DE3436137A1

DE3436137A1 - Antibiotika, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende pharmazeutische mittel

Info

Publication number: DE3436137A1
Application number: DE19843436137
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Tokio/Tokyo Kawaguchi; Masataka Kawasaki Konishi; Takeo Yokohama Miyaki; Koko Bozeman Mont. Sugawara
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1983-10-03
Filing date: 1984-10-02
Publication date: 1985-05-15
Anticipated expiration: 2004-10-03
Also published as: IL73126A0; OA07827A; IL73126A; JPH0689017B2; AT381507B; HU192461B; FI79141C; HUT37170A; ATA313184A; IT1176854B; DK473484A; MX9202848A; IT8422961A1; CH666043A5; FI843823L; PT79310B; AU3354884A; CA1242159A; FI79141B; CY1534A

Description

Die Erfindung betrifft Antibiotika, ein Verfahren zu deren Herstellung und diese Antibiotika enthaltende pharmazeutische Mittel.

IQ Erfindungsgemäß werden zwei antibiotisch wirksame Verbindungen bereitgestellt, die Glykoside darstellen. Diese Glykoside bestehen aus einem Aglykon, nämlich Chartarin, d.h. dem Aglykon von Chartreusin, und einer oder zwei Zuckereinheiten. Das Antibiotikum BBM-2478B weist eine

Jg Zuckereinheit der Formel

CH₃ OH
20

auf, die an das Aglykon gebunden ist. Das andere erfindungsgemäße Antibiotikum BBM 2478A hingegen weist zusätzlich die Aminozuckereinheit der folgenden Formel auf:

30

Das antibiotisch wirksame Chartreusin ist beispielsweise beschrieben in J. Am. Chem. Soc. 75: 4011-4012 (1953) und HeIv. Chim. Acta 47: 1459-1484 (1964). Es weist denselben Aglykonteil auf wie die erfindungsgemäßen Antibiotika,

M/25 193

enthält jedoch zwei andere Zuckereinheiten, d.h. D-Fucose und D-Digitalose. Chartreusin besitzt folgende Strukturformel:

OH

HO

D-Digitalose

D-Fucose

Chartreusin kann man durch Fermentation von Streptomyces chartreusis, Streptomyces Sp. Nr. 747 (S. viridis), Streptomyces Sp. 6A36 (S. viridochromogenes) und zweier Actinomycetesstämme, die mit Streptomyces Sp. X-3988 und S-465 bezeichnet sind. Chartreusin ist dieselbe Verbindung wie das Antibiotikum 747 und das Antibiotikum X-465A.

Gegenstand der Erfindung ist ein antibiotisch wirksamer Komplex, der mit BBM-2478 bezeichnet ist. Diesen Komplex erhält man durch Kultivieren eines Actinomycetesstammes, der mit Stamm J907-21 (ATCC 39417) bezeichnet ist, oder durch Kultivieren von Varianten oder Mutanten davon in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält. Die Kultivierung führt man bei submersen aeroben Bedingungen durch, bis man eine

erhebliche Menge des BBM-2478-Komplexes in dem genannten Kulturmedium erhalten hat. Anschließend gewinnt man den

BBM-2478-Komplex aus dem Kulturmedium. Dieser BBM-2478-5

Komplex enthält zwei bioaktive Bestandteile, nämlich die Antibiotika BBM-2478A und BBM-2478B, die man mit Hilfe üblicher chromatographischer Verfahren auftrennen und im in wesentlichen reiner Form isolieren kann.

BBM-2478A und B wirken antibakteriell gegen aerobe, grampositive Bakterien und anaerobe Bakterien. BBM-2478A inhibiert auch das Wachstum maligner Tumore bei experimentell erzeugten Tiertumoren.

Von den Figuren zeigen: Figur 1 das Infrarotspektrum von BBM-2478A,

Figur 2 das Infrarotspektrum von BBM-2478B, 20

Figur 3 das ^-NMR-Spektrum (80 MHz) von BBM-2478A in CD-OD und

Figur 4 das ¹³C-NMR-Spektrum (20 MHz) von BBM-2478A

in dg-DMSO.

Gegenstand der Erfindung sind somit antibiotisch wirksame Glykoside, die in der vorliegenden Anmeldung mit BBM-2478A und BBM-2478B bezeichnet sind. Gegenstand der

Erfindung ist ferner ein Verfahren zu deren Herstellung durch Fermentation eines Actinomycetesstammes, der mit Stamm J907-21 bezeichnet ist. Dieser produzierende Organismus wurde aus einer Bodenprobe isoliert, welche in El Salvador gefunden wurde. Dieser Stamm ist derzeit nur insofern klassifiziert worden, als daß es sich um

einen nicht-Streptomyces Actinomycetesstamm handelt. Eine biologisch reine Kultur dieses Organismus wurde auf übliche Weise hergestellt und bei der American Type Culture Collection, Washington, D.C, unter der Nummer ATCC 39417 hinterlegt.

Taxonomie der produzierenden Kultur

Der Stamm J907-21 bildet häufig verzweigte, nicht-fragmentierende vegetative Mycele aus, ist jedoch nicht in der Lage, ein richtiges Luftmycel zu tragen. Dieser Stamm bildet, soweit bis jetzt festgestellt wurde, keine Sporen aus. Da dieser Stamm meso-Diaminopimelinsäure in der Zellwand und Madurose in dem Hydrolysat der gesamten Zelle enthält, wird dieser Stamm J907-21 als "Zellwand Typ HIß" eingeordnet. Der Stamm J907-21 trägt keine

_o_ morphologisch ausgeprägten Körper, wie eine Sporenkette oder ein Sporangium. Der Stamm J907-21 kann daher derzeit nur als nicht-Streptomyces Actinomycetesstamm klassifiziert werden.

r,r- Morphologie

Ao

Der Stamm J907-21 bildet lange, häufig verzweigte vegetative Mycele (0,4 μπι breit), die nicht in stab- oder coccenförmige Zellen fragmentieren. Auf einigen Agarmedien

_ bilden sich gelegentlich rudimentäre kurze Luftmycele, 30

ein richtiges Luftmycel bildet sich jedoch auf allen beschriebenen Medien nicht aus. Soweit festgestellt wurde, bilden sich keine Sporen-bildenden Körper und Sporen aus.

Eigenschaften der Kultur

Der Stamm wächst, wie in der Tabelle 1 gezeigt, auf natürlichen organischen Medien mäßig, während er auf den meisten chemisch definierten Medien nur wenig wächst. Obwohl der Stamm J907-21 kein wirkliches Luftmycel ausbildet, bilden sich auf den ISP-Nummern 2 und 4 Medien

YQ und Bennett's Agar rudimentäre kurze Luftmycele teilweise aus. Auch auf dem ISP-Nummer 7 Medium, dem Cobalamin oder ein Vitaminkomplex zugegeben worden war, bildet sich ebenfalls ein rudimentäres Luftmycel aus. Auf den meisten Agarmedien ist die rückseitige Farbe der vege-

^g tativen Mycele schwach gelb bis braun (verschiedene Schat tierungen). Auf dem ISP-Nummer 2 Medium und VDYA (V8 juice-dextrose-yeast extract agar) bildet sich ein tiefrotes Mycelpigment. Auf den ISP-Nr. 1, 6 und 7 Medien bildet sich kein melanoides Pigment. Die Kolonie auf ISP-

2Q Nr. 2 Medium ist sehr hoch, steif und gefaltet.

Physiologische Charakteristika

Bei 28°C und 37°C ist das Wachstum am größten. Bei 7°C und 45°C findet kein Wachstum statt. Ein Wachstum findet somit zwischen 15°C und 43°G statt. Aus L-3,4-Dihydroxy-phenylalanin (L-DOPA) wird kein Melanin gebildet. Der Stamm J907-21 verträgt die Anwesenheit von Natriumchlorid in einer Konzentration von 4 % oder weni-OQ ger, jedoch nicht in einer Konzentration von 5 %. Er ist ferner empfindlich gegenüber Lysozym.

Der Stamm J907-21 verwertet fast alle Pentosen und Hexosen. Die physiologischen Charakteristika und die Verwertung von Kohlenhydraten sind in den Tabellen 2 und 3

Aminosäuren in der Zellwand und Zuckerbestandteile

in der gesamten Zelle

Die Zusammensetzung der Aminosäuren in der Zellwand wurde untersucht nach den Verfahren, die beschrieben sind von Becker et al. in Appl. Microbiol. 13: 236-243 (1965) und von Yamaguchi in J. Bacteriol. 89: 444-453 (1965).

Die Zusammensetzung wurde ferner mit Hilfe einer Aminosäureanalysiervorrichtung (Hitachi 0342U-Modell) bestimmt. Die Zuckerbestandteile des Hydrolysats der gesamten Zelle wurden nach den Verfahren identifiziert, die beschrieben sind von Lechevalier und Lechevalier in Chemical Methods

Jg As Criteria For The Separation Of Nocardiae From Other Actinomycetes, Biology Of The Actinomycetes And Related Organisms 11: 78-92 (1976). Die Zellwand vom Stamm J907-21 enthält meso-Diaminopimelinsäure und geringe Mengen Glycin. In dem Hydrolysat der gesamten Zelle sind Glykose, Mannose, Madurose und Ribose vorhanden. Aufgrund der oben aufgeführten Zusammensetzung der Zellwand und der Zuckerbestandteile der gesamten Zelle gehört der Stamm J907-21 zu dem Zellwandtyp IH₁₃.

Taxonomie

Der Stamm J907-21 ist ein mesophiler, gram-positiver Actinomycetesstamm, der gelegentlich rudimentäre kurze

OQ Luftmycele ausbildet, jedoch nicht die Fähigkeit besitzt, ein wirkliches Luftmycel, einen sporentragenden Körper und Sporen zu bilden. Der Stamm J907-21 hat eine Zellwand vom Typ ΙΙΙ_β· Bekannte Actinomycetesstämme mit der Zellwand vom Typ IHg sind beispielsweise die Genera

og Actinomadura, Microbispora, Streptosporangium, Spirillospora, Planomonospora, Planobispora und Dermatophilus.

-3 ■

Das vegetative Mycel vom Genus Dermatophilus, das von seiner Art her ein obligater Krankheitserreger für Tiere ist, besitzt sowohl quer- als auch längsverlaufende Septa. Der Stamm J907-21 unterscheidet sich somit deutlich von dem Genus Dermatophilus. Die übrigen sechs Genera sind dadurch charakterisiert, daß sie auf dem Luftmycel Sporenträger (Sporangium) oder Arthrosporen tragen. Es wurde berichtet, daß viele Stämme dieser sechs Genera im Gegensatz zu den Streptomycesspezien bei der Sporulation mehr oder weniger wählerisch sind. Der Stamm J907-21 gehört daher wahrscheinlich zu einem der oben genannten sechs Genera. Es wurde berichtet, daß der Genus Actinomadura,

Ig der zu den genannten sechs Genera gehört, an vielen Stellen in der Welt im Erdreich gefunden werden kann. Gordon beschreibt im J. Gen. Microbiol. 109: 69-78 (1978) die physiologische Charakterisierung von 14 Taxonomien von Nocardiae induzierenden Actinomadura madurae.'Auf Basis

2Q der physiologischen Untersuchungen von Gordon wurde der Stamm J907-21 mit A. madurae (Tabelle 4) verglichen. Der Stamm J907-21 ist mit Actinomadura madurae (Ähnlichkeit von 85»7 %) mehr verwandt als mit den anderen mit den Zelltypen III_C und IV (Ähnlichkeit: 54,8 % bis 76,9 %)..

«ε Jedoch wurden die physiologischen Verwandtschaften unter den sechs Genera vom Zellwandtyp IHg nicht untersucht, da sie sich morphologisch klar voneinander unterscheiden. Der Stamm J907-21 kann somit nur als nicht sporenbildender nicht-Streptomycesstamm klassifiziert werden.

M/25

Tabelle 1

Charakteristika* der Kultur des Stammes Nr. J907-21

Trypton-Hefeextraktbrühe (ISP Nr. 1) G**: schwach; flockig, hellgelb

Pellets D : kein

Sucrose-Nitratagar (Szapek's agar) G : schwach R : gelblich-weiß (92)*** bis

hell-olivbraun (94) A : kein D : kein

Glucose-Asparaginagar G : schwach R : gelblich-weiß (92) bis

mäßig olivbraun (95) A : kein D : kein

Glycerin-Asparaginagar (ISP Nr. 5)

Anorganische Salze-Stärkeagar (ISP Nr. 4) G : schwach

R : hell-gräulich gelblichbraun (79) bis dunkelgräulich gelblich -braun (81)

A : kein D : mäßig gelblich braun (77)

G : schwach R : gräulich gelblich braun (80)

A : kein oder sehr kärglich; falls gebildet, rudimentär, gelblich-weiß (92)

D : dunkel-gräulich gelblichbraun (81)

M/25 .44-

Tabelle 1 - Fortsetzung

Tyrosinagar (ISP Nr. 7)

Nähragar

Hefeextrakt-Malzextrakt agar (ISP Nr. 2)

G	: mäßig
R	: gräulich-gelb (90) bis dunkel
	gelblich-braun (75)
A	: kein
D	: kein
G	: schwach
R	: dunkelgelb (85) bis dunkel-oliv
	braun (96)
A	: kein
D	: kein
G	: mäßig
R	: dunkel-qräulichqelb (91) bis

Hafermehl agar (ISP Nr. 3)

Bennett's Agar

dunkel-olivbraun (96)

A : kein oder sehr kärglich; falls gebildet» rudimentär, hell-gräulich gelblich-braun (79)

D : dunkel-gelblichbraun

G	A	: mäßig
R		: gelblich-weiß (92) bis gräulich
		gelb (90)
A	D	: kein
D	: kein
G	: mäßig
R	: dunkel-gräulichgelb (91) bis
	dunkel-olivbraun (96)
: kein oder sehr kärglich;
falls gebildet, rudimentär,
gelblich weiß (92)
: dunkelgelb (85)

M/25

ys

Fortsetzung Tabelle 1

Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar (ISP Nr. 6)

VDYA- Agar (Papavizas, 1964)

Maismehl-Agar (Riker & Riker, 1936)

C-2- Agar (Nonomura, 1971) G : mäßig

R : hell-olivbraun (94) bis dunkelgelblichbraun (75) A : kein D : brilliant orangegelb (67)

G : üppig R : strahlend dunkelrot (14) bis

schwärzlich rot (21) A : kein D : dunkelrot (16)

G : üppig R : dunkel-gelblichbraun (75) bis

dunkel-gelblichbraun (78) A : kein D : stark-braun (55)

G : schwach R : hell-gelblichbraun (76) bis

dunkel-gelblichbraun (75) A : kein oder sehr kärglich; falls

gebildet, rudimentär, weiß (263) D : kein

Kartoffel-Karotten-Agar (Cross et al., 1963) G : schwach bis mäßig R : gräulich-gelb (90) bis dunkel·

gelblichbraun (78) A : kein D : dunkel-gelblichrosa (30)

- ίο -

Fortsetzung Tabelle 1

Kolonie auf ISP Nr. 2 Medium: gutes Wachstum, extrem erhöht,

hart und gefaltet; 3-5 mm Durchmesser, rötlichschwarze(24) Oberflächenfarbe, keine oder nur rudimentäre Bildung eines Luftmycels

* beobachtet nach einer 3-wöchigen Inkubation bei 28°C

** Abkürzungen: G = Wachstum; R = rückseitige Farbe;

A = Luftmycel; D = diffusionsfähiges Pigment *** Die angegebene Farbe und in Klammern aufgeführte Nummer !₅ entsprechen dem Farbstandard in

"Kelly, K.L. & D.B. Judd: ISCC-NBS color-name charts illustrated with Centroid Colors. U.S. Dept. of Comm. Cir. 553, Washington, D.C, Nov., 1975 "

M/25

Tabelle 2 Physiologische Charakteristika des Stammes Nr. J907-21

Test

Ergebnis Eingesetztes Verfahren oder Medium

Temperaturbereich für Maximales Wachstum Bennett's Agar

das Wachstum

Gelatineverflüssigung

Stärkehydrolyse

bei 28°C bis 37⁰C. Wachstumsbereich von 15°C bis 43°C. Kein Wachstum bei 7°C und 45°C.
Verflüssigt

Hydrolysiert 1 % Malzextrakt, 0,4 % Hefeextrakt, 0,4 % Glukose, 20 % Gelatine

Stärkeagar-Platte

Reaktionen in Magermilch

Bildung eines melanoiden Pigments

Reaktion auf Tyrosinase

Nicht koaguliert und vollständig peptonisiert

Negativ Difco-Magermilch

Negativ Tyrosinagar, Peptonhefeextrakt-Eisenagar und Trypton-Hefeextraktbrühe

Verfahren nach Arai *

Reduktion von Nitrat Negativ

pH-Toleranz

Wachstum bei pH 5,0-

11,0

Kein Wachstum bei

pH 4,5 0,5 % Hefeextrakt 1 % Glukose, 0,5 % KNO₃, 0,1 % CaCO₃

Hefeextrakt-Malzextraktagar

Fortsetzung Tabelle 2

Toleranz gegenüber Wachstum bei 4 % NaCl Basalmedium: 1 % Hefe-

5 NaCl oder weniger. extrakt, 2 % lösliche

Kein Wachstum bei Stärke, 1,5 % Agar 5 % NaCl.

Lysozymtoieranz Empfindlich. Trypticase Soyabrühe

Kein Wachstum bei + 1,5 % Agar 0,001 % Lysozym

* Arai, T. and Y. Mikami: Chromogenicity of Streptomyces. Appl. Microbiol. 23: 402-406, 1972.

Tabelle 3 20

Verwertung von Kohlenhydraten durch den Stamm Nr. J907-21

Glycerin +

_.. d-(-)-Arabinose +

l(+)-Arabinose +

d-Xylose +

d-Ribose +

1-Rhamnose +

d-Glukose +

d-Galaktose +

d-Fruktose +

d-Mannose + l(-)-Sorbose

Sucrose
35

Laktose

Fortsetzung Tabelle

Cellobiose +

Melibiose

Trehalose +

Raffinose

d(+)-Mele.citose
!O lösliche Stärke +

Zellulose

Dulcit

Inosit +

d-Mannit +

jg d-Sorbit

Salizin +

Beobachtet nach 3-wöchiger Inkubation bei 37°C.

2Q Basalmedium: Pridham-Gottlieb: anorganisches Medium

Abkürzungen: +: Positive Verwertung -: Negative Verwertung.

Tabelle 4 Vergleich der diagnostischen physiologischen Eigenschaften von

,. Stamm J907-21 und Actinomadura madurae

Actinomadura* Stamm J907-21 madurae (47)**

Zersetzung von:

Adenin +

Kasein + +

Hypoxanthin + +

Tyrosin + +

Harnstoff
Xanthin

Resistenz gegenüber:
Lysozym
Rifampin + ν

Hydrolyse von:

Aesculin + +

Hippurat +

Stärke + +

Säure aus

Arabinose + +

Cellobiose + +

Glukose + +

Glycerin + +

τ·*

Inosit + ν

Laktose - ν

Mannit + +

Mannose + +

MeI eci tose
35

Melibiose

Fortsetzung Tabelle 4

Raffinose

Rhamnose + +

Sorbit

Trehalose + +

Xylose + +

Verwertung von:
IQ Benzoat

Zitrat - ν

Schleimsäuresalz

Succinat + ν

Tartrat
₁g Nitrit aus Nitrat - +

Überleben bei 50⁰C,

+: positiv, -: negativ, v: 15 bis 84 % der Stämme positiv

* Daten von Gordon et al. ** Nr. der untersuchten Stämme

Wie auch bei anderen Organismen können die Charakteristik^ des Stammes J9O7-21 verändert werden. So kann man beispielsweise künstliche Varianten und Mutanten des Stammes J907-21 durch Behandlung mit verschiedenen bekannten Mutagenen erhalten. Dazu zählen beispielsweise UV-Strahlen, Röntgenstrahlen, Wellen hoher Frequenz, radioaktive Strahlen und Chemikalien. Erfindungsgemäß werden alle

Q natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten (im folgenden als Mutanten bezeichnet) des Stammes J907-21, die das Antibiotikum BBM-2478 produzieren, umfaßt.

Herstellung der Antibiotika

Die erfindungsgemäßen Antibiotika BBM-2478 kann man herstellen, indem man den Stamm J907-21 (ATCC 39417) oder 2Q einen BBM-2478-produzierenden Mutanten davon bei submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert. Den produzierenden Organismus läßt man in einem Nährmedium wachsen, das assimilierbare Kohlenstoffquellen enthält, beispielsweise assimilierbare Kohlenhydrate. Als Beispiele geeigneter Kohlenstoffquellen kann man nennen: Glycerin, Arabinose, Xylose, Glukose, Fruktose, Mannose, lösliche Stärke, Mannit und Zellobiose. Das Nährmedium sollte auch eine assimilierbare Stickstoffquelle enthalten, beispielsweise Fischmehl, Soyabohnen-OQ mehl, Maisquellwasser, Peptone, Fleischextrakt, Erdnußmehl, Hefeextrakt oder Ammoniumsalze. Falls erforderlich, können auch anorganische Salze, beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Phosphat usw. hinzugegeben werden. Spurenelemente, beige spielsweise Kupfer, Mangan, Eisen, Zink usw. können gewünscht enf alls zu dem Medium gegeben werden. Sie können

jedoch auch in Form v.on Verunreinigungen der anderen Bestandteile der Medien zugegeben werden. Als Inkubationstemperatur wählt man jede Temperatur, bei der der produzierende Stamm wachsen kann, z.B. von 15°C bis 43°C. Vorzugsweise führt man die Fermentation bei 25 bis 35°C, insbesondere bevorzugt bei 27 bis 32°C durch. Ein neutraler oder fast neutraler pH des Mediums ist bevorzugt. Man kultiviert im allgemeinen etwa 6 bis 10 Tage. Eine optimale Produktion erreicht man gewöhnlich in etwa 6 bis 7 Tagen. Zur Herstellung verhältnismäßig geringer Mengen kann man Schüttelflaschen- und Oberflächenkulturen einsetzen. Für die Herstellung größerer Mengen verwendet

!5 man vorzugsweise eine submerse aerobe Kultur in sterilen Tanks. Führt man eine Tankfermentation durch, dann ist es wünschenswert, ein vegetatives Inocolum in einer Nährbrühe herzustellen, indem man die Kulturbrühe mit einer Spore des Organismus animpft. Hat man ein junges aktives vegetatives Inocolum erhalten, dann überführt man das Inoculum aseptisch in das Medium des Fermentationstanks. Die Tanks und Flaschen kann man dadurch belüften, daß man sterile Luft durch oder auf die Oberfläche des Fermentationsmediums leitet. Man kann außerdem durch einen mechanischen Rührer rühren. Man kann auch Antischaummittel, beispielsweise Specköl zugeben, falls dies erforderlich ist.

Die Produktion von BBM-2478 in dem Fermentationsmedium OQ kann man während der Fermentation bequem durch einen Papierscheiben-Agardiffusionsassay unter Verwendung von Micrococcus luteus PCI 1001 als Testorganismus verfolgen.

Isolierung der BBM-2478 Antibiotika

Nachdem man eine optimal wirksame Brühe erhalten hat, trennt man das Mycel und ungelöste Bestandteile nach üblichen Verfahren, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, von der Fermentationsbrühe ab. Die Antibiotika in dem Mycelkuchen kann man dadurch gewinnen, daß man die Mycelkuchen mit Methanol extrahiert, unlösliche Bestandteile abfiltriert und den Methanolextrakt zu einer wäßrigen Lösung konzentriert. Die aktiven Bestandteile in der überstehenden Brühe kann man gewinnen, indem man mit n-Butanol extrahiert und den Butanolextrakt

15 zu einer wäßrigen Lösung konzentriert. Die wäßrigen,

die BBM-2478A und B Antibiotika enthaltenden Methanol- und Butanolextrakte kann man dann nach üblichen chromatographischen Verfahren reinigen, wobei man gereinigtes BBM-2478A und B erhält. Ein bevorzugtes Reinigungsver-

20 fahren ist im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben.

Physiko-chemische Eigenschaften der BBM-2478 Antibiotika

Man erhält BBM-2478 A und B als gelblich-bis orangegefärbte kristalline Feststoffe. Die beiden BBM-2478-Bestandteile kann man dünnschichtchromatographisch (TLC) wie in der Tabelle 5 gezeigt, von Chartreusin unterscheiden. BBM-2478A löst sich leicht in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Dioxan und saurem Wasser. In Methanol, Ethanol und Chloroform ist es wenig löslich und in den anderen organischen Lösungsmitteln unlöslich. Die Löslichkeit von BBM-2478B ähnelt der von BBM-2478A. BBM-2478B ist jedoch in saurem Wasser unlöslich. BBM-2478 A und B geben mit Eisen-III Chlorid und Anthronreagentien positive Ergebnisse. 2478A ist im Ninhydrintest positiv,

M/25 193

32-

während BBM-2478B in diesem Test negativ ist. Tollen's und Sakaguchi-Tests sind mit beiden Bestandteilen negativ. Die physico-chemischen Eigenschaften von BBM-2478A und 2478B sind in der Tabelle 6 zusammengefaßt. Die UV-Spektren der beiden Bestandteile ähneln einander, wobei in neutralen und sauren Lösungen Maxima bei 236, 266, 398 und 422 nm und in alkalischer Lösung Maxima bei 240, 268 und 435 nm beobachtet werden. Diese Spektren ahnein dem von Chartreusin stark, die IR-Spektren von BBM-2478 A und B sind jeweils in den Figuren 1 und 2 wiedergegeben. Die ¹H-NMR und ¹³C-NMR-Spekt:
den Figuren 3 und 4 gezeigt.

15 20 25

Die ¹H-NMR und ¹³C-NMR-Spektren von BBM-2478A sind in

Tabelle 5 Dünnschichtchromatographie von BBM-2478 A und B

und Chartreusin

SiO₂
CHCl₃-MeOH (7:3)

SiO₂ EtOAc-MeOH (1:1)

BBM-2478A	Rf	0,37	0,16
BBM-2478B		0,78	0,57
Chartreusin		0,65	0,48

30 35

Tabelle 6 Physiko-chemische Eigenschaften von BBM-2478 A und B

BBM-2478 A BBM-2478 B

Gelbes amorphes Pulver Gelbes amorphes Aussehen Pulver

Fp. 225 - 226°C 271 - 272°C (Zers.)

[a] Hj⁶ (c 0,5; Pyridin +124° -8°

UV X^Me0H max 15

20

Analyse

25

(E - )	236	(590)
1 cm	266	(550)
	333	(100)
	378	(132)
	398	(205)
	422	(225)
Gefunden:	C	59,28
	H	5,40
	N	2,06
Berechnet für:	^C33	H₃₅NO₁₃-H₂O
	C	59,01
	H	5,55
	N	2,09

30

236	(740)
266	(700)
333	(118)
378	(169)
398	(255)
422	(290)
C	63,07
H	4,51
^C26^H	22°10
C	63,16
H	4,48

35

M/25 193

Strukturuntersuchungen mit den BBM-2478 Antibiotika

Die C-NMR-Spektren von BBM-2478A zeigen die Anwesenheit von 33 Kohlenstoffatomen an, darunter

vier C-CH-, eine -OCH», neun j:CH-, eine ^C_v , fünf -CH = und 13 ^C= Gruppen. Aufgrund dieser C-NMR-Spektraldaten und der mikroanalytischen Daten von BBM-2478A wurde die Summenformel ^33^35^^13 abgeleitet. BBM-2478A wurde eine Stunde mit 0,4 N methanolischer Chlorwasserstoffsäure am Rückfluß erhitzt. Ausgefallene gelbe Kristalle wurden filtriert und das Filtrat wurde im Vakuum zu einem Sirup eingeengt, der Ninhydrin-positive Zuckerfragmente enthält. Es wurde festgestellt, daß es sich bei dem kristallinen Material um Chartarin, d.h. dem Aglykon von Chartreusin handelt. Dies wurde aufgrund vergleichender Spektralanalysen mit einer authentischen Probe festgestellt.

Chartarin

OH

Das in dem wäßrigen Konzentrat enthaltene Zuckerfragment war .die anomere Mischung eines Disaccharide (Verbindung I), die chromatographisch auf Amberlite CG-50 (NH,⁺ Form) in etwa gleichen Mengen α und β Methylglykoside (Ia und Ib) aufgetrennt wurde. Aufgrund des Massen-

spektrums (M⁺+l:l:m/z 352) und der C-NMR-Daten wurde den Verbindungen Ia und Ib die Summenformel ^ci5^H2q^noh zugeordnet. Die physiko-chemischen Eigenschaften sind in Tabelle 7 aufgeführt. Die Verbindungen la und Ib konnten nicht weiter hydrolysiert werden und verursachten bei sauren Bedingungen eine solche Zersetzung der erhaltenen Zuckerfragmente, daß die Glykosidbindung gespalten wurde. Eine Mischung der Verbindungen Ia und Ib (370 mg) wurde in Methanol zu einem mono-N-Acetylderivat(460 mg, M^T+l:m/z 394) acyliert, welches mit 4,5N methanolischer Chlorwasserstoff säure hydrolysiert wurde. Das Produkt wurde an einer Silikagelsäure chromatographiert, wobei die untere Phase CHCl₃-MeOH-CNH₄OH (6:1:1) war. Es wurden die α- und Jg ß-Anomere eines N-Acetylamino-Zuckers (Verbindung N-Ac-IIa, 140 mg und N-AC-IIb, 22 mg) und ein neutraler Zucker (Verbindung IHa, 85 mg und IHb, 79 mg) erhalten. Nach Behandlung mit gesättigter Ba(0H)₂-Lösung wurde N-AC-IIa quantitativ in die freie Aminoform (Verbindung Ha) überführt. Die physiko-chemischen Daten von Ha, IHa und IHb sind in der Tabelle 8 zusammengefaßt. Das NMR-Spektrum der Verbindung Ha zeigte, daß es sich um Methyl-2-amino-2,o-dideoxy-S-O-methyl-a-D-galactopyranosid handelte. Wie in der Tabelle 8 gezeigt, zeigt das NMR-Spektrum Ha neben zwei Signalen für OCH₃ und einem Signal für C-CH₃ die Signale von 5 Ringprotonen. Eine Analyse erster Ordnung der Ringprotone ergibt die folgenden Kopplungskonstanten: J.__ = 3,8, ^-3⁼ ^⁰»⁵» ^J3 _a ⁼ 3,0, JA₅ IjO und J_5-6 = 6,4 Hz. Diese Ergebnisse stimmen mit der zugeordneten Struktur überein. Auch die physiko-chemischen Daten für die Ν,Ο-DiacetylverbindungIIa (Fp. 163 bis 164°C und ta]*³ : +154° (c 0,3; CHCL₃)) entsprechen denen, die von M.B. Perry in Can. J. Chem. 52: 3251-3255 (1974) für Methyl-2-acetamido-4-0-acetyl-2,6-dideoxy-S-O-methyl-a-D-galactopyranosid berichtet werden.

Ha: R^ ■ ^0CH3' ^R2 " ^H Hb: « H, - OCH₃

^Rl

Das H-NMR-Spektrum der Verbindung IHa zeigt die folgenden Kopplungskonstanten:

J. _ = 4,5, J* c <l,0 und J- ,= 6,7 Hz, während das NMR-Spektrum der Verbindung IHb die folgenden Kopplungskonstanten zeigt:

^Jl-2 ^{= 7}'⁸' ^J4-5 ^¹'^{0 und J}5-6 ^{= 6>5 Hz}· ^{In belden} Spek-r tren war kein Ringproton an C₃ zu sehen. Aufgrund der Spektralanalysen handelt es sich bei den Verbindungen IHa und IHb um das α- bzw. ß-Methylglykosid von 6-Deoxy-3-C-methylgulopyranosid (Methylvirenosid) oder von o-Deoxy-S-C-methylgalactopyranosid. Das Dünnschichtchromatogramm und das NMR-Spektrum einer autentischen Probe von Methyl-ß-D-virenosid unterschied sich von denen der Verbindung IHb. Die Signale für H₁ und H₅ von Methylvirenosid wurden nämlich bei wesentlich niedrigerem Feld beobachtet als die der Verbindung IHb. Dies deutet darauf hin, daß sich die C₃~OH-Gruppe von Methylvirenosid axial angeordnet ist, während die entsprechende Gruppe der Verbindung IHb equatorial angeordnet ist. Auf Basis der Werte für die optische Drehung für die Verbindungen IHa und IHb und der für die Verbindung IHa (-1309°) beobachteten Δ [M] Werte wurde der Verbindung III eine D-Konfiguration zugeordnet. Bei den Verbindungen IHa und HIb handelt es sich somit um Methyl-6-deoxy-3-C-methyl-a- und ß-D-Galactopyranosid.

ν* 27-

Ilia: R,

IIIb:

OCH

₃,

H OCH.

Die Bindung der beiden Zuckermoleküle wurde durch Hassenspektren der Verbindungen Ia und Ib und deren Acetate bestimmt. Es wurden Ionenfragmente beobachtet, die einer Sequenz II-*III des Disaccharide zugeordnet werden können.

Das 200 MHz HNMR-Spektrum und mit der N,O-Triacetyl Verbindung Ia durchgeführte Entkupplungsexperimente ergaben, daß das Zuckermolekül II über eine a-Glykosidbindung an die C_-OH-Gruppe der Verbindung III gebunden ist.

Die Verbindungen Ia und Ib besitzen somit die nachstehend wiedergegebenen Strukturen:

Ia: R, = OCH-,

35

M/25 193

Die bei verschiedenen pH-Werten aufgenommenen UV-Spektren von BBM-2478A sind denen von Chartreusin sehr ähnlich. Dies deutet darauf hin, daß die Disaccharideinheit von BBM-2A78A über dieselbe Hydroxylgruppe wie beim Chartreusin an Chartarin gebunden ist. Die IR-Spektren von BBM-2478A und Chartreusin in Chloroform ergaben dasselbe Muster für die Carbonylabsorption, was obige Zuordnung unterstützt. Im NMR-Spektrum von N-Acetyl-BBM-2478A ergab das anomere Proton der Verbindung III ein Dublett mit einem Abstand von J = 8,0 Hz. Daraufhin wurde dem Antibiotikum die ß-Pyranosidkonformation der Verbindung
III zugeordnet.

Aufgrund von Mikroanalysen wurde BBM-2478B die Bruttoformel ^C26^H22°10 ^zu8^eordnet· Nach milder, saurer
Methanolyse ergab BBM-2478B Chartarin und neutrale Zucker (lila und IHb), die mit denen identisch sind, die von BBM-2478A erhalten wurden. Bei BBM-2478B handelt es sich somit offensichtlich um das Analogon von BBM-2478A, jedoch ohne die Aminozuckereinheit (II). BBM-2478A und B besitzen somit die folgenden Strukturen:

HO-

BBM-2478A

CH₃O

M/25

- 3L9-

HO

BBM-2478B

>B

15 20 25 30 35

M/25

Tabelle 7 Physiko-chemische Eigenschaften der Verbindungen

Ia und Ib

Verbindung Ia

10

Aussehen

Fp.

15

[a]_D (c 1,0, H₂O)

TLC n-Bu0H-Ac0H-H₂0 (63:10:27)

Bruttoformel

Massenspektrum (m/z)

20

25

H-NMR (60 MHz in in ppm

Weißes Pulver	82°C	)	d)
79 -	1°		d)
+21	,19		s)
Rf O	29^N08		d-d)
^C15^H	(m⁺+i:	s)
352		s)
319
235
160	(3H,
1,25	(3H,
1,28	(3H,
1,37	(1H,
3,03	(3H,
3,41	(3H,
3,46

3,6 - 4,5 (6H, m)

Verbindung Ib	- 83	0,15	⁰C
Weißes Pulver	+116°	₂₉N0
80		(M⁺+
^C15^H		8
352		1)
319
235	(3H
160	(3H
1,23	(3H	, d)
1,26	(1H	, d)
1,29	(3H	, s)
3,07	(3H	, d-d)
3,44	3,4-4,4
3,54	, s)
(6H, m)

4,90 (1H,d,J=4,3 Hz) 4,50 (1H,d,J=8,0

Hz)

4,98 (1H,d,J=3,5 Hz) 5,09 (1H,d,J=3,5

Hz)

Tabelle 8 Physiko-chemische Eigenschaften der Verbindungen Ha, IHa und IHb

Aussehen

Ha

Hellgelber Sirup +106° (c 0,2-,MeOH)

IHa

Hellgelber Sirup

IHb

Hellgelber Sirup

+152° (c 0,5; CHCl₃) -33° (c 0,5; CHCl₃)

TLC : Rf	^C8 1.	H₁₇ 26	0,67	-.4)*	0	,35	1,27	0,32	6,	5)	6, 7,	8)
CHCl₃-MeOH-NH₄OH	2,	97		,3,8610,5)			1,28			1H)
(2:1:1)	3,	41					3,45			7,	5) 8)
Untere Phase	3,	43					3,52			(s, 3H)
n-BuOH-AcOH-H₂O	3,	45	0,20	,3,0 10,5)	0	,47	3,60	0,40		(q,1H, (d,1H,
(63:10:27)	4, 4,	00 02	NO₄ (d,3H,6	,4) H,3,0)	CgH₁ 1,27	(d,3H,6,7)	4,00 4,39	(s,3H)
Bruttoformel ¹H-NMR,60 MHz. in			(d-d,1H		1,34	(s,3H)		(d,3H,
DpO;δ i η ppm		(s,3H)	3,38	(s,3H)	(br-s,
		(s,3H)	3,48	(br-s,1H)	(d,1H,
		(d-d,1H	3,83	(d,1H,4,5)
		(q.1H,6 (br-d,1	4,18 4,75	(q,1H,6,7) (d,1H,4,5)

4,72 (d,1H,3,8) * (Multiplizifät, Proton, J in Hz)

Biologische Eigenschaften

Die minimale Hemmkonzentration (minimale inhibierende Konzentration (MIC) von BBM-2478 wurde im Vergleich zu Chartreusin gegenüber verschiedenen gram-positiven und gram-negativen Bakterien und Pilzen sowie einigen anaeroben Organismen gemäß der Serien-zweifach-Agar-Ver-

IQ dUnnungsmethode bestimmt. Ein Nähr-Agar-Medium wurde für gram-positive und gram-negative Bakterien eingesetzt. Für anaerobe Organismen wurde GAM Agar-Medium und für Pilze Sabouraud-Agar-Medium eingesetzt. Wie aus der Tabelle 9 ersichtlich, sind BBM-2478A, B und Chartreusin

jg in ähnlicher Weise antibakteriell wirksam gegen grampositive Bakterien und anaerobe Organismen, während sie gegenüber gram-negativen Bakterien und Pilzen inaktiv sind. Die Wirksamkeit von BBM-2478A gegen Staphylokokken war zwei bis vier Mal größer als die Wirkung von

20 BBM-2478B oder Chartreusin.

M/25

Tabelle 9 Antibakterielle Aktivität von BBM-2478 A und B Testorganismus

S taphylococcus aureus 209P Staphylococcas aureus Smith Bacillus subtills PCI Microcoecos luteus PCI 1001 Mlcrococcu« flavu» D12 Escherichia coll KIHJ Kleb«lella pneuntoniae DIl Pseudoinona» aeruginosa D15

Candida albicans IAM 4888 Crvptococcus neofomans D49 Aspergillus fumiqatus IAH 2530 Trichophyton roentagrophytes D155

Bacteroides fragilis Clostridimn difficile Clotridimn perfrinqens PropionibacteriiMB acnes

MIC	(meg/ml)	Chartreusin
BBM-2478A	BBM-247BB	3.1
1.6	3.1	6.3
0.8	6.3	0.4
0.8	0.8	0.8
0.8	3.1	• 0.4
0.8	1.6	>100
100	>100	>100
100	>100	>100
100	>100	>100
MOO	>100	>100
>100	>100	>100
>100	>100	>100
>100	>100	6.3
12.5		25
12.5		1.6
6.3		3.1
6.3

- J¹T -

Die Antitumoraktivitat von BBM-2478A wurde im Vergleich zu Chartreusin an Mäusen bestimmt. Diese Wirkung wurde gegen Lymphozyten-Leukämie P388, lymphoide Leukämie L1210 und melanotisches Melanom B16 getestet. Dazu wurden BDF. Mäusen Tumore mit Inoculumgrößen von 10 , 10 und 10 Zellen pro Maus intraperitoneal implantiert. Die Testverbindungen wurden in 0,9 %iger Kochsalzlösung gelöst, welche 10 % Dimethylsulfoxid enthält. Abgestufte Dosen des Antibiotikums wurden 24 Stunden nach der Tumorimplantation intraperitoneal verabreicht. Die Dosen wurden einmal täglich neun Tage lang (qd l*->9) verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabellen 10, 11 und 12 gezeigt.

BBM-2478A war in etwa 10 bis 30 Mal wirksamer als Chartreusin in bezug auf die minimal wirksame Dosis. Die mit BBM-2478A erzielten T/C-Werte waren bei allen getesteten Tumoren größer als die von Chartreusin. Es wurde ferner gefunden, daß BBM-2478B keine Antitumor-

2Q Wirksamkeit besitzt. Die akute Toxizität von BBM-2478A wurde durch eine einzelne intraperitoneale Verabreichung an Mäuse (ddY Stamm) bestimmt. Die LD₅₀ betrug 38 mg/kg.

CO CO IiO Ct O cn	Dosis,ip	fcO O	T/G	cn ο	10	cn	Tag 45	SS
	(mg/kg/Tag*)		(%)		auf P388 Leukämie		0/5	Ul
	BBM-2478A 3	Tabelle	222**			0/6	l·-¹ VD
Wirkung	1	von BBM-2478	239**	Durchschnittliche		0/6	U)
	0,3		189**	Gewichtsänderung am		0/6
	0,1		161**	Tag 5 (g)		0/6
0,03	MST	111	-1,0	Überlebende am	0/6
0,01	(Tage)	111	+ 0,8	Tag 5	0/6
Chartreusin 10	20,0	217**	+ 1,8	5/5	0/6
3	21,5	167**	+ 1,2	6/6	0/6
1	17,0	156**	+ 2,3	6/6	0/6
0,3	14,5	117	+ 2,0	6/6	0/6
0,1	10,0	100	+ 1,3	6/6
	10,0	+ 1,5	6/6
	19,5	+ 1,3	6/6
	15,0	+ 2,0	6/6
14,0	+ 2,8	6/6
10,5		6/6
9,0		6/6

Träger

9,0

+ 2,4

12/12 0/12

qd 1

** Zeigt signifikante Antituraorwirkung an MST = Mittlere Überlebenszeit

co CJi	ω to O CJi	von	to O	11	0	T/G	M CJi	(g)	1	O	cn	Tag 45
			Tabelle	ΒΒΜ-2478 auf L12	0	(%)		8			0/6
	Wirkung	MST			5	150**	110 Leukämie	3			0/6
				0	138**	Durchschnittliche	6			0/6
	Dosis, ip		(Tage)	0	131**	Gewichtsänderung am	9	Überlebende am	0/6
	(mg/kg/Tag*)	12,	0	100	Tag 5	2	Tag 5	0/6
BBM-2478A	3	11,	5	100	-o,	3	6/6	0/6
	1	10,	0	100	+ 0,	4	6/6	0/6
	0,3	8,	0	144**	+ 1,	9	6/6	0/6
	0,1	8,	0	113	+ 2,	2	6/6	0/6
	0,03	8,	0	113	+ 2,	1	6/6	0/6
	0,01	11,		100	+ 3,	6/6	0/6
Chartreusin	10	9,	100	+ 1,	6/6
	3	9,	+ 1,	6/6
	1	8,	+ 1,	6/6
	0,3	8,	+ 3,	6/6
	0,1	+ 3,	6/6

Träger

* qd—^ 9

8,0

+ 2,8

** Zeigt signifikante Antitumorwirkung an

12/12

0/12

Cu cn	co O	to Oi	to O	cn	12	O	Ol	Tag 45	K
			Tabelle	auf B16 Melanom			0/6	NJ Ul
		Wirkung von	BBM-2478	Durchschnittliche			0/6	193
				Gewichtsänderung am			0/6
	Dosis, ip	MST	T/C	Tag 5 (g)	Überlebende am	0/6
	(mg/kg/Tag	*) (Tage)	(%)	+ 1,5	Tag 5	0/6
BBM-2478A	3	41,5	296**	+ 2,2	6/6	0/6
	1	34,5	246**	+ 2,5	6/6	0/6
	0,3	25,5	182**	+ 2,5	6/6	1/6	%
	0,1	18,5	132**	+ 2,0	6/6	0/6	U
	0,03	16,0	114	+ 1,7	6/6
Chartreusin	10	25,0	179**	+ 2,3	6/6
	3	20,5	146**	+ 2,3	6/6
	1	16,0	114	+ 1,8	6/6
	0,3	14,0	100	6/6

Träger

14,0

* qd—* 9
** Zeigt signifikante Antitumorwirkung an

10/10

0/10

Wie oben gezeigt, besitzen BBM-2478A und B eine starke antibakterielle Wirksamkeit gegen aerobe gram-positive Bakterien und anaerobe Bakterien. Sie sind somit zur therapeutischen Behandlung von Infektionskrankheiten bei Säugetieren (Mensch und Tier) und anderen Tieren nützlich, die durch derartige Bakterien hervorgerufen werden. Diese Verbindungen können außerdem als antibakterielle Wirkstoffe für andere übliche Anwendungs-

jQ zwecke eingesetzt werden. Sie können beispielsweise zum Desinfizieren von medizinischen und zahnmedizinischen Ausrüstungen verwendet werden. Die signifikante Antitumorwirkung von BBM-2478A gegenüber experiementellen Tumoren, getestet an Mäusen, deutet darauf hin, daß BBM-2478A

-,,- auch zur Inhibierung des Wachstums von Tumoren bei Säugetieren therapeutisch nützlich ist.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können somit zur Behandlung von bakteriellen Infektionen verwendet werden.

Dazu verabreicht man eine antibakterielle Dosis von BBM-2478A oder BBM-2478B entweder als solche oder in Form eines pharmazeutischen Mittels an den Wirt. Außerdem kann man die Verbindung BBM-2478A zur Bekämpfung maligner Tumore bei Säugetieren (Mensch und Tier) verwenden.

_nr- Dazu verabreicht man eine wirksame Dosis von BBM-2478A.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein pharmazeutisches Mittel, das eine wirksame antibakterielle Menge an BBM-2478A oder BBM-2478B zusammen mit einem inerten phar_on mazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel

enthält. Dieses Mittel kann in jeder pharmazeutischen, zur parenteralen Verabreichung geeigneten Form vorliegen. Zur parenteralen Verabreichung geeignete pharmazeutische Mittel sind beispielsweise sterile, wäßrige oder nicht-„,_ wäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie können auch in Form steriler, fester fester Mittel vorliegen,

die unmittelbar vor der Verwendung in sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder irgendeinem anderen sterilen injizierbaren Medium gelöst werden.

Es versteht sich, das die vorzugsweise zu verabreichenden Mengen der BBM-2478-Antibiotika von verschiedenen Faktoren abhängt, z.B. von den eingesetzten Bestandteilen,

^Q der bestimmten Formulierung^der Anwendungsart, dem speziellen Situs, dem Wirt und der zu behandelnden Krankheit. Der Fachmann muß dabei viele Faktoren berücksichtigen, welche die Wirkung eines Arzneimittels beeinflussen. Dazu zählen beispielsweise das Alter, das Körpergewicht,

je das Geschlecht, der Verabreichungszeitpunkt, die Verabreichungsart, die Ausscheidungsgeschwindigkeit, der Zustand des Wirts, die Arzneimittelkombination, die Reaktionsempfindlichkeit und die Schwere der Krankheit. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können kontinuierlich oder

„λ in Abständen verabreicht werden.

Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Dabei sind die Temperaturen in Grad Celcius angegeben, sofern nichts anderes ausgeführt ist. Amberlite 2g CG-50 ist ein Warenzeichen von Rohm & Haas Co, Philadephia, Pa. U.S.A., für ein schwach saures Kationenaustauschharz vom Carbonsäuretyp. Diaion HP-2Ö ist ein Warenzeichen der Mitsubishi Chemical Industries, Japan für ein nicht-ionisches, makroverzweigtes Polymerharz.

Beispiel 1 Fermentation von BBM-2478A und B

Eine gut-gewachsene Schrägkultur des Actynomycetes-Stammes Nr. J907-21 wurde zum Inokulieren eines vegetativen Mediums eingesetzt, das aus 3 % löslicher Stärke, 1 % Bacto-Leber (Difco), 0,5 % Fischmehl, 0,3 % NaCl, 0,1 % (NH₄)₂SO₄ und 0,6 % CaCO₃ bestand, wobei der pH vor der Sterilisierung auf 7,0 eingestellt wurde. Das vegetative Medium wurde 27 Stunden auf einem Drehschüttler (250 UpM) bei 28°C inkubiert. 5 ml der Kultivierung wurden in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben überführt, der 100 ml

jg eines Fermentationsmediums enthielt, das dieselbe Zusammensetzung wie das vegetative Medium besaß. Die Fermentation wurde 7 bis 10 Tage auf einem Drehschüttler bei 28°C durchgeführt. Die antibiotische Aktivität der Fermentationsbrühe wurde mittels der Papierscheiben-Agardiffu-

2Q sionsmethode unter Verwendung von Mikrococcus luteus PCI 1001 als Testorganismus durchgeführt. Nach 6- bis 7-tägiger Fermentation erreichte die antibiotische Produktivität ein Maximum von 150 mcg/ml.

Beispiel

Isolierung und Reinigung von BBM-2478A und B

Die in Beispiel 1 erhaltene Brühe (20 1, pH 6,8) wurde von dem Mycelkuchen und der überstehenden Flüssigkeit mit Hilfe einer Zentrifuge vom Sharpless-Typ (Kokusan Nr. 4A) abgetrennt. Der Mycelkuchen wurde dreimal mit jeweils 5 1 Methanol extrahiert. Nach Abfiltrieren der unlöslichen Bestandteile wurden die methanolischen Extrakte vereinigt und im Vakuum zu einer wäßrigen Lösung eingeengt. Die überstehende Flüssigkeit der Fermentations-

brühe wurde mit 20 1 n-Butanol extrahiert. Der Extrakt wurde im Vakuum zu einer wäßrigen Lösung eingeengt. Die beiden wäßrigen Konzentrate wurden vereinigt und auf eine Diaion HP-20 (Mitsubishi Chem. Industries, Tokyo, φ 5,5 χ 60 cm) gegeben, die nacheinander mit 5 1 Wasser, 5 1 50%igem wäßrigen Methanol und 6 1 80%igem wäßrigen Methanol entwickelt wurde. Die BBM-2478 enthaltenen Frak-

jn tionen wurden mit Hilfe eines Papierscheibenassays unter Verwendung von B. subtilis M45 (Rec ) als Testorganismus überwacht. Die mit 80 % wäßrigem Methanol eluierten aktiven Fraktionen wurden zusammengegeben, bei vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Es wurden so 4,5 g

,,- eines gelben Feststoffs aus dem rohen BBM-2478 Komplex erhalten. Dieser rohe Komplex wurde auf eine Silikagelsäule (0 3,5 χ 55 cm) gegeben, die mit Chloroform vorgewaschen wurde. Die aktiven Bestandteile wurden mit einer Chloroform-Methanolmischung eluiert, wobei die Methanolkonzentration stufenweise erhöht wurde ( 5 - 10 % v/v).

Die ersten, mit 5 % Methanol eluierten aktiven Fraktionen wurden gesammelt, im Vakuum eingeengt und lyophilisiert. Man erhielt so BBM-2478B (72 mg). Die mit 10 % Methanol eluierten, zweiten aktiven Fraktionen wurden in ähnlicher

„c Weise aufgearbeitet. Man erhielt so 2,5 g eines halbreinen Feststoffes von BBM-2478A. Letzterer Feststoff wurde an Silikagel weiter chromatographiert (Flüssigkeitschromatogramm bei mittlerem Druck; Säule: Kiriyama 0 11 χ 500 mm; Pumpe: FMI Lab pump, Druck 80 - 90 psi (5,5-

_n 6,2 bar)). Elution mit Chloroform-Methanol (97:3; v/v) oll

ergab aktive Fraktionen, die nach Einengen im Vakuum einen homogenen Feststoff von BBM-2478A ergaben (1,30 g). Dieser Feststoff wurde aus Methanol kristallisiert und ergab gelblich-orangene Stäbchen von BBM-2478A Monohydrat.

35

111/ka

Claims

M/25 193

Paten tansprflche

fl.l Antibiotikum BBM-2478A der Formel:

10 15 20

CH₃O

25
2. Antibiotikum BBM-2478B der Formel:

30 35

BO
3. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums BBM-2478A gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm J907-21 (ATCC 39417) oder einen BBM-2478A produzierenden Mutanten davon in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff quellen enthält, bei submersen aeroben Bedingungen kultiviert und dann das Antibiotikum BBM-2478A jQ aus dem Kulturmedium gewinnt.
4. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums BBM-2478B gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm J907-21 (ATCC 39417) oder einen BBM-2478B

jg produzierenden Mutanten davon in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, bei submersen aeroben Bedingungen kultiviert und dann das Antibiotikum BBM-2478B aus dem Kulturmedium gewinnt.
5. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend das Antibiotikum

BBM-2478A gemäß Anspruch 1 oder das Antibiotikum BBM-2478B gemäß Anspruch 2 oder eine Mischung davon zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.
6. Verwendung des Antibiotikums BBM-2478A gemäß Anspruch 1 zur Bekämpfung bakterieller Infektionen.

₃₀
7. Verwendung des Antibiotikums BBM-2478B gemäß

Anspruch 2 zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen oder malignen Tumoren.