâteau mycélien au méthanol, en éliminant par filtration les matières insolubles et en concentrant l'extrait méthanolique vers une solution aqueuse. L'activité dans le bouillon qui surnage peut être récupérée par extraction avec du n-butanol et concentration de l'extrait au butanol vers une solution aqueuse. Les extraits de méthanol et de butanol aqueux contenant les antibiotiques BBM-2478A et B peuvent alors être soumis à des opérations de purification chromatographique classique de façon à procurer les BBM-2478A et B purifiés. Un mode opératoire de purification

que l'on préfère est décrit dans l'exemple 2 qui suivra.

Oú oc

'Z N

8b'b H SS'S H

91'ú9 3 10'69 3

OIOzzH9Z3 O0H'ElIQNS úHg3. ........ inod aaLnDLeD

'Z N SZ

tS't H 0t'S H LO'g 69 8'6S3 aaAnoJ. aS LeuV (06Z) ZZb (SZZ) ZZb (SSZ) 86Z (soz) 86c (691) 8Lú (UtZ) 8Lú oz (811t) úúú (00oo1) úú

(00L) 99Z (OSS) 99Z

(ObL) 98Z (06S) 9Z........ (m3) wu Hxew An-

%L HOaWAf 308 - 3oZ[ + *-- (auLpLúd ' '0 D) 9z(3) ('3ap) 3oZZZ - ILZ 3o9gZ - SZZ............ uoLsnj ap jutod - Sl (,D'-P> 30ZtZ - la 309zz - 9suosJ.z wo

aqdJowe auner aipnod aqdaowe auner aapnod................... aneN -

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FS 20S

auLsnazle43 eL ap ha 9 la V 8LbZ-W88 sap 311 S fV312VI tSS 92sssi Propriétés physico-chimiques des antibiotiques BBM-2478

Les BBM-2478 A et B sont obtenus sous la forme de solides cristal-

lins orange-jaunâtre. Les deux composants des BBM-2478 se distinguent de la chartreusine par chromatographie en couche mince (TLC) telle que l'indique le Tableau 5. Le BBM-2478A est facilement soluble dans le diméthylsulfoxyde, le diméthylformamide, le dioxane et l'eau acidulée, légèrement soluble dans le méthanol, l'éthanol et le chloroforme et insoluble dans les autres-solvants organiques. La solubilité du BBM-2478B est semblable à celle du BBM-2478A sauf que le BBM-2478B est insoluble dans l'eau acidulée. Les BBM-2478 A et B donnent des réponses

positives avec les réactifs à base de chlorure ferrique et d'anthrone.

Le BBM-2478A donne une réaction positive à la minhydrine tandis que le BBM-2478B est négatif dans le même test. Les réactions de Tollen et de

Sakaguchi sont négatives avec les deux composants. Les propriétés -

physico-chimiques des BBM-2478A et B sont résumées sur le tableau 6. Les spectres UV des deux composants sont semblables, montrant des maxima à 236, 266, 298 et 422 nm dans les solutions neutres et acides et à 240, 268 et 435 nm dans une solution alcaline. Ces spectres sont étroitement apparentés à celui de la chartreusine. Les spectres IR des BBM-2478A et O B sont illustrés respectivement sur les figures 1 et 2. Les spectres de proton (PMR) et de 13C-NMR (CMR) du BBM-2478A sont représentés sur les

figures 3 et 4.

Etudes structurales sur les antibiotiques BBM-2478 Le spectre CMR du BBM2478A démontre la présence de 33 carbones y compris quatre C-CH2, un OCH3, neuf CH-, un C 3 cinq groupes -CH=

et treize groupes C=.

Ces données spectrales CMR combinées avec les données micro-analytiques du BBM-2478A permettent de déduire une formule moléculaire de C33H35N013 pour l'antibiotique. Le BBM-2478A est hydrolysé avec HC1 méthanolique 0, 4N a reflux pendant i heure. Les cristaux jaunes qui se précipitent sont recueillis par filtration et le filtrat est concentré sous vide, ce qui donne un sirop contenant des fragments de sucre positifs à la

ninhydrine, Le matériau cristallin est identifié comme étant la charta-

rine, l'aglycone de la chartreusine, par comparaison de son analyse

spectrale avec celle d'un échantillon authentique.

H3

I

Chartarine

H

HO HOH

Le fragment de sucre contenu dans le concentré aqueux est le

mélange anomère d'un disaccharide {composé I) qui est séparé par chroma-

tographie sur Amberlite CG-50 (forme NH4+) pour donner des a et s méthylglycosides (Ia et Ib) en quantité approximativement égale. Les

formules moléculaires des composés Ia et Ib sont toutes les deux éta-

blies comme étant C15H29NO8 sur la base de la masse (M++I:m/z 352) et des spectres CMR. Les propriétés physico-chimiques de Ia et Ib sont résumées sur le tableau 7. Les composés Ia et Ib résistent ensuite à l'hydrolyseacide et ils subissent une décomposition importante des fragments de sucre qui en résultent dans des conditions acides assez

sévères pour couper la liaison glycoside.

Un mélange de composé Ia et Ib (370 mg) est acetylé dans le méthanol pour donner un dérivé mono-N-acétylé (460 mg, M++1: m/z 394) qui est hydrolysé dans HCl méthanolique 4,5N. Le produit est passé en

chromatographie sur une colonne de gel de silice avec la phase infé-

rieure de CHCl3-MeOH-c.NH40H (6/1/1) pour donner des a- et $-anomères d'un sucre N-acétyl aminé (composé N-Ac-IIa, 140 mg et N-Ac-IIb, 22 mg)

et d'un sucre neutre (composé IlIa, 85 mg et IIIb, 79 mg). Par traite-

ment avec une solution de Ba(OH)2 saturée, le N-Ac-IIa est transformé de façon quantitative en sa forme aminée libre (composé IIa). Les données

physico-chimiques de IIa, IIIa et IIIb sont indiquées sur le tableau 8.

Le IIa est déterminé comme étant le méthyl-2-amino-2,6-didéoxy-3-O-

méthyl-a-D-galactopyranoside à partir de l'analyse de son spectre NMR.

S5 58 6

Comme indiqué sur le tableau 8, le spectre NMR de IIa comprend 5 protons

dans le cycle en même temps que deux signaux OCH3 et un signal C-CH3.

L'analyse du premier ordre des protons du cycle indique des constantes de couplage 1_2 3,8, I2_3 = 10,5, 13_4 = 3,0, I4_5 <1,0 et I5_6 = 6,4 Hz, qui sont compatibles avec la structure assignée. En outre, les données physico-chimiques du N,O-diacétyl-IIa {point de fusion 163-164 C

et (a)23:+154 (c 0,3, CHCl3)} à celles indiquées pour le méthyl-2-

acétamido-4-O-acétyl-2,6-didéoxy-3-0-méthyl-a-D-galactopyranoside par

M.B. Perry dans Can. J. Chem. 52, 3251-3255, (1974).

CH31 IIa: R = OCH3, 2 = H ( 3 o \ IIb: = H, = OCEI3

NH2 2

R1 Le spectre PMR de IlIa indique des constantes de couplage de 11i2 = 4, 5, I4_5 < 1,0 et I5_6 = 6,7 Hz, tandis que celui du IIIb indique des constantes de couplage 11i2 = 7,8, I45 <1,0 et 156 = 6,5 Hz. L'absence d'un proton de cycle sur C3 est évidente dans les deux spectres. L'analyse spectrale indique que le IIIa et le IIIb sont

respectivement l'a- et le o-méthylglycoside du 6-déoxy-3-C-méthylgulo-

pyranoside (méthylvirénoside) ou du 6-déoxy-3-C-méthylgalactopyranoside.

On montre que l'échantillon authentique de méthyl-8-D-virénoside est différent de IIIb par TLC et par le spectre NMR: les signaux H1 et H5 du méthylvirénoside sont observés dans un champ considérablement plus faible que ceux du IIIb, ce qui indique que le C3-OH du méthylvirénoside est dans une orientation axiale tandis que celui du IIIb est dans une orientation équatoriale. La configuration-D est assignée à III sur la base des valeurs rotatoires optiques de IIIa et IIIb et A(M)CuAm observé pour le IIIa (-1309 ). Ainsi, on détermine que le IIIa et le IIIb sont

* respectivement le 6-déoxy-3-C-méthyl-a et le e-D-galactopyranoside.

UH CH3 IIIa: R1 = OCH3, R2 = H H O -IIIb: = H, = OCH3 H 3

H3 OH R2

R1 La liaison des deux sucres est établie par les spectres de masse de laet de Ib et de leurs acétates qui présentent des fragments ions que l'on peut attribuer à une séquence II + III du disaccharide. Le spectre PMR à 200 MHz et l'expérience de découplage mise en oeuvre pour le N,0triacétyl-Ia révèlent que le sucre II est lié au C2-OH de III par une liaison c-glycosidique et dont on détermine que les structures de la et Ib sont celles indiquées ci-dessous: HO HO

I: = CH, = CH3

Les spectres UV du BBM-2478A mesurés à divers pH sont trs sembla-

bles ceux de la chartreusine. Ceci suggre que le radical disaccharide du BBM-2478A est lié à la chartarine au même groupe hydroxyle que dans la chartreusine. Les spectres IR du BBM-2478A et de la chartreusine dans HO la: R = OC 2= H lb: H, OCH 3

Les spectres UiV du BBM-2478A mesurés à divers pH sont très sembla-

bles à ceux de la chartreusine. Ceci suggère que le radical disaccharide du BBM-2478A est lié à la chartarine au même groupe hydroxyle que dans la chartreusine. Les spectres IR du BBM-2478A et de la chartreusine dans le chloroforme montrent le même schéma d'absorption du carbonyl, ce qui

supporte l'hypothèse ci-dessus. Dans le spectre NMR du N-acétyl-

BBM-2478A, le proton anomère de III donne lieu à un doublet avec un espacement de I = 8,0 Hz, ce qui permet à la demanderesse d'assigner une

conformation e-pyranoside de III à l'antibiotique.

2U555B6

La formule moléculaire C26H22010 est assignée au BBM-2478B sur la base de la micro-analyse. Par méthanolyse acide modérée, le BBM-2478B donne la chartarine et des sucres neutres (IIIa et IIIb) identiques ainsi obtenus à partir du BBM-2478A. Le BBM-2478B est donc apparemment l'analogue du BBM-2478A mais il ne possède pas de radical sucre aminé (II). Ainsi, les structures des BBM-2478 A et B s'établissent comme indiquées ci-dessous: I3C v HO *o 3CH c3 OH He

H 0 0H N

CE O

: o BB427

H / ' o.

3. 'X,

2555 5 8 6

TABLEAU 7

Propriétés physico-chimiques des composés Ia et lb 5.................. Composé IaComposé Ib Nature........................ poudre blanche poudre blanche Point de fusion............... 79 - 82 C 80 - 83 C * (O)D (c 1,0, H20).............+211 +1160 TLC n-BuOH-AcOH-H20 (63/10/27)................

.. Rf 0,19 0,15 Formule moléculaire...........C15H29N8 C15H29N08 Spectre de masse (m/z)........ 352 (M +1) 352 (M +1)..DTD: 319 319

235 235

160 160

PMR (60 MHz dans D20) ô en ppm. 1,25 (3H, d) 1,23 (3H, d) 1,28 (3H, d) 1, 26 (3H, d) 1,37 (3H, s) 1,29 (3H, s) 3,03 (1H, d-d) 3,07 (1H, d-d) 3,41 (3H, s) 3,44 (3H, s) 3,46 (3H, s) 3,54 (3H, s) 3,6-4,5 (6H, m) 3,4-4,4 (6H, m) 4,90 (1H, d, 4,50 (1H, d, I=4,3 Hz) I=8,0 Hz) 4,98 (1H, d, 5,09 (1H, d, I=3,5 Hz) I=3,5 Hz) 2r55586

TABLEAU 8

Propriétés physico-chimiques des composes IIa, IIIa et IIIb IIa IIIa IIIb nature.............. sirop jaune pâle sirop jaune pâle sirop jaune pàle () D................. +106(c 0,2,MeOH) +152 (c 0,5,CHC1I) -33 (c 0,5, CHCl 3) TLC: Rf CHC1 -MeOIl-NH 01 (2/lh1/) phase inférieure 0,67 0,35 0,32 nBuOHI-AcOH-H20

(63/10/27)...........0,20 0,47 0,40

Formule moléculaire.. C8 H17NO C 8H16 05 C S PMR, 60 Mlz dans D20 1,26 (d, 3H,6,4) 1,27 (d,3H,6,7) 1,27 (s,3H) en ppm 2,97 (d-d,lH,3,8 1,34 (s,3H) 1, 28 (d,2H,6,5)

& 10,5)

3,41 (s,3H) 3,38 (s,3H) 3,45 (br-s, 1H) 3,43 (s,3H) 3,48 (br-s,lH) 3,52 (d,lH,7,8) 3,45 (d-d,lH,3,0 3,83 (d,lH,4,5) 3,60 (s,3H)

& 10,5)

4,00 (q,1H,6,4) 4,18 (q,lH,6,7) 4,00 (q,lH,6,5) 4,02 (br-d,1H,3,0) 4,75 (d,lH,4,5) 4,39 (d,IH,7,8) 4,72 (d,lH,3,8)

* (multiplicité, proton, I en Hz).

2r55586 Propriétés biologiques

La concentration inhibitrice minimum (MIC) du BBM-2478'est détermi-

née par comparaison avec la chartreusine vis-à-vis de diverses bactéries gram-positives et gram-nétatives et champignons aussi bien que de quelques organismes anaérobies par la méthode de la double dilution en série de l'agar-agar. Le milieu agar-agar nutritif est utilisé pour des bactéries gram-positives et gram-négatives, le milieu agar-agar GAM pour

les anaérobies et le milieu agar-agar de Sabouraud pour les champignons.

Comme indiqué sur le tableau 9, les BBM-2478 A et B et la chartreusine

présentent des spectres antibactériens similaires vis-à-vis des bacté-

ries gram-positives et des anaérobies tandis qu'ils sont inactifs vis-àvis des bactéries gram-négatives et des champignons. L'activité antistaphylocoque du BBM-2478A est de deux a quatre fois plus élevée que

celle du BBM-2478B ou de la chartreusine.

TABLEAU 9

Activité antibactérienne des BBM-2478 A et B MIC (mcg/ml) Organisme test BBM-2478A BBM-2478B Chartreusine Staphylococcus aureus 209P... 1,6 3,1 3, 1 Staphylococcus aureus Smith.. 0,8 6,3 6,3 Bacillus subtilis PCI 219.... 0,8 0,8 0,4 Micrococcus luteus PCI 1001.. 0,8 3,1 0,8 Micrococcus flavus D12....... 0,8 1,6 0,4 Escherichia coli NIHJ........ 100 >100 >100 Klebsiella pneumoniae Dll.... 100 >100 >100 Pseudomonas aeruginosa D15... 100 >100 >100 Candida albicans IAM 4888.... >100 >100 >100 Cryptococcus neoformans D49.. >100 >100 >100 Aspergillus fumigatus IAM 2530 >100 >100 > 100 Trichophyton mentagrophytes D155 >100 >100 >100 Bacteroides fragilis..

..... 12,5 6,3 Clostridium difficile........ 12,5 25 Clostridium perfringens...... 6,3 1,6 Propionibacterium acnes...... 6,3 3,1..DTD: 2 55586

L'activité antitumeur du BBM-2478A est déterminée chez les souris par comparaison avec celle de la chartreusine vis-à-vis de la leucémie

lymphocytique P-388, la leucémie lymphoTde L-1210 et le mélanome mélano-

tique B-16. Les tumeurs sont implantées par voie intrapéritonéale dans des souris BDF1 avec des quantités d'inoculum de 104, 105 et 106 cellules par souris respectivement. Les composés à tester sont dissous dans une solution saline a 0,9% contenant 10% de diméthylsulfoxyde et des doses progressives de l'antibiotique sont administrées par voie

intrapéritonéale 24 heures après implantation de la tumeur. Les trai-

tements sont administrés une fois par jour pendant 9 jours (qd 1 + 9).

Les résultats sont indiqués sur les tableaux 10, 11 et 12. Le BBM-2478A est approximativement dix a trente fois plus actif que la chartreusine

en terme de dose efficace minimum et il obtient des valeurs TIC supé-

rieures à celles de la chartreusine vis-a-vis de toutes les tumeurs

testées. On trouve que le BBM-2478B est dépourvu d'activité antitumeur.

La toxicité aiguë du BBM-2478A est déterminée chez les souris (souche ddY) par une seule administration intrapéritonêale, la LD50 étant de

38 mg/kg.

Comme indiqué ci-dessus, les BBM-2478A et B possèdent une activité antibactérienne puissante contre les bactéries gram-positives et les bactéries anaérobies et elles sont donc utiles dans le traitement

thérapeutique des mammifères et autres animaux pour les maladies infec-

tieuses causées par ces bactéries. En outre, ces composés peuvent être

utilisés pour d'autres applications classiques des agents antibacté-

riens, par exemple la désinfection de l'équipement médical et dentaire.

L'activité antitumeur significative manifestée par le BBM-2478A vis-à-vis des systèmes de tumeur expérimentaux de la souris indique que le BBM2478A est également utile thérapeutiquement dans l'inhibition de

la croissance des tumeurs des mammifères.

La présente invention procure donc une méthode de traitement thérapeutique d'un hôte animal affecté par uneinfection bactérienne consistant à administrer à cet hôte une dose antibactérienne efficace de BBM-2478A ou de BBM-2478B ou une composition pharmaceutique à base de

ceux-ci. En outre, la présente invention procure une méthode de traite-

ment thérapeutique d'un hôte mammifère affecté par une tumeur maligne qui consiste à administrer à cet hôte une dose inhibitrice de la tumeur

de BBM-2478A, ou une composition pharmaceutique de celui-ci.

2r55586

TABLEAU 10

Effet du BBM-2478 sur la leucémie P-388 Changement de Dose, ip MST T/C poids moyen au Survivants au (Mg/kg/jour*) jours (%) jour n 5 (g) jour n' 5 jour n' 45 BBM-2478A 3 20,0 a -1,0 5/5 0/5

1 21,5 & +0,8 6/6 0/6

0,3 17,0 Q8 +1,8 6/6 0/6

0,1 14,5 l( +1,2 6/6 0/6

0,03 10,0 111 +2,3 6/6 0/6

0,01 10,0 111 +2,0 6/6 0/6

Chartreusine 10 19,5 +1,3 6/6 0/6

3 15,0 1 +1,5 6/6 0/6

1 14,0 Q +1,3 6/6 0/6

0,3 10,5 1.17 +20 6/6 0/6

0,1 9,0 100 +2,8 6/6 0/6

Véhicule - 9,0 - +2,4 12/12 0/12 *qd 1 9

** le cercle indique un effet antitumeur significatif.

TABLEAU 11

Effet du BBM-2478 sur la leucémie P-1210 Changement de Dose, ip MST T/C poids moyen au Survivants au

(mg/kg/ju* jus % jo ns5jour*)our n 5 jour n 45 -

BBM-2478A 3 12,0 0* -0,1 6/6 0/6

1 11,0 3 +0,8 6/6 0/6

0,3 310,5 +1,3 6/6 0/6

0,1 8,0 100 +2,6 6/6 0/6

0,03 8,0 100 +2,9 6/6 0/6

0,01 8,0 100 +3,2 6/6 0/6

Chartreusine 10 11,5 +1,3 6/6 0/6

3 9,0 113 +1,4 6/6 0/6

31 9,0 113 +1,9 6/6 0/6

0,3 8,0 1300 +3,2 6/6 0/6

0,1 8,0 100 +3,2 6/6 0/6

Véhicule - 8,0 - +2,8 12/12 0/12 *qd 1 9

** le cercle indique un effet antitumeur significatif.

2'55586

TABLEAU 12

Effet du BBM-2478 sur le mélanome B-16 Changement de Dose, ip MST T/C poids moyen au Survivants au (mg/kg/jour*) jours (%) jour n 5 (g) jour n 5 jour n 45

BBM-2478A 3 41,5 * -1,5 6/6 0/6

1 34,5 +2,2 6/6 0/6

0,3 25,5 +2,5 6/6 0/6

0,1 18,5 +2,5 6/6 0/6

0,03 16,0 114 +2,0 6/6 0/6

Chartreusine 10 25,0 +1,7 6/6 016

143 20,5 +2,3 6/6 0/6

1 16,0 114 +2,3 6/6 1/6

0,3 14,0 100 +1,8 6/6 0/6

Véhicule - 8,0 - +2,3 10/10 0/10 *qd 1 9

** le cercle indique un effet antitumeur significatif.

2Z55586

Selon un autre aspect, la présente invention procure une composi-

tion pharmaceutique comprenant une quantité antibactérienne efficace de BBM-2478A ou de BBM-2478B en combinaison avec un véhicule ou diluant inerte pharmaceutiquement acceptable. En outre, la présente invention procure une composition pharmaceutique qui contient une quantité inhibitrice de tumeur efficace de BBM-2478A en combinaison avec un véhicule ou diluant inerte pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent

être transformées en toute forme pharmaceutique appropriée à l'adminis-

tration parentérale.

Des préparations selon l'invention pour administration parentérale

comprennent des solutions aqueuses ou non aqueuses stériles, des suspen-

sions ou émulsions. Elles peuvent aussi être manufacturées sous la forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes dans l'eau stérile, une solution saline physiologique ou quelque autre milieu

injectable stérile immédiatement avant usage.

On appréciera que les quantités préférées des antibiotiques de

BBM-2478 effectivement utilisés varient en fonction du composant particu-

lier, de la composition particulière formulée, du mode d'application, du site, de l'hôte particulier et de la maladie à traiter. De nombreux facteurs qui modifient l'action de la composition seront pris en compte par l'homme de l'art, par exemple âge, poids du corps, sexe, régime, moment de l'administration, voie d'administration, taux d'excrétion, état de l'hôte, combinaison de médicament, sensibilité réactionnelle et sévérité de la maladie. L'administration peut être effectuée en continu ou périodiquement dans la limite de la dose maximum tolérée. Des taux d'application maximum pour un ensemble donné de conditions peuvent être établis par l'homme de l'art en utilisant des tests de détermination de

dose classique en suivant les directives ci-dessus.

Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif seulement et

ils n'entendent pas limiter la portée de l'invention. Toutes les tempé-

ratures sont indiquées en degré Celsius à moins que cela ne soit spéci-

fié autrement. L'Amberlite CG-50 est une marque de fabrique de Rohmni &

Haas Co., Philadelphia, Pa., U.S.A., pour une résine échangeuse catio-

nique faiblement acide du type acide carboxylique. Le Diaion HP-20 est une marque de fabrique de Mitsubishi Chemical Industries, Japon, pour

une résine polymère macroréticulaire non ionique.

2r55586

EXEMPLE 1

Fermentation des BBM-2478 A et B Une culture en biais bien développée d'une souche d'actinomycète n J907-21 est utilisée pour inoculer un milieu végétatif constitué de 3% d'amidon soluble, 1% de Bacto-liver (Difco), 0,5% de farine de poisson, 0,3% de NaCl, 0,1% de (NH4)2SO4 et 0, 6% de CaCO3, le pH étant ajusté à 7,0 avant stérilisation. Le milieu végétatif est incubé à 28 C pendant 72 heures sur un secoueur rotatif (250 tr/mn) et 5 ml de la culture sont transférés dans un Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml d'un milieu de fermentation ayant la même composition que le milieu végétatif. La fermentation est effectuée sur le secoueur rotatif à 28 C pendant 7 à 10 jours. L'activité antibiotique dans le bouillon de fermentation est déterminée par la méthode de diffusion sur disque de papier-agar-agar en utilisant le Micrococcus luteus PCI 1001 comme organisme de test. La productivité antibiotique atteint une puissance

maximum de 150 mcg/ml après 6 à 7 jours de fermentation.

EXEMPLE 2

Isolement et purification des BBM-2478 A et B Un bouillon récolté (20 1, pH 6,8) préparé conmme dans l'exemple 1 est séparé en gâteau de mycélium et en surnageant en utilisant une centrifugeuse de type Sharpless (Kokusan n 4A). Le gâteau de mycélium

est extrait trois fois avec chaque fois 5 1 de méthanol. Apres élimi-

nation des insolubles par filtration, les extraits méthanoliques sont

combinés et concentrés sous vide pour l'obtention d'une solution aqueu-

se. Ce qui surnage du bouillon de fermentation est extrait avec du nbutanol (20 l) et l'extrait est évaporé sous vide pour l'obtention d'une solution aqueuse. Les deux concentrats aqueux sont réunis et passés sur une colonne de Diaion HP-20 (Mitsubishi Chem. Industries, Tokyo, 0 5,5 x 60 cm) que l'on développe successivement avec de l'eau

(5 1), du méthanol aqueux à 50%-(5 1) et du méthanol aqueux à 80% (6 1).

Les fractions contenant du BBM-2478 sont contrôlées par un essai au disque de papier en utilisant le B. subtilis M45 (Rec-) comme organisme test. Les fractions actives éluées avec du méthanol aqueux à 80% sont rassemblées, évaporées sous pression réduite et lyophilisées, ce qui donne 4,5 g de solide jaune de complexe de BBM-2478 brut. Le complexe brut est passé sur une colonne de gel de silice (0 3,5 x 55 cm) qui est prélavée avec du chloroforme et l'activité est éluée par un mélange

chloroforme-méthanol avec un accroissement par palier de la concentra-

tion en méthanol (5 à 10% v/v). Les premières fractions actives éluées

par du méthanol à 5% sont recueillies, concentrées sous vide et lyophili-

sées, ce qui donne le BBM-2478B (72 mg). Les secondes fractions actives éluées par du méthanol à 10% sont élaborées de façon semblable, ce qui donne du BBM-2478A solide semi-pur (2,51 g). Ce dernier solide est encore passé en chromatographie sur gel de silice en utilisant un chromatogramme liquide de pression moyenne (colonne Kiriyama 0 11 x 500 mm; pompe: pompe FMI Lab, pression 5,6 à 6,3 bars). L'élution avec un mélange chloroforme/méthanol (97/3, v/v) donne des fractions actives qui, par concentration sous vide, donnent du BBM-2478A sous forme de solide homogène (1,30 g). Ce solide est cristallisé dans le méthanol, ce

qui donne des batonnets orange jaunâtre de monohydrate de BBM-2478A.

Claims (4)

REVENDICATIONS

1.- L'antibiotique BBM-2478A ayant la formule: 3C HO

-0 H3 C

HO OO

--OCH OH HO o os

CH3 O 3

BBM-2478A de celui-ci dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote dans des conditions aérobies submergées jusqu'à ce qu'une quantité substantielle de BBM-2418A soit produite par cet organisme dans ce milieu de culture et ensuite

récupérer l e BBM-2478A p partir du milieu de culture.

2r5558 6 4.- Procédé de préparation de l'antibiotique BBM-2478B consistant à cultiver la souche J907-21 (ATCC 39417) ou un mutant producteur de BBM-2478B de celui-ci dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote dans des conditions aérobies submergées jusqu'à ce qu'une quantité substantielle de BBM-2478B soit produite par cet organisme dans ce milieu de culture et ensuite à

récupérer le BBM-2478B à partir du milieu de culture.

5.- Composition pharmaceutique comprenant une quantité antibac-

térienne efficace de BBM-2478A en combinaison avec un véhicule ou

diluant pharmaceutique.

6.- Composition pharmaceutique comprenant une quantité antibac-

térienne efficace de BBM-2478B en combinaison avec un vehicule ou

diluant pharmaceutique.

7.- Composition pharmaceutique comprenant une quantité inhibitrice de tumeur efficace de BBM-2478B en combinaison avec un véhicule ou

diluant pharmaceutique.