AT395860B - Verfahren zur herstellung eines neuen antitumor-antibiotikums und seine verwendung - Google Patents

Description

AT 395 860 B

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen zyklischen depsipeptidischen Antitumor-Antibiotikums, das im folgenden als Sandramycin bezeichnet wird. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung dieses Antitumor-Antibiotikums als antimikrobielles Mittel sowie als Antitumormittel in der Veterinärmedizin.

In der US-PS 4 360458 vom 23. November 1982 (Koshiyamaet al.) wird ein antibakteriell wirkender Antitumor-Komplex mit der Bezeichnung BBM-928 sowie seine Herstellung durch Fermentation eines neuen Actino-mycetenstammes mit der Bezeichnung G-455-101 (ATCC 31491) beschrieben, von welchem Stamm später festgestellt wurde, daß es sich um eine neue Art der Gattung Actinomadura mit der Bezeichnung Actinomadura luzonensis nov. sp. handelt (vgl. J. Antibiotics, 33 (10), 1098-1102 (1980)).

Herstellung, Isolierung, Kennzeichnung und Antitumorwirkung der BBM-928-Komponenten werden im J. Antiobiotics, 33(10), 1087-1097 (1980) beschrieben. Die Strukturen von BBM-928 A, B, C und D (die nun Luzopeptin A, B, C bzw. D genannt werden), die die Hauptbestandteile des BBM-928-Komplexes darstellen, sind in der US-PS 4 451456 vom 29. Mai 1984 (Koshiyama et al.) geoffenbart und haben folgende Strukturformeln:

HgC CHj CH, HjC C-OH 0H D C0-NH-CH2-C0-N-CH2-C0-N-CH L CO-lffl-CH-CO-N'^Y'0*! C0 CH2 0 I 4

0 CHi C0 R2oA^N-CO-CH-NH-CO^HV^| l ch-n-co-ch2-n-co-ch2-nh-co D ηο^Λ^-οπη, “II I HO-C CH, CH,

-COCEj

D -COCHjCHj

HjC CH,

Luzopeptin A " B

" C

Die Luzopeptine A, B, C und D enthalten Strukturmerkmale, die die 3-Hydroxy-6-methoxychinaldinsäure als Chromophor und die 4-Hydroxy-2,3,4,5-tetrahydropyridazin-3-carbonsäure enthalten, wobei die strukturellen Unterschiede zwischen diesen drei Verbindungen einzig in dem Ausmaß der Acetylierung der Hydroxylgruppe in den Tetrahydropyridazinresten liegt.

Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung des neuen zyklischen depsipeptidischen Antitumor-Antibiotikums Sandramycin, das die Strukturformel

OCX

C«, CH, CiH W

CH, i * ONH-CH-CO-frN L·, f. o τ r ^ h CH-N“CO-CH,-ljl-CO-CH,NH· 1 CH, CH, ^N-CO-CH-NHOC^fM- ίο höJL besitzt. -2-

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Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Sandramycin-produzierender Stamm von Nocardioides sp. nov. mit den Identifikationsmerkmalen von ATCC 39419 oder eine Mutante desselben unter aeroben Submersbedingungen in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, gezüchtet wird, bis eine deutliche Menge von Sandramycin produziert und in dem Kulturmedium angereichert wird, und daß das Sandramycin gegebenenfalls aus dem Kulturmedium isoliert wird.

Der Sandramycin-produzierende Mikroorganismus Nocardioides sp. Stamm C49009 wurde aus einer in Mexico gewonnenen Bodenprobe isoliert. Dieser Stamm wurde in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland unter der Bezeichnung ATCC 39419 hinterlegt.

Der Mikroorganismus

Im folgenden ist eine allgemeine Beschreibung des bevorzugten, das Antitumor-Antibiotikum Sandramycin produzierenden Mikroorganismus angegeben:

Morphologie:

Der Stamm Nr. C49009bildet sowohl ein Substrat- als auch ein Luftmycel (0,4 pm Breite) und das Substratmycel ist lang, gut verzweigt und nach einer Woche in kurze Filamente oder Stäbchen unterteilt. Der Stamm C49009 neigt dazu, seine Fähigkeit zur Bildung von Luftmycel bei fortdauernder Kultivierung zu verlieren. Die Hyphen des Luftmycels verzweigen sich nur wenig. Bei Beobachtungen unter dem Mikroskop zeigt sich, daß die Lufthyphen zu Beginn mehr oderweniger zick-zack-förmig sind und sich zulangen geraden Ketten arthrosporenartiger zylindrischer Segmente (0,5 x 1 bis ~3 pm) entwickeln, die sich später mit durchscheinenden Hyphen abtrennen. Die Oberfläche der sporenartigen Segmente ist glatt. Der Stamm Nr. C49009 ist grampositiv und nicht säurefest Sporangium, freibewegliche Sporen und Sklerotium werden nicht beobachtet

Zellwandzusammensetzung und Zuckerkomponenten der gesamten Zelle

Die Zellwand des Stammes Nr. C49009 enthält LL-Diaminopimelinsäure und Glycin als charakteristische Aminosäurekomponenten der Zellwand gemäß dem vonB. Becker et al. in Appl. Microbiol., 13,236-243 (1965) und T. Yamaguchi in J. Bacteriol., 89,441-453 (1965) beschriebenen Verfahren. Das Gesamtzellhydrolysat zeigt die Anwesenheit von Glucose, Mannose und Ribose, jedoch fehlen sämtliche diagnostische Zucker, wie sie gemäß dem von Μ. P. Lechevalier et al. in Biol. Actinomycetes Related Organisms, 11,78-92 (1976) angegebenen Verfahren bestimmt werden. Die oben erwähnte Zellwandzusammensetzung und die Gesamtzellzuckerkomponenten deuten darauf hin, daß der Stamm Nr. C49009 eine Actinomycetenart mit Zellwandtype I ist

Kulturmerkmale und physiologische Merkmale

Der Stamm Nr. C49009 ist unbedingt ein aerober Actinomycetenstamm und wächst gut in den meisten beschriebenen Medien. Das Luftmycel bildet sich reichlich oder mäßig auf ISP-Medium Nr. 3,5 und 7 sowie auf Czapeks Sucrose-Nitrat-Agar, bildet sich jedoch spärlich auf nahrungsmäßig angereicherten organischen Medien, wie ISP-Medium Nr. 2und6 oder Bennett-Agar. Die Farbe des Luftmycels istweiß. Melanoideundandere deutliche Pigmente werden bei allen bisher geprüften deskriptiven Medien nicht produziert. Die Farbe der Rückseite des vegetativen Mycels ist nur gelblich. Es zeigt optimales Wachstum bei 28 ®C, mäßiges Wachstum bei 15 °C und 37 °C, doch kein Wachstum bei 5 °C und 45 °C. Gelatine und Stärke werden zersetzt Die Tyrosinase-Reaktion ist negativ. In Gegenwart von 7 % NaCl oder 0,01 % Lysozym wird das Wachstum inhibiert. Die Kulturmeikmale und die physiologischen Eigenschaften des Stamms Nr. C49009 sind in den Tabellen 1 bzw. 2 aufgezeigt Der Stamm Nr. C49009 verbraucht tatsächlich Zucker für sein Wachstum und der Verbrauch der Kohlenstoffquellen ist in Tabelle 3 angegeben.

Taben?!

Kulturmerkmale des Stammes Nr. C49009* **

Trypton-Hefeextraktbriihe W: mäßig; flockig, schwach gelbe Sedimente (ISP Nr. 1) D: keine -3-

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Tabelle l (Fortsetzung) Kulturmerkmale des Stammes Nr, C49009*

Sucrose-Nitrat-Agar (Czapek-Agar)

Glucose-Asparagin-Agar

Glycerin-Asparagin-Agar (ISP Nr. 5) W: reichlich R: gelb-weiß (92)*** bis dunkel graugelb (91) L: mäßig, weiß (263) D: mäßig, gelb (87) W: spärlich R: gelblichweiß (92) bis blaßgelb (89) L: spärlich, weiß (263) D: keines W: mäßig R: hellgelb (86) bis mäßig gelb (87) L: mäßig, weiß (263) D: keine

Anorganische Salze-Stärke-Agar W: (ISP Nr. 4) R: L: D:

Wachstum blaßgelb (89) bis mäßig gelb (87) spärlich; weiß (263) keine

Tyrosin-Agar (ISP Nr. 7) W: reichlich R: blaßgelb (89) bis dunkelgelb (88) L: mäßig, weiß (263) D: keine Nährstoff-Agar W: mäßig R: blaßgelb (89) L: mäßig; weiß (263) D: keine

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP Nr. 2) W: reichlich R; blaßgelb (89) bis mäßig gelb (87) L: spärlich, weiß (263) D: keine

Hafermehl-Agar (ISP Nr. 3) W: mäßig R: gelblichweiß (92) bis mäßig gelb (87) L: mäßig, weiß (263) D; keine

Benett-Agar W: mäßig R: blaßgelb (89) bis dunkelgelb (88) L: dürftig bis spärlich, weiß (263) D: keine

Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar W: (ISP Nr. 6) R: L: D: spärlich schwach orangegelb (73) bis hell orangegelb (79) dürftig, weiß (263) keine 4-

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* Nach dreiwöchiger Inkubation bei 28 °C ** Abkürzung: W = Wachstum; R = Rückseitenfarbe; L = Luftmycel; D = diffundierbares Pigment *** Farbe und Nummer in der Klammer folgen dem Farbstandard in „Kelly, K. L. und D. B. Judd: ISCC-NBS Color-Name Charts, illustriert mit Centroid-Farben. U. S. Dept. of Comm. Cir 553, Washington, D, C., Nov. 1975“.

Tabelle 2

Physiologische Merkmale des Stammes C49009

Test Ergebnis Verwendetes Verfahren oder Medium Temperaturbereich des Wachstums Maximales Wachstum bei 28 °C. Mäßiges Wachstum bei 15 °C und 37 °C. Kein Wachstum bei 5 °C und 45 °C. Benett-Agar Gelatineverflüssigung verflüssigt 1 % Malzextrakt, 0,4 % Hefeextrakt, 0,4 % Glucose, 20 % Gelatine Stärkehydrolyse hydrolysiert Stärke-Agar-Platte Reaktionen in entrahmter Milch koaguliert Difco-entrahmte Milch Bildung von Melanoid-Pigmenten negativ Tyrosin-Agar, Pepton-Hefe-Extrakt-Eisen-Agar und Trypton-Hefe-Extraktbrühe Tyrosinase-Reaktion negativ Methode nach Arai111 Nitrat-Reduktion negativ Czapeks-Sucrose-Nitrat- Brühe Nitrat-Reduktion negativ 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Glucose, 0,5 % KNO3, 0,1 % CaC03 pH-Toleranz Wachstum bei pH 5,0 bis pH 10,5. Kein Wachstum bei pH 4,5. Hefeextrakt-Malzextrakt- Agar NaCl-Toleranz Wachstum bei 5 % NaCl oder weniger. Kein Wachstum bei 7 % NaCl. Grundmedium: 1 % Hefeextrakt, 2 % lösliche Stärke, 1,5 % Agar Lysocym-Toleranz empfindlich, jedoch teilweise resistent (Wachstum einiger Kolonien bei 0,01 % Lysocym) Trypticase-Soja-Brühe plus 1,5 % Agar * Arai, T. und Y. Mikami, „Chromogenicity of Streptomyses“, Appl. Microbiol., 23,402-406 (1972). -5-

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TaWi«?3

KohlehvdratverbrauchdesStammes C49009

Glycerin + D(-)-Arabinose + L(+)-Aiabinose D-Xylose + D-Ribose + L-Rhamnose + D-Glucose + D-Galactose + D-Fractose + D-Mannose + L(-)-Sorbose

Sucrose +

Lactose +

Cellobiose +

Melibiose +

Trehalose +

Raffinose + D(+)-Melezitose + Lösliche Stärke +

Cellulose Dulcit

Inosit + D-Mannit + D-Sorbit Salicin

Beobachtet nach dreiwöchiger Inkubation bei 28 °C. Grundmedium: Anorganisches Medium nach Pridham-Gottlieb Abkürzung: +: positiver Verbrauch, -: negativer Verbrauch

Taxonomie

Der Stamm Nr. C49009 ist durch seine gram-positive Reaktion, nicht säurefeste Natur, Fragmentierung des Substratmycels, Bildung von weißem Luftmycel, arthrosporenartiger Segmentation in ganzen Teilen desLuftmycels und Fehlen der Fähigkeit zur Bildung deutlicher Pigmente charakterisiert. Durch diese Merkmale, gemeinsam mit der Anwesenheit von LL-Diaminopimelinsäure und Glycin, jedoch dem Fehlen von diagnostischem Zucker in der Zellwand, wird der Stamm Nr. C49009 in die Gattung Nocardioides eingereiht (H. Prauser, Intl. J. Syst Bacteriol., 26, 58-65 (1976)). Der Stamm Nr. C49009 unterscheidet sich von den Luftmycel bildenden nocardioformen Actinomyceten, inklusive Nocardiqpsis dassonvillei, Saccharopolyspora hirsuta und allen heterogen Arten der Gattung Nocardia in der diagnostischen Aminosäure oder dem Zucker der Zellwand und den diagnostischen physiologischen Eigenschaften wie sie von R. E. Gordon et aL, J. Gen. Microbiol., 109.69-78 (1978) beschrieben und in Tabelle 4 dargestellt sind. Der Stamm Nr. C49009 unterscheidet sich weiter von der Gattung Streptomyces in seiner fotogenen nocardia-artigen Morphologie; beispielsweise zerfallen die Substrathyphen des Stammes C49009in kurze Filamente oder Stäbchen. Die arthrosporcnartigen Segmente des Stammes Nr. C49009 unterscheiden sich von den Sparen von Streptomyces durch die Bildungsstelle, die Anordnung der Hyphenscheiden und das Fehlen deutlicher Sporenwände. -6-

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Tabelle 4

Diagnostische Physiologische Eigenschaften des Stammes C4900Q Säurefestigkeit - Zersetzung von: Adenin _ Casein + Hypoxanthin - Tyrosin + Harnstoff - Xanthin - Widerstandsfähigkeit gegen: Lysozym - Rifampicin + Hydrolyse von: Aesculin + Hippurat + Stärke + Säure aus: D(-)-Arabinose + L(+)-Arabinose - Erythrit - Glucose + Inosit + Lactose + D-Melezitose + Melibiose + Methyl-a-glucosid - Raffinose + Verbrauch von: Benzoat - Citrat + Mucat - Succinat + Tartrat .

Nitrit ans Nitrat Überleben bei 50 °C, 8 Stunden

Abkürzung: +: positives Merkmal; -: negatives Merkmal

Das Empfindlichkeitsprofil gegenüber einer Reihe taxon-spezifischer Phagen unterscheidet die Stämme der Gattung Norcardioides von verwandten Gattungen wie Streptomyces oder Nocardia (vgl. H. Prausen Host-phage relationships in nocardioform organisms, „In the Biology of theNocardiae“ EdiL M. Goodfellow et al., London, New York and San Francisco, Academic Press (1976)). Die Empfindlichkeit des Stammes Nr. C49009 gegenüber diesen Actinophagen wurde nicht geprüft, da diese Phagen nicht zur Verfügung standen. Basierend auf den Kultur- -7-

AT 395 860 B eigenschaften und physiologischen Eigenschaften wurden die 17 Stämme der Gattung Nocardioides, die aus Bodenproben isoliert wurden, die von verschiedenen Gegenden der Weltstammen, zu einer einzigen Art zusammengefaßt, nämlich zu Norcardioides albus. Der S tamm Nr. C49009unterscheidet sich von Nocardioides albus in seinem Verbrauch von L-Arabinose und Inosit, ist jedoch in den allgemeinen Kultuimerkmalen und physiologischen Meikmalen ähnlich mit dem letzteren. Somit wurde der Stamm Nr. C49009 vorsichtig als Art der Gattung Nocardioides klassifiziert

Es versteht sich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung des speziellen Stammes Nr. C49009 oder jene Organismen beschränktist dieder obigen Beschreibungvoll entsprechen. Es istinsbesondere beabsichtigt andere sandramycin-produzierende Stämme oder Mutanten dieses Organismus, die aus ihm auf bekannte Weise wie Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Behandlung mit Stickstoff-LostPhageneinwirkung u. dgl. hergestellt werden können, zu umfassen.

Herstellung des Antibiotikums

Sandramycin wird durch Kultivierung von Nocardioides sp. Stamm Nr. C49009 (ATCC 39419) oder einer Mutante desselben in üblichen Nährmedien hergestellt Der Organismus wird in einem Nährmedium gezüchtet das bekannte Nährstoffquellen, z. B. assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie gegebenenfalls anorgani-scheSalzeundandere bekannte Wachstumsfaktoren enthält Vorzugsweise wird unter aeroben Subm^sbedingungen zur Herstellung großer Mengen des Antibiotikums gearbeitet obwohl zur Herstellung begrenzter Mengen auch Oberflächenkulturen und Raschen verwendet werden können.

Das Nährmedium sollte eine oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen enthalten, wie Glycerin, Glucose, Sucrose, Mannose, Fructose, Maisstärke, Maltose, Mannit, Molassen u. dgl., entweder in gereinigtem oder rohem Zustand. Das Nährmedium sollte auch eine oder mehrere assimilierbare Stickstoffquellen enthalten, wie z. B. SojäbohnenschrotFischmehl,Malzextrakt,Hefeextrakt Pepton,Gluten,Baumwollsamen-KeimlingsschrotSojamehl, Leinsamenschrot, Baum wollsamenmehl, Kasein, hydrolysierte Proteinsubstanzen, Nitrate, Ammoniumsalze, Harnstoff u. dgl. Anorganische Nährsalze, wie Natriumchlorid, Kaliumphosphat Magnesiumsulfat Kalziumkarbonat und Spurenmengen von Schwermetallsalzen wie von Kupfer, Zink, Mangan, Eisen u. dgl. können ebenfalls dem Nährmedium zugesetzt werden.

Die Fermentationstemperatur sollte im Bereich von 15 bis etwa 37 °C, vorzugsweise im Bereich von etwa 25 bis etwa 30 °C liegen. Der pH-Wert des Fermentationsmediums sollte im Bereich von etwa 5 bis etwa 10,5 liegen, der bevorzugte Bereich ist von etwa 6 bis etwa 8,5. Üblicherweise wird die optimaleProduktion von Sandramycin in etwa 2 bis 9 Tagen in Abhängigkeit von der Temperatur erhalten. Wenn man eine Tankfermentation durchführt, ist es günstig, ein vegetatives Inoculum in einer Nährbrühe herzustellen, in dem das Briihmedium mit einer Schräg- oder Bodenkultur oder einer lyophilisierten Kultur des Mikroorganismus geimpft wird. Nach der Gewinnung des aktiven Inoculums auf diese Weise wird dieses unter aseptischen Bedingungen in das Fermentationsmedium in dem Tank eingebrachL

Isolierung des Sandramvcins

Nach abgeschlossener Fermentation wird das Sandramycin aus dem Kulturmedium gewonnen und durch das mehrstufige, in dem folgenden Rießschema illustrierte Verfahren in praktisch reiner Form isoliert.

Gesamte Fermentationsbrühe (1) Extraktion mit Äthylacetat (2) Mischung mit Diatomeenerde, Filtration (3) Phasentrennung und Verdampfung verbrauchte Roher Antibiotikum-Extrakt wässerige Phase (1) Extraktion mit wässerigem Methanol und Skellysolve B und Phasentrennung -8-

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Skellysolve B-Phase wässerig-methanolische (1:9) Phase verworfen (1) Verdünnung mit Wasser wässerig-methanolische (1:3) Phase (1) Extraktion mitTetrachloikohlenstoffund Eindampfung Rückstand A wässerig-methanolische (1:3) Phase (1) Verdünnung mit Wasser wässerig-methanolische (7:13) Phase (1) Extraktion mit Chloroform und Eindampfung Rückstand B wässerig-methanolische (7:13) Phase, verworfen (1) Säulenchromatographie der Rückstände A und B unter Verwendung eines Trägers aus Diatomeenerde (2) Eindampfen der Toluolfraktion N/

Rückstand C (1) Silikagel-Chromatographie (2) Elution mit linearem Gradienten

'Y

Sandramycin (1) Umkristallisation gereinigtes Sandramycin -9-

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Zur Erstellung des Fließschemas wird die gesamte aus der Fermentation von Nocardioides sp. Stamm Nr.C49009 stammende Brühe zuerst mit einem wasserunmischbaren organischen Lösungsmittel vorzugsweise mit Äthylacetat, extrahiert. Vorzugsweise wird ein Filterhilfsmittel auf Basis Diatomit oder Derlit zu der Extraktionsmischung zugesetzt und die Mischung dann zur Abtrennung der unlöslichen Bestandteile filtriert Nach dem Filtrieren wird die 5 organische Phase aus dem Filtrat der Extraktionsmischung abgetrennt und durch Eindampfen eingeengt um einen rohen Extrakt des genannten Antibiotikums zu ergeben. Der rohe Extrakt wird zwischen einem aliphatischen Kohlenwasserstoff lösungsmittel aus isomeren Hexanen und etwa 10 % Wasser in Methanol verteilt Die wässerig-methanolische Phase wird mit einer zusätzlichen Wassermenge verdünnt und die entstehende Lösung von etwa 25 % Wasser in Methanol wird mit einem organischen Lösungsmittel, wie Tetrachlorkohlenstoff, extrahiert Die 10 wässerig-methanolische Phase wird weiter mit Wasser verdünnt und die entstehende Lösung von etwa 35 % Wasser in Methanol wird mit einem organischen Lösungsmittel wie z. B. Chloroform extrahiert Die Tetrachlorkohlenstoff-Extrakte werden gesammelt und im Vakuum eingedampft, um den Rückstand A zu ergeben. Die Chloroform-Extrakte werden gesammelt und im Vakuum eingedampft um den Rückstand B zu ergeben. Die Rückstände A und B können vereinigt und auf einer Säule chromatographiert werden, die Diatomeenerde oder das oben genannte Filterhilfsmittel IS enthält wobei organische Lösungsmittel von niedriger bis hoher Polarität verwendet werden. Die geeigneten, das Antibiotikum enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft um den Rückstand C zu ergeben. Eine weitere Reinigung kann durch Silikagel-Flüssigkeitssäulenchromatographie des Rückstands C unter niedrigem Druck oder durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie der Rückstände D, D', E und E' unter mittIeremDruckerreichtwerden,wieimfolgenden in Beispiel3,StufeC,beschrieben ist wobei ein linearerGradient 20 aus Chloroform und 5%igem Methanol in Chloroform als Eluiermittel verwendet wird. Die geeigneten Fraktionen werden zur Trockene eingedampft wobei sie Sandramycin ergeben, das aus einem geeigneten Lösungsmittelsystem umkristallisiert wird und das reine kristalline Sandramycin ergibt

Struktur des Sandramvcins 25 SandramycinisteincyclischesdepsipeptidischesAntitumor-Antibiotikum,daseinen3-Hydroxychinolinkemals

Chromophor und eine Pipecolinsäure-Gruppe enthält. Aus der Spektralanalyse und der chemischen Analyse wurde bestimmt daß das Sandramycin folgende Strukturformel hat:

45

Sandramycinistein weißer,kristalliner Feststoff miteinemSchmelzpunktvon208-212°C,einer Molekularformel von CgQH7gOjgNj2 und einem Molekulargewicht von 1221,3312. Es besteht aus den Elementen Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff. Die Daten der Elementaranalyse sind folgende: 50 Ber. für CgQH^O^N^ 8%0: C: 52,78; H: 6,79; N: 12,31; O (als Differenz): 28,12

Gef.: C: 52,58; H: 6,27; N: 12,29; O (als Differenz): 28,86.

Das Hochauflösungsmassenspektrum von Sandramycin wurde miteinem Kratos MS-50 Spektrometer undFAB-Ionisierung bestimmt Die gefundene Masse war folgende:

Ber. für das (M+H)+-Ion: 1221,5579 Gef. für das (M+H)+-Ion: 1221,5571. -10- 55

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Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Sandramycin in KBr-Preßlingen zeigt charaktische Banden bei den folgenden Frequenzen, ausgedrückt in cm'1: 3500,3340,2970,2940,2880,1748,1660,1640,1598,1520,1468,1445,1420,1336,1290,1265,1235,1172, 1138,1092,1055,1018,922,885,855 und 838.

Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Sandramycin wurde in Methanol (0,01798 g/1) in neutralen, sauren und basischen Bedingungen gemessen. Die beobachteten Absorptionsmaxima und Absorptionsfähigkeiten waren die Folgen: (a) in CH3OH: 356 (8,1), 296 (7,5), 229 (62,8), 217 (63,7) in CH3OH-HCI: 356 (8,3), 306 (8,1), 228 (58,4), 210 (62,3) in CHjOH-NaOH: 395 (9,2), 301 (7,2), 246 (59,8).

Ein Protonenmagnetresonanzspektrum von Sandramycin, das in deuteriertem Chloroform gelöst war, wurde mit einem Bruker-Spektrometer Modell WM-360 bestimmt, wobei bei 360 MHz und unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard gearbeitet wurde. Die beobachtete chemische Verschiebung (δ-Werte), die Kupplungskonstanten (J-Werte in Hz) und die Musterbeschreibungen sind die folgenden: 11,75 (s, 2H, Ar-OH), 9,58 (d, J=6,39,2H, ser NH), 8,55 (bs, 2H, Gly NH), 7,82 (bs, 2H, Ar-H8), 7,72 (m, 2H, Ar-H5), 7,63 (s, 2H, Ar-H4), 7,52 (m, 4H, Ar-H°und Ar-H7), 5,60 (m, 2H, aH von Pip.), 5,56 (d, J=17,58,2H Sar aCH), 5,28 (m, 2H, Ser aCH), 5,01 (d, J=12,79,2H, Ser ßCH), 4,88 (d, J=12,79,2H, Val otCH), 4,45 (bd, J= 12,79,4H, Ser ßCH und Gly aCH), 4,07 (bd, J=15,99,4H, εΗ von Pip. und Gly aCH), 3,76 (bd, J=12,79,2H, εΗ von Pip.), 3,58 (d, J=17,58,2H, Sar CH), 3,14 (s, 6R, N-CH3), 2,96 (s, 6H, N-CH3), 2,06 (m, 2H, Val ßCH), 1,82 (bs, 4H, ßCH von Pip.), 1,68 (bm, 4H, yCH von Pip.) 1,57 (bm, 4H, 5CH von Pip.), 0,94 (d, J=6,37,6H, Val-CH3), 0,80 (d, J=6,37,6H, val-CH3). n

Ein 1 JC-Magnetresonanzspektrum von in deuteriertem Chloroform gelöstem Sandramycin wurde mit einem Jeol-Spektrometer Modell FX90Q bei 22,5 MHz und unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard bestimmt. Die beobachteten chemischen Verschiebungen (ppm-Werte), bei welchen jede chemische Verschiebung zwei Kohlenstoffatome bedeutet, und die Zuordnungen sind wie folgt:

Nr. Chemische Verschiebung (ppm) Zuordnung 1 171,73 Carbonyl 2 168,54 Carbonyl 3 168,37 Carbonyl 4,5 166,91,166,91 Carbonyle 6 165,39 Carbonyl 7 153,04 3-Hydroxychinolin C-3 8 140,64 C-2 9 133,87 C-8a 10 131,22 C-4a 11 128,61 C-8 12 127,64 C-7 13 126,23 C-5 14 125,58 C-6 15 119,45 C-4 16 61,43 N-Methylvalin aCH 17 27,90 ßCH 18 18,58 7CH3 19 17,82 7CH3 -11-

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Nr. Chemische Verschiebung (ppm) Zuordnung 20 29,42 21 49,79 22 41,02 23 34,08 24 51,74 25 61,11 26 48,49 27 27,90 28 19,34 29 24,11 30 43,07

Glycin nch3 00¾ Sarcosin aCH Serin N-CH3 aCH Pipecolinsäure ßCH2 aCH ß-CH2 y-ch2 6-CH2 e-CH2

Die Schlüsselmerkmale der Struktur von Sandramycin, die es von dem Luzopeptinen A, B und C unterscheiden, sind das Vorliegen von 3-Hydroxychinaldinsäure- und Pipecolinsäuregruppen anstelle der 3-Hydroxy-6-methoxy-chinaldinsäure- bzw. der 4-substituierten Tetrahydropyridazin-3-carbonsäuregruppen.

Biologische Aktivität des Sandramvcins

Dieantibakterielle Wirksamkeitvon Sandramycin wurdedurch eine Reihezweifacher Agarverdünnungsmethoden bestimmt. Die Resultate sind in Tabelle 5 gezeigt, wobei mit den Wirkungen von Luzopeptin A und Echinomycin verglichen wurde. Wie aus Tabelle 5 hervorgeht, inhibiert das Sandramycin stark die gram-positiven Organismen, wie z. B. Bazillus subtilis und Staphylococcus aureus sowie Streptococcus faecalis. lateiig.5

Antimikrobielle Wirkung von Sandramycin

Minimale Inhibitionskonzentration (MIC) (mcg/ml)

Testorganismus

Sandramycin Luzopeptin A Echinomycin B.subtilis fRec. +1 A22 508-2 0,024 0,195 0,049 ILsiMis(Rec.-) A22 509-2-2 0,012 0,049 <0,003 SjjBUgjjg209P-A9497 0,012 0,098 0,012 S. aureus tEchinomvcin-resistentl A9628 0,098 0,098 0,78 Streo. faecalis A9611 0,024 0,195 0,012 E. coli A15119 12,5 12,5 12,5 E. coli fActinomvcin-sensitiv) A21780 (AS-19) 12,5 12,5 6,25 -12-

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Sandramycin wurde auch gegen den transplantierbaren Mäusetumor Leukämie P-388 untersucht und die Resultate sind in Tabelle 6 gezeigt. Das verwendete Verfahren folgte im allgemeinen den Angaben des National Cancer Institute (Cancer Chemotherapy Rep. Part 3,3,1-103 (1972)). Die wesentlichen experimentellen Details sind unterhalb der Tabelle 6 angegeben. Zwei verschiedene Dosierungsvorschriften wurden untersucht: eine einzige Dosis am Tag 1 und täglich während 5 Tagen. Bei beiden Dosierungsplänen scheint die optimale Dosis etwa 0,2 mg/kg/Injektion zu sein.

Tabelle 6

Wirkung von Sandramvcin auf Leukämie P-388

Verbindung Behand lungs plan Dosis IP mg/kg/Inj. MST Tage Wirkung MST %T/C AWC g Tag 4 Überlebende Tag 5 Sandramycin d. 1 3,2 Toxisch Toxisch -2,8 0/6 1,6 11,5 128 -13 6/6 0,8 10,0 111 -1,6 6/6 0,4 11,0 122 -0,7 6/6 0,2 14,5 161 -1,4 6/6 0,1 11,0 122 -0,9 6/6 0,05 10,0 111 -0,6 6/6 0,025 9,5 106 -03 6/6 Sandramycin d.l —> 5 1,6 Toxisch Toxisch -1,7 2/6 0,8 6,0 67 -1,4 5/6 0,4 11,0 122 -1,3 6/6 0,2 12,0 133 -1,7 5/6 0,1 11,5 128 -0,8 6/6 0,05 8,5 94 -1,8 6/6 0,025 10,0 111 -1,4 5/5 0,0125 10,5 117 -0,9 6/6 Kontrolle Salzlösung 9,0 - 03 10/10

Tumor-Inoculum: 10^ Asciteszellen, i. p. implantiert

Wirt: weibliche Mäuse CDFj

Bewertung: MST = mittlere Uberlebenszeit

Wirkung: % T/C έ (MSTbehandell/MST Kontrolle) x 100

Kriterien: % T/C = 125 wird als signifikante Antitumorwirkung betrachtet AWC: mittlere Gewichtsänderung (behandelt-Kontrolle) in Gramm (am vierten Tag).

Wie durch die oben erstellten antimikrobiellen und Mäusetumor-Daten angegeben, zeigt sich das Sandramycin als wertvolles Antibiotikum und auch als Antitumormittel zur Inhibierung von bösartigen Säugetiertumoren, die P-388 Leukämie.

Die Erfindung umfaßt somit auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame antimikrobielle oder tumorinhibierende Menge von Sandramycin gemeinsam mit einem inerten pharmazeutisch verwendbaren Träger oder Verdünnungsmittel enthalten. Diese Zusammensetzungen können auch andere aktive antimikrobielle oder Antitumormittel enthalten und können in jede geeignete pharmazeutische Form für jede gewünschte Verabreichungsweise gebracht werden. Beispiele solcher Zusammensetzungen umfassen feste Zusammensetzungen für die orale Verabreichung, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver und Granulate, flüssige Zusammensetzungen -13-

AT395860B für die orale Verabreichung, wie Lösungen, Suspensionen, Sirupe oder Elixiere und Zubereitungen für die parenterale Verabreichung, wie sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie können auch in Form steriler fester Zusammensetzungen hergestellt werden, die in sterilem Wasser, physiologischer Salzlösung oder einem anderen sterilem injizierbaren Medium unmittelbar vor derVerwendung gelöstwerden können. ZurVerwendung als 5 antimikrobielles Mittel wird das Sandtamycin oder eine pharmazeutische Zusammensetzung desselben derart verabreicht, daß die Konzentration des Wirkstoffs größer ist als die minimale Inhibitionskonzentration für den jeweiligen behandelten Organismus. Bei der Verwendung als Antitumormittel können die optimalen Dosierungen und Dosierungsplane für Sandramycin bei einem gegebenen Säugetierwirt leicht durch den Fachmann festgestellt werden. Selbstverständlich wird man einsehen, daß die tatsächliche Sandramycindosis je nach der speziellen 10 Formulierung der Zusammensetzung, der Anwendungsweise und der speziellen Lage, dem jeweiligen Wirt und der jeweiligen zu behandelnden Krankheit variieren wird. Viele Faktoren, die die Wirkung des Medikaments beeinflussen, müssen in Rechnung gesetzt werden, wie z. B. das Alto-, Gewicht, Geschlecht, die Diät, Verabreichungszeit, Verabreichungsweise, Ausscheidungsrate, der Zustand des Patienten, die Kombination der Medikamente, Reaktionsempfindlichkeiten und die Schwere der zu behandelnden Krankheit. 15 Die folgenden Beispiele sind allein zur Erläuterung, jedoch nicht zur Beschränkung des Rahmens da* Erfindung angegeben. Skellysolve B ist ein handelsübliches Erdöllösungsmittel (Skelly Oil Co.), das isomere Hexane enthält und einen Siedepunkt von 60 bis 69 °C hat Dicalit ist eine von Grefco, Inc., Torrance, Califomien, hergestellte Diatomeenerde. Wenn nicht anders definiert, sind alle angegebenen Temperaturen in °C. 20 Beispiel 1: Fermentation des Sandramvcin A. Schüttelflaschen-Fermentation

Nocardioides sp. Stamm Nr. 49009, ATCC 39419 wurde in Kulturteströhrchen auf Schrägargar aus Hefe-Malzextrakt-Agar gehalten und transferiert. Dieses Medium besteht aus 4,0 g Glucose, 4,0 g Hefeextrakt, 10,0 g 25 Malzextrakt und 20,0 g Agar, die mit entionisiertem Wasser auf 11 ergänzt werden. Bei jeder Übertragung wurde die Agar-Schräg-Kultur 7 Tage lang bei 27 °C inkubiert. Zur Herstellung eines Inoculums für die Produktionsphase wurde gewachsenes Mycel aus der Schrägkultur in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben eingebracht, der 100 ml steriles Medium aus 30,0 g Glucose, 10,0 g Sojamehl, 10,0 g Baumwollsamen-Keimlingsschrot und 3,0 g CaCOg, mit entionisiertem Wasser auf 11 ergänzt, enthielt Diese vegetative Kultur wurde bei 27 °C 48 Stunden auf einem 30 Gyrotory Tier Shaker (Modell G53, New Brunswick Scientific Co., Inc.), der mit 210 U/min rotierte und einen Kreis mit einem Durchmesser von 5,1 cm beschrieb, inkubiert. 4 ml der vegetativen Kultur wurden in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben übertragen, der 100 ml eines sterilen Produktionsmediums aus 20,0 g Sucrose, 10,0 g Sojamehl, 10,0 g Leinsamenschrot und 5,0 g CaCOj, mit entionisiertem Wasser auf 11 ergänzt enthielt Die Produktionskultur wurde bei 27 °C auf einer Schüttelvorrichtung, wie sie für die vegetative Kultur verwendet worden war, bei 35 250 U/min inkubiert Nach 96 Stunden wurde die Produktionskultur zur Isolierung des Sandramycin geerntet B. Bench-Top-Fermentation

Zur Herstellung von Sandramycin in einem Bench-Top-Fermenter wurden 400 ml der vegetativen Kultur, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde, in einen Fermenter (Microgen Model SF-116, New Brunswick Scientific Co., 40 Inc.) mit 101 Produktionsmedium, bestehend aus 40 g Maisstärke, 20 g Leinsamenschrot 1 g (NH^SO^ und 5 g

CaCOß pro Liter entionisiertem Wasser übertragen. Die Temperatur wurde auf 27 °C gehalten, die Rührgeschwindigkeit war 300 U/min und die Strömungsgeschwindigkeit der Luft betrug 8 1 pro Minute. Nach 202 Stunden Inkubationszeit wurde das Sandramycin aus der Kultur isoliert 45 C. Tank-Fermentation

Zur Herstellung von Sandramycin in einer Versuchsanlage wurden 21 vegetativer Kultur (hergestellt nach der allgemeinen Vorschrift von Beispiel 1A) in einen Fermenter eingebracht der 301 Produktionsmedium enthielt, das aus 40 g Maisstärke, 20 g Leinsamenschrot, 1 g (NH^SC^ und 5 g CaCOß pro Liter entionisiertem Wasser bestand. Die Inkubationstemperatur lag bei 26 °C, die Strömungsgeschwindigkeit der Luft betrug 80 1/min, die Rühr-50 geschwindigkeit375U/min undderRückdruck war 1 Atmosphäre. Nach 183 Stunden wurde die Tank-Fermentation geerntet um das Sandramycin zu isolieren.

Beispiel 2: Isolierung und Reinigung von Sandramvcin 55 Stufe A: Extraktion

Die gesamte Rohfermentationsbrühe (ungefähr 81) wurde in einem 201 Polyäthylentank eingebracht (48 cm oberer Durchmesser, 44 cm unterer Durchmesser, 55 cm Höhe), der mit einem Absperrhahn am Boden versehen war. -14-

AT395 860 B

Ein gleiches Volumen Äthylacetat wurde zugesetzt. Die Mischung wurde miteinem luftgetriebenen Rührer mit guter Mischgeschwindigkeit 30 min lang gerührt. Etwa 61 (2 kg) Filterhilfsmittel wurden zugesetzt und eingemischt. Die Mischung wurde in einem Büchner-Trichter Nr. 12 über ein Filterbett filtriert. Das Filtrat wurde in einer mit Vakuumanschluß ausgerüsteten 191 Flasche aufgefangen. Der Filterkuchen wurde mit 21 Äthylacetat gewaschen. Das Filtrat wurde in einem 201-Scheidetrichter eingebracht und die Phasen absetzen gelassen. Der Äthylacetat-Extrakt wurde entnommen und in einem mit kontinuierlichem Zuläufer ausgerüsteten gläsernen Umlaufverdampfer von Laboratoriumsgröße auf etwa 11 eingeengt. Das Konzentrat wurde weiter bis zu einem viskosen Öl in einem Rotationsverdampfer im Vakuum eingedampft und ergab 1,94 g rohen Extrakt.

Stufe B: Flüssig-Flflssig-Verteilung des rohen Extrakts

Der rohe Extrakt der Stufe A (1,94 g) wurde in einer Mischung aus 200 ml Methanol und 200 ml Kohlenwasserstofflösungsmittel gelöst. Die zweiphasige Lösung wurde in einem 11-Scheidetrichter eingebracht und mit 22 ml Wasser verdünnt. Die Mischung wurde geschüttelt und die entstehenden Blasen absetzen gelassen. Das wässerige Methanol (untere Phase) wurde in einen zweiten 11-Scheidetrichter übertragen und noch zweimal mit 200 ml Anteilen Kohlenwasserstofflösungsmittel extrahiert. Das Kohlenwasserstofflösungsmittel war vorher mit einem gleichen Volumen von 10 % Wasser in Methanol gesättigt worden. Die wässerige methanolischePhase wurde mit 44 ml Wasser verdünnt und 3 mal mit 200 ml Tetrachlorkohlenstoff extrahiert. Der Tetrachlorkohlenstoff war vorher mit einem gleichen Volumen von 25 % Wasser in Methanol gesättigt worden. Die wässerige methanolische Phase wurde mit 41 ml Wasser verdünnt und 3 mal mit 200 ml Chloroform extrahiert. Das Chloroform war vorher mit einem gleichen Volumen von 35 % Wasser in Methanol gesättigt worden. Die Tetrachlorkohlenstoffextrakte wurden gesammelt und im Vakuum in einem Rotationsverdampfer eingedampft, wobei 595 mg Rückstand A erhalten wurden. Die Chloroformextrakte wurden vereinigt und im Vakuum in einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft, wobei 458 mg Rückstand B erhalten wurden.

Stufe C; Verreiben der Rückstände A und B

Der Rückstand A (547 mg) und Rückstand B (389 mg) aus der StufeB wurden vereinigt und in 30 ml Chloroform-Methanol-Mischung (2:1) gelöst. Dicalit (17,4 g) wurde zu der Lösung zugesetzt und dann durch Zugabe von 200 ml Kohlenwasserstofflösungsmittel eine Aufschlämmung hergestellt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum in einem Rotationsverdampfer verdampft. Das zurückbleibende Pulver wurde in 500 ml Toluol aufgeschlämmt und auf eine Flash-Chromatographie -Säule von 4,1 cm I. D. x 45,7 cm aufgebracht. Das Filterhilfsmittel wurde unter Druckströmung (Nj- 3,2 N/cm2) zu einem Bett gepackt. Wenn das Packungslösungsmittel die Bettoberfläche erreicht, wird die Strömung unterbrochen und der Druck von der Säule genommen. Eine Schicht Ottowa-Sand (ungefähr 2 cm) wurde auf der Oberfläche aufgebracht Die Säule wurde dann mit einer unter Druck stehenden Stickstoffströmung mit den folgenden elutropen Reihen eluiert: Toluol (500 ml); Diäthyläther (500 ml); Methylenchlorid (500 ml); Chloroform (500 ml); Äthylacetat (500 ml); Acetonitril (500 ml), Tetrahydrofuran (500 ml) und Methanol (500 ml). Das Toluol-Eluiermittel und das Packungsfiltrat wurden vereinigt(ungefähr 1 Liter) und im Vakuum in einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft Ausbeute 0,699 g Rückstand C.

Stufe D: Säulenchromatographie des Rückstands C

Eine Glenco-Säule mit 2,0 cm I. D. x 30 cm wurde mit 37 g Woelm-Silicagel (0,060 bis 0,200,70-230 mesh) in Chloroform schlammgepackt. Rückstand C (0,699 g) aus Stufe C wurde in 5 ml Chloroform gelöst und über Kopf der Säule aufgebracht. Die Probe wurde durch das gepackte Bettperkolieren gelassen. Der Leerraum zwischen dem Säulenkopf und dem Silikagelbett wurde mit Standard-Ottawa-Sand gefüllt. Die Säule wurde an einen Glenco-Gradienten-Elutionsapparat angeschlossen und die Elution mit einem 21-Lineargradienten von Chlorform bis zu 5 % in Chloroform unter Auffangen von 20100 ml Fraktionen begonnen. Jede Fraktion wurde im Vakuum in einem Rotationsverdampfer zur Trockene gedampft. Der Rückstand wurde in 3 ml Chloroform-Methanol-Mischung (2:1) gelöst. Aliquote Anteile (2 μΐ) jeder Fraktion wurden aufDünnschichtehromatographie-(TLC)-Platten aus Analtech-Silikagel GHLF aufgebracht Die Platten wurden mit 5 % Chloroform eluiert und bei 254 nm und 366 nm Ultraviolettlicht optisch betrachtet Die Fraktion 6 wurde als homogen beurteilt Der kristalline Rückstand aus Fraktion 6 wurde aus Chloroform-Methanol umkristallisiert und ergab 215 mg Sandramycin. Dieses Material wurde aus Chloroform-Methanol umkristallisiert und ergab 188 mg reines Sandramycin mit dem Schmelzpunkt 208 - 212 °C.

Analyse Ber. für: ^Η-^Ο^Ν^.δΙ^Ο: C: 52,78; H: 6,79; N: 1231

Gef.: C: 52,58; H:6,29; N: 12,29 -15-

AT395 860 B

Beispiel 3:

Isolierung und Reinigung von Sandramvcin in größerem Maßstab

Stufe A: Extraktion und Flüssigverteilung des rohen Extraktes 5 Bei Wiederholung der allgemeinen Isoliervorschriften von Beispiel 2, Stufen A und B wurden 1,12 g Rückstand A und 3,03 g Rückstand B aus der gesamten Fermentationsbrühe (etwa 81) erhalten.

Stufe B: Verreiben der Rückstände A und B Rückstand A (1,12g) aus Stufe A wurde in etwa 300 ml Chloroform-Methanolmischung (2:1) gelöst. Füter-10 hilfsmittel (20 g) wurde zu der Lösung zugesetzt. Das Lösungsmittel wurde in einem Rotationsverdampfer im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wurde in 300 ml Toluol aufgenommen und wieder zur Trockene eingedampft. Dieser Vorgang wurde ein zweites Mal wiederholt Der entstehende Rückstand wurde in 300 ml Kohlenwasserstofflösungsmittel aufgeschlämmt und in einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft. Dieser Vorgang wurde ein zweites Mal wiederholt. Der Filterhilfsmittelrückstand wurde in 300 ml Kohlen-15 Wasserstofflösungsmittel aufgeschlämmt und auf eine Rash-Chromatographiersäule von 4,1 cm I. D. x 45,7 cm aufgebracht. Der Dicalit war unter einer Druckströmung (N2-3,2 N/cm^) zu einem Bett gepackt worden. Oberhalb dieses Bettes wurde eine Schicht aus Ottawa-Sand (etwa 2 cm) aufgebracht. Die Eluierung begann mit einem Stickstoffstrom unter Druck mit der folgenden elutropen Reihe: Kohlenwasserstofflösungsmittel (500 ml); Toluol (500 ml); Diäthyläther (500 ml); Methylenchlorid (500 ml); Chloroform (500 ml); Äthylacetat (500 ml); Acetonitril 20 (500 ml); Tetrahydrofuran (500 ml) und Methanol (500 ml). Das Toluol-Eluiermittel wurde im Vakuum in einem

Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft. Ausbeute 912,7 ml Rückstand D.

Die oben angegebene allgemeine Vorschrift wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß der Rückstand A durch 3,03 g Rückstand B ersetzt wurde, wobei 766,7 mg Rückstand E aus dem Toluol-Eluat erhalten wurden.

Die oben in Beispiel 3, Stufen A und B beschriebenen Vorschriften wurden mit der Ausnahme wiederholt, daß 25 die Rückstände A und B, die dabei erhalten und verwendet wurden, durch 1,5 g und 1,97 der Rückstände A' bzw. B’ ersetzt wurden und daß dabei 993,9 mg Rückstand D' bzw. 693 mg Rückstand E' aus dem Toluol-Eluat erhalten wurden.

Stufe C: Säulenchromatographie der Rückstände D und E 30 Eine Glenco-Säule mit 2,0 cm I. D. x 30 cm wurde mit40 g Woelm-Silikagel (0,063 bis0,200mm) in Chloroform schlamm-gepackt. Die Säule wurde in das HPLC-System bei mittlerem Druck eingebracht und mit Chloroform äquilibriert. DieRückständeD, D’,E undE’aus Stufe B wurde vereinigt(etwa3,366 g) und in 6 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wurde in eine 15 ml Probenschleife gezogen. Die Probenschleife wurde in das Mitteldruck-HPLC-System eingebracht, die Probe mit200 ml Chloroform auf die Säule aufgepumpt Die Eluierung begann mit einem 35 21 Lineargradienten Chloroform bis zu 5 % Methanol in Chloroform, wobei 17 x 177 ml-Fraktionen gesammelt wurden. Aliquote Anteile (6 μΐ) aus jeder Fraktion, wurden durch TLC unter Verwendung von 5 % Methanol in Chloroform als Eluiermittel untersucht und mit Licht von 366 nm optisch beurteilt. Die Fraktionen 5 und 6 wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft wobei 2,166 g Rückstand F erhalten wurden. Die Fraktionen 7 bis 12 wurden vereinigt und im Vakuum in einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft. Der Rückstand 40 (953 mg) wurde in 6 ml Chloroform gelöst und wie oben angegeben, unter Verwendung eines 21 Lineargradienten von Chloroform bis zu 1,5 % Methanol in Chloroform neuerlich Chromatographien, wobei 20 x 100 ml-Fraktionen aufgefangen wurden. Die Fraktionen 9 bis 20 wurden vereinigt und in einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft wobei 860 mg Rückstand E erhalten wurden.

Die Rückstände F und G werden vereinigt und aus Chloroform-Methanol umkristallisiert wobei 1,985 g reines 45 Sandramycin erhalten wurden, das mit dem in Beispiel 2 isolierten Produkt ident war. 50 -16- 55

Claims (4)

1. AT 395 860 B PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antitumor-Antibiotikums Sandramycin mit der Strukturformel

   dadurch gekennzeichnet, daß ein Sandramycin-produzierender Stamm von Nocardioides sp. nov. mit den Identifikationsmerkmalen von ATCC 39419 oder eine Mutante desselben unter aeroben Submersbedingungen in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, gezüchtet wird, bis eine deutliche Menge von Sandramycin produziert und in dem Kulturmedium angereichert wird, und daß das Sandramycin gegebenenfalls aus dem Kulturmedium isoliert wird.
2. 2. Eine biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Nocardioides sp. ATCC Nr. 39419, die imstande ist, das Antittunor-Antibiotikum Sandramycin in einer gewinnbaren Menge durch Züchtung in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Submersbedingungen zu produzieren.
3. 3. Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines tierischen, von einer Bakterieninfektion befallenen Wirts, bei welchem Verfahren diesem Wirt eine antibakteriell wirksame Dosis von Sandramycin verabreicht wird.
4. 4. Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines tierischen, von einem bösartigen, auf Sandramycin ansprechenden Tumor befallenen Wirts, bei welchem Verfahren diesem Wirt eine tumorinhibierende Dosis von Sandramycin verabreicht wird. -17-