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Die Erfindung betrifft neue antibiotisch wirksame Verbindungen, nachstehend als Hextamycin A und Hextamycin B bezeichnet, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen mit Hilfe des Mikroorganismus Micromonospora species Y-82. 20012 (DSM 3777), dessen Varianten und Mutanten.
Micromonospora bilden nachweislich mehrere Arten von Antibiotika wie Aminoglykoside, Makrolide, Ansamycine, Evernomicine und Aktinomycine. Antibiotika aus Mikromonospora werden in den Annual Reviews of Microbiology, Bd. 34, S. 537 bis 557 [1980] beschrieben.
Die hier beschriebenen Antibiotika scheinen sich von diesen bekannten Arten von Antibiotika in ihren biologischen und chemischen Eigenschaften zu unterscheiden und sind aus diesem Grunde Gegenstand der Erfindung.
Die Mikroorganismen für die Herstellung der Hextamycine A und B gehören zu der Ordnung Actinomycetales, Familie Micromonosporaceae und dem Genus Micromonospora.
Der Mikroorganismus Micromonospora species Y-82. 20012 wurde am 20. 6. 1986 unter der Nummer DSM 3777 bei der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (Griesebachstr. 8, D-3400 Göttingen) hinterlegt.
Das Verfahren zur Herstellung von Hextamycin A und Hextamycin B ist dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Micromonospora species Y-82. 20012 (DSM 3777) seine Varianten oder Mutanten auf übliche Weise unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium kultiviert wird, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Nährsalze, Spurenelemente und gegebenenfalls Inhibitoren von Antibiotika-abbauenden Enzymen enthält und die gebildeten Verbindungen aus der Kulturbrühe und dem Myzel, wie im folgenden beschrieben, isoliert und gereinigt werden.
Kohlenstoff-Lieferanten können Stärke, Glukose, Saccharose, Dextrin, Fruktose, Melassen, Lactose und Galactose sein. Bevorzugter Kohlenstoff-Lieferant ist Glucose. Stickstoff-Lieferanten können organische Stickstoffquellen wie Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Hefeextrakt, Malzextrakt, Rinderextrakt, Maislauge, Pepton, Kasein oder Kaseinhydrolysat oder anorganische Stickstoffquellen wie Ammoniumsalze, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat oder Nitratsalze wie Natriumnitrat oder Kaliumnitrat sein. Als organische Stickstofflieferanten werden Sojabohnenmehl, Pepton und Maislauge bevorzugt. Die bevorzugte anorganische Stickstoffquelle ist Ammoniumsulfat. Als organische Nährstoffsalze können Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Natrium- oder Kaliumhydrogen- oder - dihydrogenphosphat, Calciumchlorid, Magnesiumphosphat oder Calciumphosphat dienen.
Spurenelemente können die Salze von Eisen, Mangan, Kupfer, Zink oder Kobalt oder anderer Schwermetalle sein. Als Inhibitoren von Antibiotika-abbauenden Enzyme können Jod oder dessen Salze wie Kaliumjodid, Natriumjodid oder Natriumperjodat dienen. Bevorzugter Inhibitor ist Kaliumjodid.
Die Kultivierung von Micromonospora Y-82. 20012 erfolgt bei Temperaturen zwischen 28 bis 32 C und einem PH zwischen 6, 0 und 8, 0. Mikromonospora species Y-82. 20012 wird vorzugsweise bei 28 C und PH 6, 1 kultiviert. Die Kultivierung wird nach 72 bis 96, bevorzugt 72 h beendet, wenn optimale Ausbeuten der Substanzen der Erfindung gewonnen worden sind. Die Kultivierung erfolgt vorzugsweise als Submers-Kultivierung. Zu Beginn der Kultivierung kann ein Antischaum- - Mittel, bis zu einer Endkonzentration von 0, 025 bis 0, 5% der Kulturbrühe zugesetzt werden.
Als Antischaum-Mittel kann Pflanzenöl, z. B. Erdnussöl, Maisöl, Sojabohnenöl oder ein Silikonöl wie beispielsweise ein aus Polyolen bestehendes Antischaum-Mittel dienen. Als Antischaum-Mittel wird eine Menge von 0, 04%, z. B. des Produktes (R) Desmophen der Fa. Bayer AG. Leverkusen, das aus Polyolen besteht, bevorzugt.
Der Verlauf der Kultivierung und die Bildung der Hextamycine gemäss der Erfindung kann mittels Messung der antibakteriellen Wirkung der Kulturbrühe gegen Bakterienstämme wie B. subtilis, S. aureus, E. coli, Ps. aeruginosa und einige andere überwacht werden. Bevorzugt wird dafür Ps. aeruginosa verwendet.
In der entstandenen Kulturbrühe liegen die Hextamycine gemäss dieser Erfindung sowohl im Myzel als auch im Kulturfiltrat vor. Die Hextamycine werden vorzugsweise aus dem Myzel isoliert, das durch Filtrieren oder Zentrifugieren der Kulturbrühe gewonnen wird. Das Myzel wird mit Lösungsmittel wie Methanol, Aceton, Äthanol, n-Butanol oder Äthylmethylketon extrahiert. Als Lösungsmittel wird Aceton bevorzugt. Der Lösungsmittelextrakt wird unter Vakuum
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konzentriert und filtriert. Nach der Verdünnung mit Wasser wird das Filtrat auf eine Säule aus polymerem Adsorptionsmaterial, wie z. B. eine (R) Diaion HP-20-Säule (Hersteller Mitsubishi Chemical Industries, Japan) gegeben und dann mit Wasser-Methanol eluiert.
Die aktiven Methanoleluate werden konzentriert und dann mit Petroläther (Sdp. 60 bis 80 C) behandelt. Die Hextamycine werden aus dem durch Filtrieren oder Zentrifugieren der Kulturbrühe gewonnenen Kulturfiltrat durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel wie Äthylacetat, Chloroform
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ist. Als Lösungsmittel wird vorzugsweise Äthylacetat verwendet, der bevorzugte PH ist 7, 0. Im Anschluss an die Extraktion wird der Lösungsmittelextrakt unter Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Petroläther behandelt (Sdp. 60 bis 80 C).
Das aus dem Myzel und dem Kulturfiltrat gewonnene, in Petroläther unlösliche Material wird kombiniert, gereinigt und mittels verschiedener chromatographischer Techniken wie "reversed phase"-RP-18-Silicagel-Säulen-Chromatographie oder normaler Silicagel-Chromatographie oder präparativer Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) in Hextamycin A und Hextamycin B getrennt.
Die nachfolgenden Beispiele illustrieren die Erfindung :
Beispiel 1
Züchtung von Micromonospora species Y-82. 20012 (DSM 3777) für die fermentative Herstellung von Hextamycinen
Züchtung von Micromonospora species Y-82.20012 auf CSPY-Medium mit folgender Zusammensetzung :
EMI2.2
<tb>
<tb> Casein <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Maisstärke <SEP> 10,0 <SEP> g
<tb> K <SEP> HPO <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Pepton <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> PH <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
Das Medium wurde in Reagenzgläsern verteilt und 20 min lang bei 121 C sterilisiert. Die Reagenzröhrchen wurden zur Herstellung von Schrägagar in Schrägstellung abgekühlt.
Die Schrägagar-Röhrchen wurden mit Micromonospora species Y-82. 20012 beimpft, die aus Bodenproben isoliert und 8 Tage lang bei 280C inkubiert wurden, bis ein gutes Wachstum erkennbar war. Das Wachstum eines Schrägagars diente zum Inokulieren von fünf 500 ml-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 80 ml des folgenden Impfkulturmediums enthielten :
Zusammensetzung des Impfkulturmediums :
EMI2.3
<tb>
<tb> Rinderextrakt <SEP> 3,0 <SEP> g
<tb> Trypton <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Lösliche <SEP> Stärke <SEP> 24,0 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> 5,0 <SEP> g
<tb> CaC03 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Wasser <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> PH <SEP> 6,1 <SEP>
<tb>
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EMI3.1
(10 Vol.-%) für die Zubereitung der Zweitstufen-Impfkultur enthielt. Die Fermentierung erfolgte 24 h lang bei 28 C (i 1 C) unter Rühren bei 200 rpm und Belüftung von 6 vvm.
Die resultierende gut gewachsene Zweitstufen-Kultur wurde zum Beimpfen des folgenden Produktionsmediums verwendet :
Zusammensetzung des Produktionsmediums :
EMI3.2
<tb>
<tb> Lösliche <SEP> Stärke <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 15,0 <SEP> g
<tb> Soytone <SEP> 3,0 <SEP> g
<tb> Pepton <SEP> 3,0 <SEP> g
<tb> CaC03 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> (NH4) <SEP> O4 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> KJ <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g <SEP>
<tb> CoCl2 <SEP> 0, <SEP> 0001 <SEP> g <SEP>
<tb> Spurenelementlösung <SEP> 1,0 <SEP> ml
<tb> Wasser <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> PH <SEP> 6,1
<tb>
Spurenelementlösung :
EMI3.3
<tb>
<tb> CUS04. <SEP> 5H2 <SEP> 0 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> FeSO4.7H2O <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb> MnCl2.4H2O <SEP> 8,0 <SEP> g
<tb> ZnS04. <SEP> 7H2 <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Wasser <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb>
Dem Inhalt des Fermenters wurden 0, 04% eines aus Polyolen bestehenden Antischaum-Mittels zugesetzt. 90 1 des Produktionsmediums wurden in einen 150 l-Fermenter gegeben. Das Medium
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der Fermentation von 72 h betrug der PH der Kulturbrühe 7, 4 und das PCV 9 ml pro 100 ml.
Beispiel 2
Isolierung und Reinigung von Hextamycin A und Hextamycin B
Sämtliche Vorgänge während der Isolierung und Reinigung wurden in Abwesenheit von Licht ausgeführt.
Um das Filtrat (230 1) und das Mycel (7 kg) voneinander zu trennen, wurden die 250 1 Kulturflüssigkeit zentrifugiert.
Der Mycel-Kuchen wurde dreimal mit Aceton extrahiert, wobei jeweils 80 1 Lösungsmittel verwendet wurden. Die kombinierten Acetonextrakte wurden unter reduziertem Druck und bei einer Temperatur von 350C konzentriert. Der zurückbleibende wässerige Acetonextrakt wurde mit Wasser auf 12 1 verdünnt und dann durch eine Säule aus polymerem Adsorptionsmaterial (2 1)
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gegeben. Nach Eluieren der Säule mit Wasser (10 1) und anschliessend mit 50% Methanol/Wasser (10 1) wurde mit Methanol (15 1) eluiert. Die Methanoleluate wurden unter reduziertem Druck zu einer Paste konzentriert und dann mit Petroläther behandelt, (Sdp. 60 bis 80 C, 1 l). Das unlösliche gefärbte Material (3 g) enthielt das gewünschte Antibiotikum.
Das vorgenannte Roh-Antibiotikum wurde mit einer 30 Mikron-Octadecyldimethyl-silylierten Silicagel-Säule (1, 7 1 ; 6 x 62 cm) chromatographiert. Die Säule wurde bei einer Fliessrate von 55 ml/min zunächst mit einem Lösungsmittel-System (5 l) aus Methanol/Acetonitril/Wasser im Verhältnis 2 : 6 : 5 eluiert. Durch weiteres Eluieren mit Methanol/Acetonitril/0, 2% Natriumdihydrogenphosphat-Lösung im Verhältnis 2 : 6 : 3 erhielt man die Antibiotika-Mischung. Die Fraktionen (10 1) mit dem darin enthaltenden Antibiotikum wurden unter reduziertem Druck bei 35 C bis zur Trockne konzentriert.
Das Pulver wurde mit Methanol trituriert. der Methanol-lösliche Anteil wurde unter reduziertem Druck konzentriert und ergab eine feste Substanz (50 mg).
Hextamycin A und Hextamycin B wurden dann durch eine präparative Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) auf einer "reversed phase"-Säule mit Octadecyldimethyl-silyliertem Silicagel mit Methanol/Acetonitril/0, 2% Natriumhydrogenphosphat im Verhältnis 4 : 3 : 3 als Eluent voneinander getrennt. Die mit zwei getrennten Peaks eluierten beiden Antibiotika wurden getrennt gesammelt und unter reduziertem Druck bei 35 C jeweils bis zur Trockne konzentriert. Die Pulver wurden jeweils mit Methanol trituriert, der Methanol-lösliche Anteil wurde konzentriert, erneut in Chloroform gelöst und durch Zusatz von Petroläther (Sdp. 60 bis 80 C) ausgefüllt. Durch dieses Verfahren wurden aus 50 mg Gemisch 5 mg Hextamycin A und 3 mg Hextamycin B als farblose feste Substanzen erhalten.
Eigenschaften von Hextamycin A
Physikochemische Eigenschaften :
Farbe : farblos
Löslichkeit : in Wasser unlöslich, löslich in Methanol, Aceton, Dimethylformamid UVmax : keine selektive Absorption.
Eigenschaften von Hextamycin B Physikochemische Eigenschaften :
Farbe : farblos Löslichkeit : unlöslich in Wasser, löslich in Methanol, Aceton, Dimethylformamid UVmax : keine selektive Absorption.
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Tabelle 2 Minimale Hemmkonzentration vom Hextamycin B (MHK in I1g/ml)
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<tb>
<tb> Nr. <SEP> Test-Mikroorganismus <SEP> MHK <SEP> (l1g/ml)
<tb> 1. <SEP> S. <SEP> aureus <SEP> 209 <SEP> P <SEP> 0, <SEP> 00003 <SEP>
<tb> 2. <SEP> S. <SEP> aureus <SEP> 20240 <SEP> 0, <SEP> 00012 <SEP>
<tb> 3. <SEP> S. <SEP> aureus <SEP> E-88 <SEP> (MethR+) <SEP> 0, <SEP> 00006 <SEP>
<tb> 4. <SEP> S. <SEP> aureus <SEP> 3066 <SEP> (Meth <SEP> R+) <SEP> 0, <SEP> 00006 <SEP>
<tb> 5. <SEP> S.
<SEP> aureus <SEP> 20424 <SEP> (MethR+ <SEP> ) <SEP> 0,016 <SEP>
<tb> 6. <SEP> S. <SEP> aureus <SEP> 20666 <SEP> (Meth <SEP> R+) <SEP> 0, <SEP> 00006 <SEP>
<tb> 7. <SEP> Str. <SEP> faecalis <SEP> 0, <SEP> 00025 <SEP>
<tb> 8. <SEP> Str. <SEP> D. <SEP> Eder <SEP> 0, <SEP> 00025 <SEP>
<tb> 9. <SEP> B. <SEP> megaterium <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP>
<tb> 10. <SEP> Micrococcus <SEP> luteus <SEP> 0, <SEP> 00025 <SEP>
<tb> 11. <SEP> Ess <SEP> 2231 <SEP> 0, <SEP> 0625 <SEP>
<tb> 12. <SEP> E. <SEP> coli <SEP> 9632 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> 13. <SEP> E. <SEP> coli <SEP> 20683 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> 14. <SEP> Pr. <SEP> vulgaris <SEP> 0, <SEP> 0625 <SEP>
<tb> 15. <SEP> Pr. <SEP> rettgeri <SEP> 21207 <SEP> 0, <SEP> 0625 <SEP>
<tb> 16. <SEP> Ent. <SEP> cloacae <SEP> P-99 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> 17. <SEP> Alcaligenes <SEP> faecalis <SEP> 0, <SEP> 0625 <SEP>
<tb> 18.
<SEP> Citrobacter <SEP> sp. <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> 19. <SEP> Serr. <SEP> mar. <SEP> 20460 <SEP> 0, <SEP> 0625 <SEP>
<tb> 20. <SEP> Sal. <SEP> typhimurium <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> 21. <SEP> Kl. <SEP> pneu. <SEP> 1976 <SEP> E <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> 22. <SEP> Ps. <SEP> aeruginosa <SEP> 0, <SEP> 0625 <SEP>
<tb> 23. <SEP> Ps. <SEP> a. <SEP> M-35 <SEP> 0, <SEP> 0625 <SEP>
<tb> 24. <SEP> Ps. <SEP> a. <SEP> 1592 <SEP> E <SEP> 0, <SEP> 0625 <SEP>
<tb> 25. <SEP> Ps. <SEP> a. <SEP> 20897 <SEP> 0, <SEP> 0625 <SEP>
<tb> 26. <SEP> Ps. <SEP> a. <SEP> 20653 <SEP> 0, <SEP> 625 <SEP>
<tb> 27. <SEP> Ps. <SEP> a. <SEP> 80 <SEP> 0, <SEP> 0625 <SEP>
<tb> 28. <SEP> Ps. <SEP> a. <SEP> J-61 <SEP> 0, <SEP> 0312 <SEP>
<tb> 29. <SEP> Ps. <SEP> a. <SEP> J-62 <SEP> 0, <SEP> 0625 <SEP>
<tb> 30. <SEP> Ps. <SEP> a.
<SEP> NCrC <SEP> 10701 <SEP> 0, <SEP> 125 <SEP>
<tb>
Man kann aus diesen Daten ersehen, dass Hextamycin A und Hextamycin B sich von andern, aus der Literatur bekannten Antibiotika unterscheiden, und dass die antibiotische Wirksamkeit der erfindungsgemässen Verbindungen aussergewöhnlich hoch ist.
Die erfindungsgemässen Verbindungen zeigen auch eine hohe zytotoxische Wirkung gegen Leukämie- und Karzinomzellen wie aus den folgenden experimentellen Daten hervorgeht (getestet wurde ein Gemisch von 80% Hextamycin A und 20% Hextamycin B).
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A) Zytotoxozität gegen L 1210 Leukämiezellen
Experimentelles Vorgehen :
Der Test wurde entsprechend der von Hamburger und Salmon beschriebenen Methodik mit den unten beschriebenen Modifikationen durchgeführt.
Konditioniertes Medium wurde durch McCoy 5A Medium (s. Iwakata, S. J. T. Grace, N. Y.
State J. Med. 64,2279 [1964]) ersetzt. Als Folge der hohen Klonierungsrate der L1210 Leukämiezellen in Soft Agar wurde die Anzahl an Tumorzellen pro Platte auf 5 x 102 reduziert.
Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen der Testsubstanz für 1 h bei
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von Hamburger und Salmon ausplatiert.
Zusätzliche Parallelexperimente wurden unter Verwendung einer kontinuierlichen Inkubationszeit durchgeführt, wobei unterschiedliche Konzentrationen der Testsubstanz der oberen Agarschicht vor Ausplatieren der Zellen zugemischt wurden.
Die Platten wurden in einem Brutschrank mit 5% C02, 20% 02 und 95% relativer Luftfeuchte für 5 bis 7 Tage inkubiert. Nach dieser Zeit wurden Kolonien mit einem Durchmesser ' 60 ,um mit Hilfe eines Invertoskopes gezählt.
Die Ergebnisse wurden angegeben als prozentualer Anteil der Kolonien in behandelten versus unbehandelten Gruppen. Der Variationskoeffizient, bei wiederholten Experimenten war kleiner als 15%.
Resultate :
Aus der Dosis-Wirkungskurve wurde die IC 50 für die kontinuierliche und einstündige Inkubation bestimmt (Tabelle 3).
Tabelle 3 ICg ( (ig/ml)
Stamm-Zell-Assay
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<tb>
<tb> Kontinuierliche <SEP> Inkubation <SEP> 1 <SEP> h <SEP> Inkubation
<tb> 6, <SEP> 7 <SEP> x <SEP> 19-6 <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> x <SEP> 10 <SEP>
<tb>
B) In vivo-Wirksamkeit gegen L 1210-Leukämie, B 16 Melanom und Lewis Lung Adenocarcinom Methodik : L1210 : Tumorzellpräparation :
Aszites Flüssigkeit wird 7 Tage nach Implantation unter sterilen Bedingungen aus
DBA2 Mäusen entnommen (weiblich, 18 bis 20 g). Die Aszites Flüssigkeit wird dreimal mit PBS (= phosphatgepufferte Salzlösung, enthaltend in 100 ml etwa 150 mM Na- triumchlorid und etwa 150 mM Natriumphosphat) gewaschen, gezählt und anschliessend in PBS verdünnt bis zu einer Endkonzentration von 106 Zellen pro 0, 2 ml.
Tumortransfer :
106 Zellen in 0, 2 ml PBS werden DBA2 Mäusen (weiblich, 18 bis 20 g) intraperitoneal appliziert. Dieser Transfer wird einmal wöchentlich wiederholt.
Transfer zur antitumoralen Testung :
105 Zellen in 0, 2 ml PBS werden BDF1 Mäusen (weiblich, 18 bis 20 g) intraperitoneal appliziert. 6 Tiere pro Gruppe werden für jede Substanzkonzentration sowie für die Kontrolle eingesetzt.
B16 Melanom und Lewis Lung Adenokarzinom : Tumoraufarbeitung :
Der subcutan wachsende solide Tumor wird unter sterilen Bedingungen 14 bis 18 Tage nach Implantation in C57B1/6 Mäusen (weiblich, 18 bis 20 g) entnommen. Der Tumor wird kleingeschnitten und mit Kollagenase (0, 05%) bei 37 C für 1 h behandelt.
Die entstehende Einzelzellsuspension wird dreimal mit PBS gewaschen, gezählt und
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schliesslich auf eine Endkonzentration von 106 Zellen/0, 2 ml verdünnt.
Tumortransfer :
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alle 14 Tage subkutan injiziert, um so die Zellinie in Passage zu erhalten.
Transfer zur antitumoralen Testung :
106 Zellen in 0, 2 ml PBS werden BDF1 Mäusen (weiblich, 18 bis 20 g) intraperitoneal appliziert. 6 Tiere pro Gruppe werden für jede Substanzkonzentration und für die
Kontrolle eingesetzt.
Ermittlung des antitumoralen Effektes : a) Die Tiere werden an Tag 1 und Tag 5 nach Tumorzellimplantation gewogen. Gewichtsver- lust von mehr als 20% an Tag 5 wird als Indikator eines toxischen Substanzeffektes verwendet. b) Am Ende des Experimentes (Tod aller Tiere oder Erreichen von Tag 60) wird die mediane Überlebenszeit der Behandlungsgruppen bestimmt, sofern diese > 65% überlebende Tiere am Tag 5 enthielten. Die Ermittlung der medianen Überlebenszeit erfolgt entsprechend der Formel :
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In dieser Formel bedeutet X den frühesten Tag, an dem die Zahl der überlebenden
Tiere < N/2 (N = Anzahl der Versuchstiere) und y den frühesten Tag, an dem die Zahl der überlebenden Tiere < (N/2) -1 ist. In dem Fall, dass N eine ungerade Zahl ist, entspricht die mediane Überlebenszeit dem Zeitpunkt X.
Die mediane Überlebenszeit wird ausschliesslich für im Verlauf des Experimentes sterbende
Tiere bestimmt. Geheilte Tiere (LTS) werden von der Bestimmung der medianen Überlebens- zeit ausgeschlossen und getrennt aufgeführt.
Aus der medianen Überlebenszeit der behandelten (MST T) und Kontrollgruppen (MST wird der antitumorale Effekt (T/C) entsprechend der Formel
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bestimmt. T/C-Werte von mehr als 125% werden als Indikator einer signifkanten antitumoralen Wirksamkeit der Testverbindungen angesehen. Die Dosis, die den grössten antitumoralen Effekt bewirkt (optimale Dosierung) sowie jeweils eine Dosierung oberhalb und unterhalb dieser Dosierungsstufe werden in Tabelle 4 zusammengefasst. Lebende Tiere am Tag 60 werden als geheilt betrachtet (LTS).
Behandlungsplan :
3mal i. p./i. p. jeden dritten Tag, beginnend am Tag 1 nach Tumorimplantation.
Tabelle 4
L 1210
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<tb>
<tb> Optimale <SEP> Dosis <SEP> Toxische
<tb> T/C <SEP> (I1g/kg/lnj) <SEP> LTS <SEP> Todesfälle
<tb> 117 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 2/6 <SEP> 0/6
<tb> 139 <SEP> 5, <SEP> 3 <SEP> 1/6 <SEP> 0/6
<tb> 148 <SEP> 9,4 <SEP> - <SEP> 2/6
<tb>
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von Tumoren verwendet werden. Die Verbindungen können auf verschiedene Weise in Abhängigkeit von der Dosierungsform verabreicht werden.
Normalerweise werden die Verbindungen oder ihre Säureadditionssalze, z. B. mit D-Gluconsäure, mit pharmazeutisch üblichen Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln vermischt verabreicht. So können sie z. B. einzeln oder in Mischung zusammen mit Trägerstoffen wie Maltose oder Lactose oder als nichttoxische Komplexe, z. B. als Desoxyribonucleinsäure-Komplex, verabreicht werden.
Eine typische Verabreichungsart ist die Injektion einer Lösung der erfindungsgemässen Verbindungen in destilliertem Wasser oder in physiologischer Kochsalzlösung. Die Lösungen können intraperitoneal, intravenös oder intraarteriell injiziert werden.
Tagesdosis und Einheitsdosis können aus Tierversuchen und auch aus in vitro-Tests in der Weise festgesetzt werden, dass die Gesamtdosis, die kontinuierlich oder in Abständen verabreicht wird, einen vorher festgelegten Bereich nicht überschreitet. So beträgt die Gesamtdosis für einen Behandlungszyklus etwa 0, 5 bis 5 mg/kg Körpergewicht. Diese Dosis kann in entsprechenden Bruchteilen über einen Zeitraum von 7 Tagen verabreicht werden. Es ist jedoch klar, dass konkrete Dosen für die Behandlung von Mensch oder Tier individuell festgelegt werden
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kamenten, körperlichem Zustand der Patienten und Schwere der Erkrankung.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Neue antibiotisch wirksame Verbindungen Hextamycin A und Hextamycin B, dadurch gekennzeichnet, dass sie hergestellt werden durch Kultivieren des Mikroorganismus-Stammes Micromonospora species Y-82. 20012 (DSM 3777), seiner Varianten oder Mutanten, unter aeroben Bedingungen in einem üblichen Nährmedium, gegebenenfalls in Gegenwart von Inhibitoren von Antibiotika-abbauenden Enzymen, Isolierung der Verbindungen aus der Kulturbrühe und dem Myzel durch Extraktion mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln und anschliessende Trennung und Reinigung der Verbindungen aus dem Lösungsmittel-Extrakt durch chromatographische Methoden.
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