SE460481B - Antibiotiska antitumoerkomplex bbm-2478a och bbm-2478b samt foerfarande foer deras framstaellning - Google Patents

Description

481 D-dígitalos .S och framställes genom fermentering av Streptomyces char- ef» treusis, Streptomyces Sp. No. 747 (S. viridis). Strepto- myces Sp. 6336 (S. viridochromogenes) och av två aktino- mycetestammar betecknade Streptonyces Sp. X-3988 och S-465.

Chartreusin är uppenbarligen densamma som antibiotikumet 747 och antibiotikumet X-465A.

Enligt föreliggande uppfinning tillhandahålles ett nytt an~ tibiotiskt komplex med beteckningen BBH-2478, vilket fram- ställes genom att man odlar en aktinomycetestam ed beteck- ningen J907-21l(ATCC 39417) eller en BBH-2478-producerande mutant därav med väsentligen samma egenskaper i ett vatten- haltigt nârmedium innehållande asslmilerbara källor av kol l'och kväve under subæersa aeroba betingelser till dess en §»šasentligfnängd BBH-2478-komplex har bildats av denna orga- ,pnisn i nämnda odlingsmedium och att man därefter utvinner '¿Å,»fggn-fzgfja-àónplexe: fran aalingsmeaiuman. nßu-z-fla-kampnzxeu “dinnebåller,tvålbioaktiva antibiotikumkomponenter med beteck- ningfpairlifia ann-musa øch ßBu-zlrraa, vnxa kan sepazeras needs: onjentionella kromatogrnfiska föršaranden och isoleras i f “åffëfišlaiéflfl l=°1= fw»- rå¥%@S 460 481 BBM-2478A och B uppvisar antibakteriell aktivitet mot ae- roba grampositiva bakterier och anaeroba bakterier. BBM- -2478Å inhiberar även tillväxten av maligna tumörer vid djurförsök. V På bifogade ritningar visar.

FIG, 1 infrarödabsorptionsspektrumet för BBM-2478A; gFIG. 2 infrarödabsorptionsspektrumet för BBM-24788; FIG. S protonnagnetresonansspektrumet (80 H82) för VBBM-2478A 1 CD30D; 4 13C-kärnmagnetresonansspektrumet (20 MHz) för FIG.

“ Ban-zman i aG-nuso .

Föreliggande uppfinning avser nya glykosidantibiotika, som i föreliggande sammanhang betecknas BBM-2478A och EBM-24788, och deras framställning genom fermentering av en aktinomy- cetestam med beteckningen J9G7-21§ Den producerande orga- I nismen har isolerats från ett jordprov tillvarataget i Bl Salvador och har för närvarande klassificerats endast som en icke-Streptomyces ahtinomycetestam. En biologiskt ren kultur av denna organism har framställts medelst konventionella för- faranden och deponerats hos the American Type Culture Coll- ection, Hashington, D.C., USA under depositionsnumret ATCC 39417.

Taxonomi hos den producerande kulturen Stammen J907-21 bildar ett vâlförgrenat, icke-fragmenterande » vegetativt mycelium men saknar förmåga att uppbära ett verk- ligt luftmycelium. Stamen är asporogen enligt hittills ut- ggglförda undersökningar. Eftersom den innehåller meso-diamino- Wvlfpimelinsyra i cellväggen och maduros i helcellhydrolysatet hfi har staseen J907-21 placerats i den cellväggsklass som be- 1113; stamen Jsqv-zj 'uppbär icke nägra morfolo- ggisht§v§sent1iga1hroppar_såsom sporkedja och sporangium. Stam- få 460 481 i35i _fklorid_vid 4% eller därunder men icke vid 5% och är känslig å _ för lysozym. Stamen J907-21 utnyttjar praktiskt taget alla nï men J907-21 kan således för närvarande endast klassificeras som en icke-Streptomyces aktinomycetestam.

Morfologi Stammen JSO7-21 bildar ett långt, välförgrenat vegetativt mycelium (med bredden 0,4 stavar eller kockoidceller. Rudimentärt kort luftmycelium bildas tillfälligtvis på vissa agarmedier men ett verkligt luftmycelium bildas icke på alla deskriptiva medier. Spor- rm), som icke fragmenteras till 2 bildande kroppar och sporer har icke kunnat observeras vid de hittills utförda undersökningarna.

Odlingsegenskaper É Såsom visas i tabell 1 nedan växer stammen måttligt på na- turliga organiska medier men dåligt på de flesta kemiskt definierade medierna. Ehuru stammen J907-21 icke bildar ett verkligt luftmycelium bildas partiellt rudimentärt kort luftmycelium på medierna ISP nr. 2 och 4 och Bennetts agar.V Det rudimentära luftmyceliet bildas även på mediumet ISP nr. 7 kompletterat med kovalamin eller vitaminkomplex. Från- sidefärgen hos det vegetativa myceliet är blekgult till oli- ka nyanser av brunt på de flesta agarmedier. Ett mörkrött myceliumpigment bildas på medium ISP nr. 2 och VDYA (V8 juice-dextros-jästextrakt-agar). Helanoidpigment bildas ej i medierna ISP no. 1, 6 och 7. Kolonin på medium ISP nr. 2 är gFysiologiska egenskaper Maximal tillväxt observeras vid 28°C och 37°C. Vid 7°C och 45°C observeras ingen tillväxt. Tillväxten varierar från 1s°c :in 43°c_; aeianin bildas icke av L-alfa-aihyaroxifen- ylalanin (L-DOPA). Stammen 5907-21 är tolerant mot natrium- É tstammen J907-21, som är en mesofil, grampositiv aktinomyce- 6,60 481 pentoser och hexoser. De fysiologiska egenskaperna och kol-I hydratutnyttjandet visas i tabellerna 2 respektive 3.

Cellväggaminosyra- och helcellsockerkomponenter s “ ~ I Aminosyrasammansättningen hos cellväggen har undersökts en- ligt de metoder som har beskrivits av Becker et al. i Appl; Microbiol. lå: 236-243 (1965) och av Yamaguchi i J. Bacte- riol. Qg: 444-453 (1965) och har även bestämts medelst ami- nosyraanalysator (Hitachi 03420 Model). Sockerkomponenten i helcellhydrolysatet har identifierats enligt de förfaranden som har angetts av Lechevalier och Lechevalier i Chemical Methods As Criteria For The Separation Of Nocardiae From Other Actinomycetes. Biology Of The Actinomycetes And Related Organisms ll: 78-92 (1976). Cellväggen hos stammen J907-21 innehåller meso-diaminopimelinsyra och en liten mängd glycin. Helcellhydrolysatet uppvisar närvaron av glu- kos, mannos, maduros och ribos. Ovannämnda cellväggsamman- sättning och helcellsockerkomponenter antyder att stammen J907-21 tillhör cellväggstypen IIIB.

Taxonomi testam, bildar tillfâlligtvis rudimentärt, kort luftmyceli- um men saknar förmågan att bilda ett verkligt luftmycelium, sporbärande kropp och sporer. Stamen J907-21 har en cell- vägg av typ IIIB. Kända aktinomycetestammar, som uppvisar ¿cellväggar av typ IIIB; innefattar slâktena Actinomadura, :...,. .r...,.,~.,ms..-.~xww~w--wasef-wfee«q. v _ n, v30 Microbispora, Streptosporangium, Spirillospora, Planomono- vid -“dspora¿ Planobispora och Dermatophilus. Det vegetativa myce- fitliet hos släktet Dermatophilus, som är en obligat djurpato- Liigen i naturen; uppvisar både transversala och longitudinella Mlseggaeiaaer. Därför skiljer sig stammen J9o1;21 klart från _slåktetfhermatophilusQ återstående sex släkten utmärkes av at§:àe°påIlnfAmjceliet uppbär en sporvesikel (sporangium) ellerïartrospor. I motsats till Streptomycesarter anges fi4¿o*4a1 A (130 a i Glukos-asparaginfagar %Gl§cerolfas§aragin-agar många_stammar tillhörande dessa sex släkten vara mer eller mindre granntyckta vid sporbildning. Således tillhör stam- men J907-21 förmedlingen ett av ovannämnda sex släkten. _B1and de sex släktena har släktet Actinomadura rapporterats förekomma i jord över hela världen. Gordon har i J. Gen.

Microbiol. 122: 69-78 (1978) fysiologiskt karakteriserat 14 taxa av nocardiae inducerande Actinomadura madurae¿ Ba- serad på Gordons fysiologiska undersökningar har stammen Jsov-21 jämförts med A. meauree (tabell 4). stammen J907-21 är mera Äesläktad med Actinomadura»madurae (överensstämmel- se till 85,7 %) än med de övriga taxa som uppvisar cellväggs- typerna IIIC och IV (likhetsöverensstämmelse: 54,8 - 76,9 %).

De fysiologiska relationerna mellan de sex släktena med cell- väggstypen IIIB har emellertid icke fastställts, eftersom g de skiljer sig så mycket från varandra vad beträffar morfo- logi. Således kan stamen J907-21 endast klassificeras som en asporogen icke-Streptomyces.

Tabell 1 Odlingsegenskaper*hos stammen J907-21 'T**: dålig; flockiga, blekgula pelletter Trypton-jâstextrakt-medium (ISP nr. 1) D inget H dålig _ gulaktigt vit (92)*** till ljust olivbrun (94) inget Sackaros-nitrat-agar (Czapeks agar) N inget fll dålig 9 . gulaktigt vit (92) till måttligt olivbrnn (95) ingett W Id' U E* inget dålig :ljust gråaktigt gulbrun (79) till mörkt gråaktigt gnlbrun (81) OI (I$ 'nrï;5)flf;, g in a m e *U rv ,1iinget x måttligt gulaktigt brunt (77) ' ¿Ufi¿ (20 w Oorganiska salter-stärkelse- ~ -agar (ISP nr. 4) Tyrosin-agar (ISP nr. 7) Näringsagar Jästextrakt-maltextrakt-agar (ISP nr. 2) Havremjöl-agar (ISP nr. 3) Bennett: agar W H N 'u e 6 r* H Q 'B m »a u :~ m ya o r* OI Il Il I! IC 460 481 dålig gråaktigt gulbrun (80) inget eller mycket sparsamt; eventuellt bildat mycelium är rudimentärt och gulaktigt vitt (92) V « mörkt gråaktigt gulbrunt (81) måttlig gråaktigt gul (90) till mörkt gulaktigt brun (75) inget inget dålig 'mörkgui (as) :iii mörkt clivbrun (96) inget inget måttlig mörkt gråaktigt gul (91) till mörkt olivbrun (96) inget eller mycket sparsamt; eventuellt bildat mycelium är rudimentärt och ljust grå- aktigt gulbrunt (79) mörkt gulaktigt brunt (78) måttlig V gulaktigt vit (92) till grå- aaktigt gul (90) inget inget måttlig mörkt gråaktigt gul (91) till É mörkt olivbrun (96) inget eller mycket sparsamt; eventuellt bildat mycelium är rudimentârt cch gulaktigt ”vitt (92) 'II *v ,mö;kgu1t (85)_¥ lmåctlig 9 __ (ljust clivbrun (94) till "Û mörkt gulaktigt brun (75) -inget ï av i llysande orangegult (67) '(4¿o(4s1 0 VDYA-agar -flvf-Wwqq- - ,. 4. ,,,_" WH (Papavizas, 1964) Majsxàjöl-agar (Riker & Riker, 1935) C-2-agar (Nonomura, 1971) Potatis-morot-agar ~ 7(Cross et al, 1963) Koloni på medium ISP nr. 2: áw va U L* 1-5 ymnig -kraftigt mörkröd (14) :in svartröd (21) inget mörxrött (16) 'TJ . ymnig A : kraftigt gulaktigt brun (75) till mörkt gulaktigt brun (78) : inget : kraftigt brunt (55) 'fil-ICE* dålig ljust gulaktigt brun (76) till mörkt gulaktigt brun (75) L : inget eller mycket sparsamt; eventuellt bildat mycelium Il är rudimentärt och vitt (263) D : inget H dålig till måttlig W gulaktigt brun (78) L : inget D : mörkt gulaktigt rosa (30) god tillväxt; ytterst hög, hård och veckad; 3-5 mm i díam;, röd- aktigt svart (24) ytfärg, bildnf av intet eller rudimentârt luft~. mycelium 0 * observerad efter inkubation 3 veckor vid 2806 **( förkortningar: T = t111växu; F = frånsiaefärg; L = luftmycelium; D = diffunderbart pigment %.§** färg pch nummer inom parentes följer färgstandarden enligt (°ïf§f ¿VFke11§¿ x.L§ a n.n; Judd¿;Iscc~nBs cola:-name charts 11- ;Vfíustratedåwith"CentrçidÄCclors;.U.S. Deptg of Comm. Cir. “lvlhieswz-tïiv-ß-tzkefløv-:rvvfif- gråaktigt gul (90) till mörkt 9 Tabell 2 4eo 481 Fysiologiska egenskaper hos stammen J907-21 Test Temperaturintervall för tillväxt Gelatin-likvifak- tion Stärkelsehydrolys Reaktioner i skum- mjölk Bildning av mela- noidpigment Tyrosinasreaktion Nitratreduktion pH-tolerans NaCl-tolerans Lysozymtolerans Svar Maximal tillväxt vid 28°C till 37°C. Till- växtintervall från 15°C till 439C. Ingen till- växt vid 7°C och 45°C Likvifaktion Hydrolyseras Kuagwleras ej och pep- toniseras fullständigt Negativt Negativt Negativt _ Tillväxt vid pH 5,0- -11¿0. Ingen_tillväxt vid pä 4,5 ' Tillväxt vid 4% NaCl eller därunder. Ingen tillväxt vid 5% NaCl Använd metod ellef använt medium Bennetts agar 1% maltextrakt, 0;4% jästextrakt, 0,4% glu- kos, 20% gelatin Stärkelseagarplatta Difco skummjölk Tyrosin-agar, pepton- -jästextrakt-järn- -agar och trypton- -jästextrakt-medium Arais metod* 0,5% jâstextraktf 1% glukos, 0.5% KNO3, 0,1% CaC03 , Jästextrakt-malt- extrakt-agar Basmedium: 1,0% jäst- extrakt, 2% löslig stärkelse, 1,5% agar Känslig. Ingen tillväxt Tryptikas-sojamedium vid 0,001% lysozym + 1,5% agar *Arai, T. och Y. Mikami: Chromogenicity of Streptomyces.

Appl. Microbiol. gå: 402-406, 1972 1e4so 4s1 Tabell 3 Kølhydratutnyttjande hos stammen J907-21 .Glycerol } D(-)-arabinos V L(+)-arabinos D-xylos D-ribos , L-ramnos D-glukos D-galaktos K D-fruktos ¿ _» D-mannos \ L(-)-sorbos Sackaros Laktos Cellobios + Melibios - Trehalos A + I+v+++++++++< ^20 V Raffinos - D(+)-melezitos - - Löslig stärkelse V + Cellulosa _ - »- Dulcitol - Inositol “ _ +» Dfmannitol _ ' + D-sorbitol - Salicin +> _0bservationer efter inkubation 3 veckor vid 37°C. _ Basmedium: PridhamfGottliebs oorfianiska medium. , a' Förkørtningarå +: positivt utnyttjande * -= negativt vuuiyttjande. ' " 4so 481 11 'Tabell 4 Jämförelse mellan de diagnostiska fysiologiska egenskaperna hos stammen J907-21 och Actinomadura madurae ' Actinomadura* A 5 stam Jsov-21 maaurae (47)** É _ Sönderdelning av: Ä V Adenin + - å Kasein +' + É Hypoxantin + + : 10 Tyrosin A _+ + ,xarbam1d - - Xantin á - V - Beständighet mot: Lysozym V - * - Rifampin + V v Hydrolys av: Aeskulin + + Híppurat á + A - Stärkelse + + Syra från: ' Arabinos * + + _Cel1obios + + Glukos + + Glycerol + + f 25 Inositol + v É Laktos > - v É L _Hannitol + V ' Hánnos~ _ + I Helezítos - - 39 V sflelibios V A - - Raffinos “ * - - Ramnos V + + suxbitol V. eei _ _ - . i* tvfiæiffififisßfifle w \ »W/flw» . I , _ .- . ,, .w . .,,,.,...~ \ 4, . - _. wi, ï' 4sn 481 1= ' ' 30 Tabell 4 (fortsättning) - ' stam J9o1-21 Actinomaduraï* madurae (47) Citrat I - v Mukat . - - Succinat I + v Tartrat - - Nitrit från nitrat - + överlevnad vid SOOC, 8 h -V - + +: positiv -: negativ v: 15 - 84% av stammarna positiva * Data enligt Gordon et al.

** Antal undersökta stammar I likhet med andra organismer kan egenskaperna hos stamen J907-21 underkastas variationer. Så exemelvis kan artifici- ella varianter och mutanter av J907-21 erhållas genom behand- ling med olika kända mutagener, såsom ultraviolett bestrål- ning, röntgenbestrålning, högfrekvensvågor, radioaktiv strål- ning och kemikalier. 'Samtliga naturliga och artificiella EBM- 2478-producerande varianter och mutanter (betecknas i det följande som mutanter) med väsentligen samma egenskaper som stammen J907-21 faller inom ramn för föreliggande uppfinning.

Antibiotikaframstâllning BBM-2478-antibiotika enligt föreliggande uppfinning fram- stâlles genom att man odlar stammen J907-21 (ATCCV39417) eller en BBM-2478-producerande mutant därav med väsentligen ¿samma egenskaper under submersa aeroba betingelser i ett ivattenhaltigt nårmedium. Den producerande organismen får *växa i ett nârmedium, som innehåller en assimilerbar kol- Fkälla}¿erempelvis ett assimilerbart kolhydrat, Exempel (1 'på lämpliga kolhydratkällor innefattar glycerol, arabinos, vkfffrylos),glnkos, fruktos, mannos, löslig stärkelse, man- itpl och cellobios.g Närmediet bör även innehålla en assi- 3st 460 481 13 milerbar kvävekälla, såsom fiskmjöl, sojabönmjöl, majsstöp- vätska, peptoner, köttextrakt, jordnötsmjöl, jåstextrakt eller amoniumsalter. Oorganiska salter, såsom natriumklo- rid, ka1iumklorid,imagnesiumsulfat, kalciumkarbonat, fosfa- ter etc., tillsättes om så erfordras. Spårelement, såsom koppar, mangan, järn, zink etc., sättes till mediumet om så önskas eller kan tillföras som föroreningar med andra be- ståndsdelar i mediumet. Inkubationstemperaturen kan vara vil- ken som helst, vid vilken den producerande stamen kan växa, exempelvis från 15° till 43°C men det föredrages att utföra fermenteringen vid 25 - 35°C, speciellt 27 - 32°C. Ett neu- tralt eller näranog neutralt pH-värde användes företrädesvis- i mediumet och framställningen av antibiotikumet-utföres all- mänt under en tid av ca 6 - 10 dagar. Vanligen uppnås opti- mal produktion på ca. 6 - 7 dagar. För framställning av re- lativt små mängder kan skakkolvar och ytodling utnyttjas men för framställning av större mängder föredrages submers aeroh odling i sterila tankar. Når tankfermentering skall ut- föras är det önskvärt att framstalla ett vegetativt inocku- lat i ett närmedium genom att man ympar odlingsmediumet med en spor av organismen och, när ett ugnt aktivt vegetativt inockulat har erhållits, överför inockulatet aseptiskt till fermenteringstankmediumet. Lnftning i tankar och flaskor kan erhållas genom att man låter steril luft passera genom el- ler över ytan av odlingsmedinmet. Ytterligare omröring kan erhållas medelst en mekanisk omrörare. àntiskummedel, såsom isterolja, kan om så erfordras även tillsättas.

Framställning av BBH-2478 i odlingsmediumet kan lätt följas under odlingsförloppet medelst pappersskive-agar-diffusions- analys under användning av Hicrococcus lnteus PCI 1001 som testorganism.

Isolering av BBH-2473-antibiotika När optimal odlingsmediumspotens har uppnåtts separeras myce- L líet och icke upplösta återstoder från odlingsvätskan på kon- ~ventionellt sätt, såsom genom filtrering eller centrifugcring. 1 w f 14 ;àntibiotika i nyceliekakan kan utvinnas genom att man extra- herar denna-med metanol, avfiltrerar olösligt material och koncentrerar metanolextraktet till en vattenlösning. Akti- ifiitetenul den överliggande odlingsvätskan kan utvinnas ge- nom extraktlon med n-butanol och koncentrering av butanol- extraktet till en vattenlösning. De vattenhaltiga metanol- och butanolextrakt som innehåller BBH-2478A- och -B-antibio- tika kan därefter underkastas konventionella kromatografis- ka renlngsförfaranden så att man erhåller renad EBM-2478A och B. Ett föredraget renlngsförfarande åskådliggöres i ex- empel 2 nedan. V Fysikalisk-kemiska egenskaper hos BBH-2478-antibiotika BBR-2478 A och B erhölls som gulaktigt orangefärgade, kris- tallina fasta material. Båda BBM-2478-kmponenterna kan skiljas från chartreusin medelst tunnskiktskronatografi (etc). säsøm visas 1 tabell s. san-2418 A är 1äct1ös11g 1 dimetylsulfoxid, dimetylformamid, dioxan och surt vatten, ringa löslig i metanol, etanol och kloroform och olöslig i andra organiska lösningsmedel. Lösligheten hos BM-2478 B liknar den hos B88-2478 A med undantag av att BBK-2478 B är olöslig i surt vatten. BB!-2478 A och B ger positiva svar med ferriklorid och antronreagens. BBK-2478 A visar posi- tiv reaktion med ninhydrin medan BBK-2478 B är negativ vid gsama test. Tbllens och Sakagnchis reaktioner är negativa l_med båda komponenterna. De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos BBM-2478 A och Bgär sammanfattade i tabell 6. UV-spektra ,.,.V Üw¿för_de tvâ komponenterna liknar varandra och uppvisar maxi- A '3o.?i na vid 236, 2ss¿139s nen 422 nn 1 neutrala och sura lösning- lnar och vid 240, 253 och §35 pm ; airalisx lösqing. vassa *Ä~fieRgktra år nära besläktade ned-sgektrnn för chartreusin. IR- i l I» r'°<=1= â=1=åd¥;seö=es 1 fiflflfßffla 1 f 2: '-3 _§nnigçun)-spexcra för :hnn“221afa[y1§;sj1jrilfirernåfgrqcnfgçft_ -,_1,e,_,s,_._.,,.;~-__-_,.e,>_.,..,e...mms .v _, _,.._....;__.,....__ ._N_..,_...-..,_-..e,_.,.,,,._,, ___ 4 _ _g_____ ,_,__ '6 0 46o 481 wabeli 5 TC av BBM-2478 A och B och Chartreusin S102 (S102 .CRCIB-MBOH (723) EtOAC-Heüfl (1:1) ' aan-24786 '. .o,1a V o,s1 Chartreusin ' 0,65 ^ 0,48 Tabell 6 Fysikalisk-kemiska egenskaper hos EBM-2478 A och B Bau42478 A ann-2478 B Beskaffenhet Gult amorft pulver Gult amorft pulver smp. 2 ' 225 - 226°c V 211 - 272°c (sönd.) ltxïšö (c 0.5. çwnnnnx +124° -a° , neon 1: m Ämax m” (31616) , 236 (590) ' 236 (mo) 266 (550) 266 (700)) _ 333 (100) - 333 (118) I ' 378 (132) 378 (169) 398 (205) (398 (255) 422 (225) 422 (290) Analys runner: c 259,26 ,c_ 63,61 , n 5,40» n 4.51 n 2,06 L Beräknat för: C33H35NO13-H20 C26H22010 “ ' c 59,01 2 ~c 63,16 _ _ . a Å 5,55) , - u 4.46 g 1[3O - 2 , u, 22,09 3 " , |\' É*st:u2tu¿u¿aersa2niàgar-avsgende ßßg;241s-ancibiocika ,fl1¿(¿jfl ¿¿»Ü*~fß~§i@ “ f¿:0fl 1 6) Cfißfäßškfirflfišfi får 38332478 A har påvisat närvaron av.33 kol i@gé§äFtâg¿?(¿?¿â? gšggper: fyr§(c_gg3, en -0§§3, nio ;>CH~, G30:,C5:f}f§§@ÄfC§F@§ÉhÄ13Iïiçág Dessa C33-spektraläata iv 3pá§;gg;;9a§nædf§ik§§§§a1y;1sk;fçata fö; ßßuézavs 2 ger mle- É l15 Chartarin íl4so 481 '| I I kylformeln C33H35NO13 för antibiotikumet. EBM-2478 A hydro- lyserades med 0,4 N metanolisk klorvätesyra under återflöde 1 timme. De gula kristaller som utföll tillvaratogs genom filtrering och filtratet koncentrerades i vakuum för erhål- V lande av en sirap innehållande ninhydrinpositiva socker- Ifragment. Det kristallina materialet identifierades som char- tarin, dvs. aglykonen av chartreusin, genom jämförande spek- tralanalys med ett autentiskt prov. 29 Det sockerfragment som ingick i det vattenhaltiga koncentra- É tet var den anomera blandningen av en disackarid (förening I), som separerades medelst kromatografi på Amberlite CG-50 (Nflálæ-form) får erhållande av oL --_ och Û -metylglykosider (Ia och Ib) i näranog lika stora mängder. Holekylformlerna ¶30 för föreningarna Ia och Ib_fastställdes till C15H29N08 base- ~rat på mass (M++1:m/z 352)- och CHR~spektra. De fysikalisk- dlffkemiska egenskaperna hos Ia och Ib är sammanfattade i tabell wjï 7. Fdreningarna la och Ib motstod ytterligare_syrahydrolys fl¿¿ocn orsakade en omfattande sönderdelning av de resulterande ,ef¿esbekerfragnenten under sera betingelser; svåra nog att spjäl- X_§f¿ka glfkosidbindningen; Én blandning as förening Ia och Ib! H¶l5(§2Ö mg) aeetylerades i metanol för erhallande'av ett mono~ ;ÅflÉacetylderívaffiŧQ Ed; Hf;1:m/É 39§)¿ som hydrolyserades å 10 f 30 d4eos4s1 17» i 4,5 N metanolisk klorvätesyra. Produkten kromatograferades _på en kolonn av silikagel med en lägre fas bestående av CHCl3¥Me0H~c.NH40H (6:1:1) för erhållande avrx - och /7-ano- merer av ett N-acetylaminosocker (förening N-Ac-IIa, 140 mg och N-Ao-Iïb, 22 mg) och av ett neutralt socker (för- _Vening IIIa, 85 mg och IIIb, 79 mg). Vid behandling med mättad Ba(0H)2-lösning omvandlades N-Ac-IIa kvantitativt till den fria aminoformen (förening IIa).,Fysikalisk-kemiska data för IIa, IIIa och IIIb återges i tabell 8. Förening IIa fast- ställdes vara metyl-2~amino-2,6fdideoxi-3-0-metyl-°(-D-galak- topyranosid utgående från analysen av dess NHR-spektrum. Så- som visas i tabell 8 innefattade NHR-spektrumet för IIa 5 ringprotoner jämte två QQQ3- och en C-QE3-signaler. Analys av första ordningen av ringprotonerna visade kopplingskon- stannar-na " .11_2 = 3,s,.12__3 = 10,5, a3__4 = 3,0, J4_S <1,o och J5_6 = 6,4 Hz, som är kompatibla med den angivna struk- turen. Vidare liknar fysikalisk-kemiska data för NO-diacet- yl-Ira (smält-punk: 1s3-1s4°c och [q 11233: +1s4° (c 0,3, cncl de som har angivits för metyl-2-acetamido-4-0-acetyl-2,6-di- 3) deoxi-3-0-metyl-u(-D-galaktopyranosid av M,B. Perry i Can.

J. Chem. âgz 3251-3255 (1974). in; a ocna, n =n à zfl, ¿PHR+spektrumet för IIIa visade kopplingskonstanterna J1_2 = lg¿:~4,5, J4_5 <1,0 och J5_6 = 6,7 Hz, medan kopplingskonstan- gg g»terna for IIIb var J l"“:Ér§nvaronHav en ringproton på C3 var uppenbar i båda spektra.

Alpškfiyçlanalysen visade att_IlIa och IIIb var respektive CK- : 7181. Och = 615 az. 1¥2 3.7* laâïšfledoxi*:Fcšmeltylgulßpyralwsid “ s o ' A” deoxi-3šçfmetylgalaktopyranosid. Ö ß f 460 481 1ol 18 Det autentiska provet av metyl- ß-D-virenosid visade sig ge- nom TLC- och NMR-spektrum skilja sig från IIIb: H1- och H5- -signalerna hos metylvirenosld observerades avsevärt längre nedfälts än signalerna hos IIIb, vilket visade att C3-OH 1 metylvirenosid förelåg i axiell orientering medan samma I grupp iïlflßförelåg i ekvatoriell orientering. III tillskrevs D-konfiguration på basis av de obtiska vridningsvärdena för IIIa och IIIb och på basis av 1l[M]CuAm som observerades för 'IIIa (-13090). Således fastställdes IIIa och IIIb vara-met-_' yl-G-deoxi-B-C-metyl-X - respektive - ß -D-galaktopyranosid.

IIIa: II 233 ”un” i=s , = Bindningen av de tvâ sockren fastställdes medelst mass- spektrum för Ia och Ib och deras acetater, vilka spektra uppvisade fragmentjoner, som kunde tillskrivas en II -+ III- sekvens av disackariden. PMR-spektrumet 200 Hflz och de av- kopplingsíörsök som utfördes för N,O-triacetyl-Ia avslöjade att socker II var bundet C2-OH i III genom en ø(-glykosi- A disk bindning och därför bestämdes strukturerna för Ia och Ib vara följande: 460 7481 19 "UV-spektra för BBM-2478 A, som nppmättes vid_olika pH-vär- den, har stor överensstämelse med motsvarande spektra för chartreusin. Detta visar att disackaridgruppen i EBM-2478 A är bunden till ohartarin vid samma hydroxylgrupp som i char- treusin. IR-spektra för BBM-2478 A och chartreusin i kloro- form visade samma karbonylabsorptionsmönster, vilket under- byggde ovan angivna antagande. I NHR-spektrumet för N-acet- yl-BBM-2478 A gav den anomera prótonen i III upphov till en dubblett med ett avstånd-av J = 8,0 Hz, vilket gör att vi tillskriver antibiotikumet en ß -pyxïanosidkonfiguration av III. ' ann-ana ß tillskrevs molçxylfomeln czónzzom på basis av mikroanalys. Vid mild sur metanolys gav BBM-2478 B chartarin och neutrala socker (IIIa och IIIb), som var identiska med de som erhölls från BBM-2478 A. Därför är uppenbarligen BBM-2478 B analogen av EBM-2478 A utan någon aminsockerrest (II). Således fastställdes strukturerna för BBM-2478 A och B till att vara följandeå _ BBM-247aA “ Tabell 7 BBM-24783 Fysikalisk-kemiska egenskaper hos föreningarna Ia och Ib Beskaffenhet Smpø - ' TLC n-BuOH-ACOH-H20 (63:10:27) Holekylformel Hasspektrum (m/z) run (so unz 1 nzøyö' _,i Pp? :¶,§5fÜ1f-1 ,4 1 _4,9o (1n,a,J=4.3 az) Förening Ia Vitt pulver_ 19 - a2°c +211° af 0,19' C15H NO + 29 8 352 (H +1)' 319 235 160 1,25 (3H, 1,28 (3H, 1,37 (38, 3,03 (1H, 13,41 (3H, 3,46 (38, d) di ) d-d) s) S) 3 1 5 Förening Ib Vitt pulver ao - a3°c ' +116° o,1s °1s“29f°s 352 (H +1) 319 235 169 1,23 1,26 1,29 3,07 (331 Ö) (33: Ö) (33: 5) 3,44 (sa, s) 3,54 (3H, S) 3,4-4,4 (GH, M) 4,51(1fl,d,J=8,0 EZ) ,09 (1H,Ö,J=3,5 EZ) 41. fflww-ww~.-_w.__.___,___ -..__ __... -..en A __, n, , 4 4, -4 «.~,.-,-.-,--fi-fi,»«»~,<~«.~-- » ~~.-,».....,___...,.,, _ j, , 311 1 460 401 Tabell a' Fysikalisk-kemiska egenskaper hos föreningarna na, Ina och IIIb V ¿ _ 5 » _ IIa IIIa Illb __ __ ß Beskaffenhet Blekgul sirap A Bïekgul sirap ' Bïekguï sirap :10 4 1 +106°(= 0,2 Menu) +1s2°(c 0,scuc13) -33°1c 0,5 cHc13) _TLc = Rf ' ¿ cHc13-neon-NH4oH 0,57 0,35 0,32 v (zmlyläsre fas _ ' § n-ßàoflfncofl-020 0,20 0,41 0,40 f (63=1o=z7) f _ 1 Ifiolekylformelv C8H17N04 C8H1505 C8H¿605 f PNR,_60_MHz i 020 1,26 (d,3H,s,4)* 1,27 (a,3H,s,7) 1 1,27 (s,3a) É 15 6 i ppm 2,97 (0-d,1H,3,a& 1,34 (s,3H) 1,28 (d,3a,a,s) 1 95) _ I É 3,41 (s,3a) , 3,30 (s,3H) 3,45 (br-5,10) É 3,43 (s,3H) - 3,43 (br-5,10) 3,52 (a,1H,1,a) 3,45 (d-d,1u,3,na 3,03 (0,1H,4,s) _ 3,60 (s,3H) ,5) 1 4,00 (q,1H,6,4) _4,1a (q,1n,6,7) 4,00 (q,1n,s,s) 4,02 (br-?,1H, 4,75 (d,1u,4,s) 4,39 (d,1H,7,ß) É > 4,12 (0,1H,3,s) 1 p *(mu1típ1icitet,.proton, J i Hz) evßiologiska egenskaper Å~Ü¿QB§fáinsta3inhiberande kqneent:eti0nen_(H1K) av BBH~2478 he- ::š§3§§§å¿i,j俧öre1se med cngitrefisip med aåseenae på o11ka y:Ķ»išifiiyaeech§gtamnegatiVà ßàfiyerieš och švampar liksom fieä íüšeendefpå vis$åfanae:9bàQeigenismer medelst den två- åaldig ege;åe;ieuts§å§ninšsfieflodenQeflâringsegarmedíum använ- gfienàeåíyiyà pen giagnegetiva bakterier, GAH-àgar- S Aeneetqba etgánisfiešfpchqSábóutandeagar-medium för swamvar S344 firàmfiäš av t4bq;1*9Tvisafle Bßfl-24184. 3 och '1l'>::-rw~f1~:.:v~w~~fl-~,.' 'r V- ~ in 22 _ chartreusin liknande antibakteriella spektra med avseende på egrampositiva bakterier och anaerober medan de var inaktiva med avseende på gramnegativa bakterier och svampar. Den anti? d{>A stafylokockiska aktiviteten hos BBM-2478 A var 2 --4 gånger högre än hos BBM-2478 B eller chartreusin.

«Antibakteriell aktivitet hos BBM-2478 A och B 1 n1x.(ß9 / ml) Testórganism 1 10 BBM-2478A EBM-24783 Char- ; . treusin \ ' Staphylecoccus aureus 209P 1,6 ~ 3,1, 3,1 Staphylococcus aureus Smith 0,8 6,3 6,3 Bacillus subtilis PCI 219 0,8 A 0,8 '0,4 ! V15 Micrococcus luteus PCI 1001 V 0,8 ß 3,1 0,8 É Hicrococcus flavus D12 I 0,8 V 1,6 0,4 1 nscherichia coli arna 100 >1oo ->1oo Klebsiella pneumoniae D11 100 >100 >100 Psendomonas aeruginosa D15 100 >100 >100 á » 1 V ' Candida albicans IAN 4888 >100 >100 >100 Cryptococcus neoformans D49 >100 >1D0 >100 _ Aspergillus fumígatus IAM 2530 >100 >100 >10O § Trichophyton mentagrophytes É 25 n1ss V >1oo >1oo >1oo Bacteroides fragilis 12,5 . _ 6.3 _Clostridium diffícile 12,5 _' 25 V »A Clostridium perfr§ngens . 6,3 " 1,5 §30 ¿ Propionibacteripm acnes 6,3 3,1 '~Q"Anti;nmöraktiviteten hos EBM-2478 A bestämdes på möss i jäm- Mföreisehmed çhartreusin med avgeende pâïlymfocytísk leukemi ŧ§,_lšfifipid¿leukemiÄL1210Å¿eh1melanet§ekt Qelanom B16. Tu- nà erna?šfifiíanteradegfådfijayšrireneair nes BDP,~möss 1 ett an-A ,fta1fav§104,.105arespekfiiv8:106 eeiler per mus: Testföreningar- n¿4á§iös;es 1 0,9 s saltiögning innehållande 10 z a1meuy1su1f- g30 460 481 23 .oxid och graderade doser av antibiotikumet administrerades Vintraperitonealt 24 timmar efter tumörimplantationen. Be- handlingarna utfördes en gång dagligen under 9 dagar ,(qd 1-à9). Resultaten visas i tabellerna 10, 11 och 102.

~BBM-2478 A var ca 10 - 30 gånger aktivare än ehartreusin vad gäller den minsta effektiva dosen och uppvisade T/C-värden som var överlägsna de för chartreusin med avseende på samtli- ga testade tumörer. BBH-2478 B visade sig vara i avsaknad av antitumöraktivitet. Den akuta toxiciteten hos BBM-2478 A be- stämdes på möss (ddï-stam) genom en enda intraperitoneal ad- ministrering, varvid LDSO-värdet uppgick till 38 mg/kg.

Tabell 10 Effekt av BBM-2478 på P388 leukemi Dos, ip Genomsnittl. Uverïevande på (mglkgl HÜT T/C viktändr. på dag dag*) .(dagar) (1) dag 5 1 5 45 000-z470A 3 20,0 22z** -1,0 s/6 0/s 1 21,6 , 239 +0,a -6/6 0/6 0,3 17,0 109 +1,0 0/6 0/6 0 0,1 14,5 0 161 ' +1,2 6/6 0/6 0,03 10,0 111 ,+z,3 6/6 0/6 0,01 10,0 111 +2,0p 6/6 0/6 Chartreusin 10 19,5 217 +1,3 6/6 0/6 3 15,0 167 +1,s 6/6 0/6 1 14,0 166 +1,3 0 6/6 0/6 0,3 10,6 111 +z,0 6/6 0/6 0. 0,1 9,0 100 +2,a 6/6 0/6 vehikeï + 9,0 1 - '+z,4 12/12 O/12 l¶:'¿?;tírke1 angr signifikant antituaöreffekt I. : m _ 24 150511 11 g ¿ Effekt av 800-2478 pa L1210 15uxem1- 1 ' , . 1 , Å Dosdp * Genomsnittï. överlevande på ¿ (nøgllig/ HUT ' T/C .viktändrn på" dag _ 5 g _ _ dag 1 (dagar) , (2) dag 5 (9) 5 45 880-2478A 3 '12,0 1s0** 0 -0,1 5/6» 0/5 1 11,0- 138 +o,8 5/5 0/5 0,3 10,5 131 +1,3 55/5 Å 0/5 0,1 8,0 100 +z,5 5/5 0/5 z 10 A 0,03» 8,0 100 +2,9 5/5 0/5 1 0,01 8,0 100 +3,z 5/5 0/5 V ~ charcreusin 10 11,5 3 144 1+1,3 5/5 A0/5 i 3 Ä ' 9,0 - 113" +1,4 5/5 0/5_ M 3 1 9,0 g ,115 , +1,9 5/5 0/5 0,3 8,0 100 +3,2“ ,5/5 0/5 ¿ 0,1 _ 8,0 100 +3,1 5/5 0/5 å _ vehikei - 8,0 - +z,8 12/12 0/12 i i * qd 1-'9 “cirkel anger signifikant antitnzmöreffekt ; 20 1 1 A ».' 155511 12~ , Effekt av 3824-12478 på B16 mélanom Dos,ip Genomsnittl. Over-levande på (IIQ/lågl MUT T/C- viktändr. på i dag _25 5 dag 1 (dagar) (Z) dag 5 (g) 5 45 *- ~ 880-24780' »3 41,5 295** +1,5 1 5/5 0/6 1 3 34,5 245 +z.2 5/5 0/5 1 10,3 25,5 182 1 +2,5_ Q 15/5 0/6 01, , ~1,,,,,, 1 -V 0,1 18,5 1 132 +z,5 5/5 1 0/5 1 gg¿¿30 I,>]¿¿ ,»' 0 0,03 15,0 114 +2,0 2 5/5 0/5 -if/fçparyyeusin '10i 25,0 H. 179 gg +1,1 5/5 0/5 'da ,3 . 20,5 ;-,¿145 1 a +2,3 1 5/5 0/5 3 ,1_.. =¿15,0f ;ïdi114 -- 3 +z,3 3 , 5/5 1 1/5 1 0,3 _,i14,0 _'ï¿100ï3 51 +1,8 5/5 0/5 i~* .ffïB}'1§,0 1 ¿ _i-,,<~g*,"+z,3 i, 10/10 0/10 -cdri517angë}f;igÅ1*1k$ntganšiauwökèffekt !,,,f5 1 10k* .p30“ 460 481 Såsom framgår ovan uppvisar BBM-2478 A och B potent antibak~ teriell aktivitet med avseende på aeroba grampositiva bakte- rier och anaeroba bakterier och är således användbara vid te- rapeutisk behandling av däggdjur och andra djur med avseende på infektionssjukdomar orsakade av dylika bakterier. Vidare 'kan dessa föreningar användas"vid andra konventionella till- lämpningar av antibakteciella medel, såsom för desinfektion “Vav medicinsk utrustning och tandläkarutrustning. fl _ uDen signifikanta antitumöraktivitet som uppvisas av BBM- -2478 A med avseende på experimentella mustumörsystem visar att BBM-2478 A även är terapeutiskt användbar för inhibitionv av tillväxten av däggdjurstumörer.

Föreliggande uppfinning tillhandahåller därför även ett sätt att terapeutiskt behandla ett värddäggdjur, som är angripet av en bakterieinfektion, vilket sätt innebär att man till värddjuret administrerar en effektiv antibakteriell dos av BBH-2478 A eller BBH-2478 B eller en farmaceutisk komposition därav. Vidare tillhandahåller föreliggande uppfinning ett sätt att terapeutiskt behandla ett värddäggdjur, som har an- gripits av en malign tumör. vilket sätt innebär att man till namaaa~sa=as3ue saaiaisrrsas se 1-«« se av asa- -2478 A eller en farmäceutisk komposition därav.

Enligt en annan aspekt av föreliggande uppfinning tillhanda- hâlles en farmaceutisk komposition, som innefattar en effek- tiv antibagteriëll manga av ßsufzavs A eller nan-2478 B 1 kom- bination med en inert farmaceutiskt godtagbar bärare eller utspädningsmedel. Vidare tillhandahåller föreliggande uppfin- ning en farmaceutisk komposition, som innefattar en effektiv .tumörinhiberande~mängd av BBH-2418 A i kombination med en in- ext fa;aa=eut1sxtVgoatagßa: bärare elias usspaesisgssaai- r§ Dessa kompositioner kan framställas i vilken farmaceutisk form 7helst} som är lämplig för parenteral administrering. dßerdningar enligt uppfinningen för parenteral administrering innefattar_sterilalvattenlösningar eller vattenfria lösningar, Ü .10 n:35*' ._ ,_,..,..._,.,.........-_. f 460 481 26 suspensioner eller emulsioner. De kan även framställas i form av sterila fasta kompositioner, som kan upplöses i ste- rilt vatten, fysiologisk saltlösning eller något annat ste- rilt injicerbart medium omedelbart före användning. Det tor- de inses att de verkliga föredragna mängder av BBM-2478-anti- biotika som användes varierar beroende på den speciella kom- ponenten ifråga, den speciella beredningsformen ifråga samt den speciella sjukdomen, värddjuret och sjukdomsstället ifrå- ga. Många faktorer, som modifierar verkan av läkemedlet, kan beaktas av fackmannen, exempelvis ålder,_kroppsvikt, kön, di- et, administreringstid, administreringssätt, utsöndringshas- tighet, värddjurets tillstånd, läkemedelskombinationer, reak- tionskänslighet och sjukdomens svårighetsgrad. Administre- ringen kan utföras kontinuerligt eller periodiskt inom den maximalt tolererade dosen. Optimala administreringsdosering- ar för en given uppsättning av tillstånd kan fastställas av fackmannen under användning av konventionella doseringsbestäm- ningstest mot bakgrund av ovan angivna riktlinjer.

Uppfinningen åskådliggöres närmare medelst följande utförirgs- exempel, vari samtliga temperaturer avser Celsiusgrader. Am- berlite CG-50 är ett varunamn, som innehas av Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pa., U.S.Ä., för ett svagt surt katjonbytar- harts av karboxylsyratyp. Diaion HB-20 är ett varunamn, som innehas av Mitsubishi Chemical Industries, Japan, för ett icke-joniskt makroretikulärt polymerharts.

Exempel 1 Fermentering av BBM-2478 A och B En välvâxt kultur av aktinomycetestammen J907-21 användes för ympning.av ett vegetativt medium som utgjordes av 3 % löslig fstarxelse, 1 s meta-lever (nifcø), 6,5 z fiskmjöi, 0,3 a 'áaCl, G,1W% (NH4)2S04 och 0,6 % CaC03, varvid pH-värdet in- iställdes på 7,0 före sterilisering. Det vegetativa mediumet ='inkuberades vid 28°C under 72 timmar i en rotationsskakare »vg(250 v/nin,) och 5 ml av den tillvâxta kulturen överfördesl II * 4eo 481 27 till en 500 ml Erlenmeyer-kolv innehållande 100 ml av ett fermenteringsmedium med sama samansättning som det vege- ltativa mediumet. Fermenteringen utfördes i.en rotationsska- kare vid 28°C under 7 - 10 dagar. Den antibiotiska aktivi- lteten i fermenteringsvät kan bestämdes medelst pappersski- ve-agar-diffusionsmetoden under användning av Micrococcus luteus PCI 1001 som testorganism. Antibiotikaproduktionen uppnådde en maximal potens av 150 pg/ml efter 6 - 7 dagars fermentering. ' Exemgel 2 Isolering och rening av BBM-2478 A och B Skördad fermenteringsvätska (20 liter, pH 6,8), som hade framställts enligt exempel 1, separerades i en myceliekaka och överliggande vätska genom användning av en centrifug av Sharpless-typ (Kokusan nr. 4A). Myceliekakan extrahera- des 3 gånger med vardera 5 liter metanol. Efter avlägsnan- de av det olösliga materialet genom-filtrering kombinera- des metanolextrakten och koncentrerades i vakuum till en vattenlösning. Den överliggande vätskan extraherades med liter n-butanol och extraktet indunstades i vakuum till en vattenlösning. De tvâ vattenhaltiga koncentraten kombi- nerades och applicerades på en kolonn av Diaion HP-20 (Mit- subishi Chem. Industries, Tokyo, á 5,5 x 60 cm), som fram- kallades i tur och ordning med 5 liter vatten, 5 liter av en 50%-ig vattenlösning av metanol och 6 liter av en 80%- A-iggvattenlösning av metanol. De fraktioner som innehöll 'gßßä-2478 övervakades medelst pappersskiveanalys under an- _vändning av B. subtilis H45 (Rec'l som testorganisn. De ak- xf tiva fraktioner som elnerades med den 80%-iga vattenlösning- u¿,Åïen av metanol poolades, indunstades under reducerat tryck och êfrystorgxaaes fan; erhållande av 4,5 g asn-zavs-xomplex 1 i7form av en gul råprodukt. Råprodnxtkomplexet applicerades på :en kolonn av silikagel io 3,5 xl55 cm), som förtvättades med rllfgkloroform, och aktiviteten eluerades medelst en kloroform- 0~f5-netanol-blandning med en stegvis ökning av metanolkoncentra- fÜ“§¶ftionen (5 till l0fvolyn%), De första aktiva fraktioner som » ;'4eo 4s1 I 28 eluerades med 5%-ig metanol tillvaratogs, koncèntreradeš 1 vakuua och lyoiiliserades för erhållande av BBM-24788 (72 mg). De andra aktiva fraktioner sam eluérades med 10%-ig metancl upparbetades på liknande sätt för erhållande av ett halvfast material av EBM-2478A 12,51 9). sistnämnda fasta material kromatograíerades ytterligare på silikagel under användning av ett mdeltrycksvätskekromatogram (ko- loänz Kíriyama d 11 x 500 un: pump: FHI Lab Pump, tryck: 80 - 90 psi).¶E1uering med klorofiørmfmetanol (vø1ymförhå1- lande 97:33 gav aktiva fraktianer, som vid køncantraring 1 vakuum gav ett hcnngent fast material av EBM-2478 A (1,30 9). Detta fasta material kristalliserades ur metanol' under erhållande av gulorangefärgade stavar av EBM-2478A~ -monahydrat.

Claims (1)

1. Q? 460 481 1. Antíbintikumet EBM-2478A ned formeln 10 15 20 2- 25 30 ,«,??3; É8š§a:ande för framställning av antibiotíkumet BBK-2478A V ”i u 10 0 mi; “ M5- wf o” 15 Å k â n n e t e c k n a L dârav..att man odlar aktinomycetes- å stammen JQU7-21 (ATCC 39417) eller en BBH-2478A-producerande E mutant därav med väsentligen samma egenskapeš 1 ett vatten- ; haltigt nârmedíum. som innenaíler assimilerbara källor av kol 20 A och kväve, under submersa aeroba betingelser till dess en väsentlig mängd EBM-2478A har producerats av nâßnda organism i nämnda ødlingsmedíum och att man därefter utvinner SBM- 2478A från oldíngsmediumet. 4. Förfarande för framställning av antíbiotikumet,BBM-24783, i med formeln )n¿n g g e c_x n aagf qätav, aut nan odlar aktinomycetes- ID IS 20 25 33 4eo 481 3! “stammen Jeov-z: :Aros 39411» eller en ßau-z-:vàs-praauceranae _mutant därav med väsentligen samma egenskaper L ett vatten- naltigt närmedium, som innehåller assimilecbara källor av kol och kväve, under submersa aeroba betingelser till dess en väsentlig mängd BBM-24788 har producerats av nämnda orqanísm 1 nämnda odlingsmedium och att man därefter utvinna: BBH~ 24785 från odlingsmediumet. S. Fhrmaceutisk komposition innefattande en~effektiv anti- bakteriell mängd av antibiotikumet BBM-2478ß med formeln í kombination med en farmaceutisk bärare eller utspâdnings- medel- 6. Farmaceutisk kompøsítíon innefattande en effektiv anti- bakteríell mängd av antibíotikumetwßßfl-24788 med fureeln 4 6@ 4 ß %1 _ p Zl å f V kombination med en farfnaceutisk ivärare ellezf utspädnings» , V medel. É 7. Fzscmaceutísk xompositiøn innefattande en effektiv Lumöw _ s innineranue mängd av anriniouxume: aan-zman men formeln Lä: i Ei i å z w , :x 1 % 15 i k i f , 20 g i kombination med en farmaceutisk bärare eller utspâdnings- medel- .ßwßm-mflw-4ømtzwrww~.~»~ N. ,. , ._ ,. F. ._.,..,