DE60004669T2

DE60004669T2 - Indolocarbazolalkaloide aus einer marinen actinomycete

Info

Publication number: DE60004669T2
Application number: DE60004669T
Authority: DE
Inventors: Dolores Garcia Gravalos; Julia Onzonilla PEREZ; Librada Maria Onzonilla CANEDO; Francisco Onzonilla ROMERO; Fernando Onzonilla ESPLIEGO
Original assignee: Instituto Biomar SA
Current assignee: Instituto Biomar SA
Priority date: 1999-06-28
Filing date: 2000-06-28
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2020-06-29
Also published as: EP1189908A1; ATE247662T1; MXPA02000173A; AU5554400A; CA2377147A1; CN1152881C; PT1189908E; KR20020037730A; US6852715B1; CN1371379A; AU775414B2; DK1189908T3; DE60004669D1; EP1189908B1; ES2202142T3; BR0012457A; GB9915069D0; JP2003503412A; WO2001000627A1; IL147307A0

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Neue Indolocarbazolalkaloide sind aus der Kulturbrühe einer Staurosporin erzeugenden Actinomycete (CLCO-002) isoliert worden. Ihre Herstellung durch aerobe Fermentierung des Stamms unter kontrollierten Bedingungen und die Isolierung und Reinigung der Verbindungen werden hier beschrieben. Die Verbindungen und die Fermentierungsbrühe demonstrieren signifikante Aktivität gegen mehrere Krebszell-Linien.
HINTERGUND DER ERFINDUNG
Die Isoenzymfamilie der Proteinkinase C (PKC) spielt eine Schlüsselrolle in der Signalübertragung und Zellregulierung (Y. Nishizuka, 1988). Aus der Beobachtung, daß die Tumor fördernden Phorbolester imstande sind, PKC-Aktivität zu stimulieren (Y. Nishizuka, 1984), wurde geschlossen, daß Inhibitoren dieses Enzyms für Krebs-Chemotherapie verwendbar sein könnten. PKC-Inhibitoren sind als potentielle Arzneimittel für die Behandlung von Krebs eingehend untersucht wurden.
WO 94/04541 offenbart Indolocarbazolalkaloide, von denen einige Proteinkinase-Inhibitoren sind. Die Verbindungen, ebenso wie bekannte Alkaloide, wie beispielsweise Staurosporin, können mit Verbindungen vom Taxol-Typ kombiniert werden und sind bei der Behandlung von Krebs verwendbar.
JP-A-5-247055 offenbart Staurosporin-Derivate, die durch Umsetzen von Staurosporin mit einem Alkoxycarbonylierungsmittel erhältlich sind. Die Verbindungen sind als Verstärker für Anti-Ulcus-Wirkung verwendbar.
Meyer et a1., Int. J. Cancer, 43, 851-856 (1989) offenbaren Staurosporin-Derivate, erhältlich durch Fermentierung, bei welchen die Methylaminogruppe und, gegebenenfalls, das Pyrrolidinylstickstoffatom derivatisiert ist.
Die US-Patentschrift 5093330 offenbart N-substituierte Staurosporin-Derivate, die durch herkömmliche Alkylierung oder Acylierung von Staurosporin erhältlich sind. Diese Verbindungen sind selektive Inhibitoren von Proteinkinase C.
Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Antitumormittel bereitzustellen; diese Verbindungen sind Alkaloide mit signifikanter Aktivität gegen mehrere Krebszell-Linien.
Noch eine andere Aufgabe dieser Erfindung ist es, pharmazeutische Zusammensetzungen unter Verwendung der hier beschriebenen aktiven Verbindungen zur Verabreichung an einen Patienten bereitzustellen, der einer Behandlung bedarf.
Mikrobielle Produkte sind interessant, weil ihre industrielle Herstellung zur gegenwärtigen Zeit gut eingeführt ist. Deshalb ist eine andere Aufgebe dieser Erfindung auf die Herstellung der aktiven Verbindungen und auf ihre Isolierung und Reinigung aus der entstehenden Fermentierungsbrühe gerichtet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung stellt Verbindungen der Formel (1),
wobei:
R' ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist; und
R² ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Alkoxygruppe
mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist;
und pharmazeutisch verträgliche Salze davon bereit.
In den Definitionen der Gruppen R¹ und R² in Formel (1) sind die Alkylgruppen und die Alkyleinheit der Alkoxygruppen eine gerad- oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Neopentyl und Hexyl.
Es wird bevorzugt, daß R' und R² unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, insbesondere ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe, darstellen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung 4'-N-Methyl-5'-hydroxystaurosporin (IB-97224) und 5'-Hydroxystaurosporin (IB-97225), mit den Strukturformeln:
In dieser Erfindung wird auch das Verfahren zum Erhalten von Verbindungen der Formel (1) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon beschrieben. Das Verfahren umfaßt Kultivieren eines Stammes eines Mikroorganismus, der imstande ist, eine Verbindung der Formel (1) zu erzeugen, Gewinnen der Verbindung der Formel (1) aus der Kulturbrühe und, gegebenenfalls, Bilden des Salzes der gewonnenen Verbindung.
Ein speziell bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der Verbindungen IB-97224 und IB-97225 umfaßt Kultivieren eines Stammes eines Mikroorganismus, der imstande ist, IB-97224 und IB97225 in einem wässerigen Nährmedium mit assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Salzen unter kontrollierten submersen aeroben Bedingungen zu erzeugen. Die Verbindungen IB-97224 und IB-97225 werden aus der Kulturbrühe gewonnen und gereinigt.
Die bevorzugte Kultur ist der Stamm CLCO-002, und seine chemischen, biochemischen und morphologischen Eigenschaften zeigen, daß er zu der Actimomycetales-Gruppe gehört. Andere Actinomycetenstämme können in dem Verfahren gemäß der Erfindung ebenfalls verwendet werden.
Wie vorstehend beschrieben wurde gefunden, daß die Verbindungen der Formel (1), speziell IB-97224 und IB-97225, gute Aktivität gegen murine und humane Tumorzell-Linien, einschließlich P-388D₁, HT-29, A-549 und SK-MEL-28, haben.
Deshalb betrifft die Erfindung ferner die Verwendung einer Verbindung der Formel (1), wie vorstehend definiert, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe von malignen Tumoren bei einem Säugetier.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen, die als aktiven Bestandteil Verbindungen der Formel (1), oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten, ebenso wie die Verfahren für ihre Zubereitung.
Beispiele pharmazeutischer Zusammensetzungen schließen einen beliebigen Feststoff (Tabletten, Pillen, Kapseln, Körnchen usw.) oder eine Flüssigkeit (Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen) mit geeigneter Zusammensetzung für orale, topische oder parenterale Verabreichung ein, und sie können die reinen Verbindungen oder diese in Kombination mit einem beliebigen Träger oder anderen pharmazeutisch aktiven Verbindungen enthalten. Diese Zusammensetzungen können steril sein müssen, wenn sie parenteral verabreicht werden.
Die korrekte Dosierung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Wunsch variiert entsprechend der speziellen Formulierung, der Art der Verabreichung und dem speziellen Situs, dem Wirt und den Bakterien oder dem Tumor, der behandelt wird. Andere Faktoren, wie Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Ernährung, Zeit der Verabreichung, Geschwindigkeit der Ausscheidung, Zustand des Wirts, Arzneimittelkombinationen, Reaktionsempfindlichkeiten und Schwere der Erkrankung, sollen in Betracht gezogen werden. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch innerhalb der maximal tolerierten Dosis ausgeführt werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG DER ERZEUGENDE ORGANISMUS
Der Mikroorganismus, der für die Erzeugung dieser neuen Verbindungen verwendet wird, ist vorzugsweise ein Actinomycetestamm, insbesondere der Actinomycetestamm CLCO-002, von dem eine Kultur in der Coleccion Espanola de Cultivos Tipo an der Universität von Valencia, Spanien, unter der Zugangsnummer CECT-3347 hinterlegt worden ist. Diese Hinterlegung ist nach den Vorschriften des Budapester Vertrages gemacht worden und alle Einschränkungen über deren Verfügbarkeit für die Öffentlichkeit werden bei Erteilung eines Patents auf diese Anmeldung unwiderruflich aufrechterhalten.
Der Organismus wurde aus einem nicht identifizierten Meeresschwamm, gesammelt in den Gewässern der Kanarischen Inseln, isoliert.
Alle Kulturen wurden bei 27°C inkubiert und Aufzeichnungen der Ergebnisse wurden wöchentlich bis zu 21 Tagen gemacht.
Eine Beschreibung des Organismus ist wie folgt:
MORPHOLOGIE
Die für diese Untersuchung verwendeten Kulturmedien waren die ISP-Medien Nr. 2, 4, 5 und 6 (Shirling und Gotlieb, 1966), das ATCC-Medium Nr. 172 (American Type Culture Collection Catalog, 1989), Czapek Agar (Atlas, 1993), Bennet Agar (Atlas, 1993), 1,5% Water Agar (Luedemann). Alle Medien wurden mit 50% künstlichem Seewasser ergänzt. Nach 21 Tagen bei 28°C wurde das Wachstum untersucht. Es wurden verschiedene Farbtöne von orange beobachtet. Es wurde kein Luftmyzel gebildet. Das Substratmyzel war verzweigt. Es wurde kein lösliches Pigment beobachtet.
PHYSIOLOGISCHE EIGENSCHAFTEN
Für Untersuchungen der Nutzung von Kohlenstoff und Stickstoff wurde ISP-9 verwendet (Shirling & Gotlieb, 1966). Wegen der geringen Wachstumsgeschwindigkeit von CLCO-002 unter dem definierten Medium zeigten die Tests der Nutzung von Kohlenstoff und Stickstoff verbleibendes Wachstum, so konnten keine klaren Ergebnisse erhalten werden. Die NaCl-Resistenz wurde unter Verwendung des Mediums ATTC's 172, enthaltend zunehmende Konzentrationen von NaCl, bestimmt. Die optimale Konzentration von Salz war 1%. Mit 7% Salz wurde kein Wachstum beobachtet.
Chemische Zusammensetzung der Zelle AMINOSÄUREN:
Diaminopimelinsäure wurde nach dem Verfahren von Hasegawa et al. (1983) bestimmt. Das meso-2,6-Diaminopimelinsäure-Isomer war in dem gesamten Zellhydrolysat des Stamms CLCO-002 vorhanden.
FETTSÄUREN:
Die FAMEs wurden nach dem Verfahren von Van der Auwera et al. (1986) bestimmt. Die FAME-Zusammensetzung ebenso wie der Vergleich mit anderen ähnlichen Stämmen ist in Tabelle 1 beschrieben.
Wenn auch der hinterlegte Organismus klar bevorzugt wird, ist die vorliegende Erfindung nicht auf diesen besonderen Stamm oder die Organismen eingeschränkt oder begrenzt. Es ist die Absicht der Erfinder, alle anderen erzeugenden Organismen, Stämme oder Mutanten in den Schutzumfang dieser Erfindung einzubeziehen.
CLCO-002 = Stamm CLCO-002; AMCITRE = Actinomadura citrea DSM 43461; AMPDIGIT = Ampullariella digitata ATCC 15349; AMROSEO = Actinomadura roseoviolacea DSM 43144; AMYORIE = Amycolatopsis orientalis DSM 40040; APBRAZIL = Actinoplanes braziliensis ATCC 25844; MNCHALC = Micromonospora chalcea ATCC 31395; MNECHCA = Micromonospora echinospora calichinensis NRRL 15839; MNFUSCA = Micromonospora fusca NRRL B-3298; MTFERRU = Microtetraspora ferruginea DSM 43553; MTROSEO = Microtetraspora roseola ATCC 33579; MTRUBRA = Microtetraspora rubra ATCC 27031; MTSALMO = Microtetraspora salmonea ATCC 33580; NOAFRI = Nocardiopsis africana DSM 43748; SACCAER = Saccharothrix aerocolonigenes NRRL B-3298; SPAMETH = Streptosporangium amethystogenes DSM 43179; SPVIRIDO = Streptosporangium viridogriseum ATCC 25242; STALBUS = Streptomyces albus DSM 40313
FERMENTIERUNG
Der Stamm CLCO-002, wenn unter kontrollierten Bedingungen in einem geeigneten Medium kultiviert, erzeugt die Verbindungen IB-97224 und IB-97225. Dieser Stamm wird in einem wässerigen Nährmedium unter groben und mesophilen Bedingungen vorzugsweise zwischen 22°C und 35°C bei einem pH im Bereich zwischen 6,0 und 8,0 gezüchtet. Eine breite Vielfalt von flüssigen Kulturmedien kann für die Kultivierung des Organismus verwendet werden, verwendbare Medien sind diejenigen, die eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, wie beispielsweise Stärke, Dextrin, Zuckermelasse, Glycerin, Glucose und dergleichen, eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie beispielsweise Proteine, Proteinhydrolysate, entfettete Mehle, Maisquellflüssigkeit und dergleichen, und verwendbare anorganische Anionen und Kationen, wie beispielsweise Natrium, Magnesium, Kalium, Ammonium, Sulfat, Chlorid, Phosphat, Carbonat und dergleichen, einschließen. Spesenelemente können ebenfalls hinzugefügt werden. Belüftung wird vorzugsweise durch Zuführung von Luft in das Fermentierungsmedium erreicht. Bewegung wird durch einen mechanischen Impeller bereitgestellt. Es wurde gefunden, daß herkömmliche Fermentierungstanks für die Ausführung der Kultivierung dieses Organismus gut geeignet sind. Die Zugabe von Nährstoffen und pH-Kontrolle ebenso wie die von Antischaummitteln während der verschiedenen Stufen der Fermentierung kann zur Vergrößerung der Produktion und zur Vermeidung von Schäumen benötigt werden.
Die erforderlichen Schritte, die für die Erzeugung dieser Verbindungen durch den bevorzugten Organismus benötigt werden, sind:
Man beginne mit gefrorenem oder lyophilisiertem Myzel. Man erhalte Myzelmasse durch Kultivieren der Ausgangszellen in Schüttelkolben mit einem Kulturmedium, enthaltend einige der vorstehend beschriebenen Bestandteile, bei mesophilen Temperaturen und unter aeroben Bedingungen, dieser Schritt kann, wie benötigt, mehrere Male wiederholt werden, und das gesammelte Material wird als Impfkultur verwendet, um einen oder mehrere Fermentierungstanks mit einem geeigneten Kulturmedium zu beimpfen, wenn gewünscht, können diese Tanks ebenfalls als Impfkultur verwendet werden, und dieser Schritt kann, wenn benötigt, mehrere Male wiederholt werden, oder sie können, abhängig von dem benötigten Volumen an Brühe, als Produktionsstufe verwendet werden. Die Produktionsstufe kann, abhängig von Stamm, Impfkulturstufen, Temperatur und anderen Bedingungen, von sehr wenigen Tagen bis zu mehr als einer Woche dauern. Sobald die Fermentierung ihr Maximum eneicht hat, kann die Ausbeute für die Isolierung der neuen Verbindungen geerntet werden.
Das Produktionsmedium kann unterschiedlich von dem sein, das als Impfkultur verwendet wird. In Tabelle 2 sind typische Medien beschrieben, die für Impfkultur und Erzeugung dieser neuen Verbindungen verwendet werden können: TABELLE 2
Die Herstellung dieser Verbindungen kann durch Prüfung der gesamten Nährbrühe gegen A-549 oder irgendeine andere empfindliche Zelle oder durch HPLC oder irgendein anderes Verfahren mit genügender Empfindlichkeit überwacht werden.
ISOLIERUNG VON IB-97224 UND IB-97225
Die Alkaloide IB-97224 und IB-97225 können aus dem Myzelkuchen durch Extraktion mit einem geeigneten Gemisch von Lösungsmittel, wie beispielsweise CHCl₃:CH₃OH:H₂O, isoliert werden. Die Aktivität ist in der unteren Schicht konzentriert. Die Extrakte von zwei wiederholten Extraktionen können vereinigt und im Vakuum zur Trockene eingedampft werden.
Abrennung und Reinigung von IB-97224 und IB-97225 aus dem rohen aktiven Extrakt kann durch die Verwendung der richtigen Kombination von herkömmlichen chromatographischen Techniken durchgeführt werden.
Die Fraktionierung kann durch die Antitumoraktivität der Fraktionen oder durch TLC, sichtbar gemacht mit Vanillin in konz. H₂SO₄, oder analytische HPLC mit Photodiodenarray-Detektor geführt werden. HPLC-Analyse wird bei Raumtemperatur durchgeführt (Waters RCM 8×10, 8C18 10-μm-Patrone), indem als mobile Phase Acetonitril-Natriumhydrogenphosphat 0,025 M pH=3 (75:25) und eine Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min verwendet werden und bei 290 nm aufgetragen wird. Verbindungen von Interesse zeigten Retentionszeiten von 3,92 und 3,29 Minuten für IB-97224 bzw. IB-97225.
Die nachfolgend angegebenen Spektralwerte ermöglichen, daß die Verbindungen als IB-97224 und IB-97225 identifiziert werden. Die verschiedenen Atome sind unter Verwendung des nachstehend angegebenen Numerierungssystems numeriert. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:
IR-Spektren: w: schwach; m: mittel; s: stark; br: breit.
NMR-Spektren: s: Singulett; d: Dublett; t: Triplett; dd: Dublett von Dubletts.
4'-N-Methyl-5'-hydroxystaurosporin (IB-97224) (R²=Me)
IR (KBr) υ_max/cm^–1: 3406 (s, br), 3070 (m), 2925 (s), 2852 (m), 1915 (w, br), 1664 (s), 1583 (s), 1450 (m), 1415 (m), 1391 (s), 1351 (s), 1319 (s), 1281 (s), 1249 (s), 1236 (m), 1223 (m), 1181 (m), 1150 (m), 1117 (s), 1103 (s), 1066 (s), 1018 (m), 988 (m), 887 (w), 835 (w), 816 (w), 742 (s), 698 (w), 664 (w), 636 (w), 609 (w).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃), δ/ppm: 9,43 (1H, d, J 7,7 Hz, C4H), 7,90 (1H, d, J 7,7 Hz, C8H), 7,76 (1H, d, J 7,7 Hz, C11H), 7,64 (1H, d, J 7,7 Hz, C1H), 7,53(1H, t, J 7.7Hz, C2H, 7,45(1H,t, J7,7 Hz, C10H), 7,38 (1H, t, J 7,7 Hz, C3H), 7,34 (1H, t, J 7,7 Hz, C9H), 6,52 (1H, s, C6'H), 6,50 (1H, s, N6H), 4,99 (1H, s, C7H), 4,43 (1H, d, J 9,9 Hz, C5'H), 3,95 (1H, s, C3H), 3,02 (1H, d, J 9,9 Hz, C4'H), 2,48 (3H, s, CH ₃), 2,37 (6H, s, N4' (CH ₃)₂), 2,03 (3H, s, CH ₃O).
¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃), 173,65 (C5), 137,86 (C11a), 137,12 (C13a), 131,94 (C7a), 130,64 (C12a), 126,79 (C12b), 126,13 (C4), 125,46 (C2), 124,94 (C10), 124,54 (C7c), 123,22 (C4a), 121,49 (C8), 120,43 (C9), 119,98 (C3), 118,89 (C4c), 115,86 (C4b), 114,14 (C7b), 111,46 (C11), 108,97 (C1), 94,92 (C2'), 91,54 (C6'), 79,30 (C3'), 69,50 (C5'), 66,75 (C4'), 58,36 (CH₃O), 45,79 (C7), 41,67 (N4'(CH₃)₂), 28,00 (CH₃).
UV (75:25 CH₃CN/0,025 M Na₂HPO₄ pH3), λ_max/nm: 370, 354, 334, 320, 291, 242, 206.
m/z (Fast Atom Bombardment (Beschuß mit schellen Elektronen)) 497,2 (MH⁺).
5'-Hydroxystaurosporin (IB-97225) (R²=H)
IR (KBr) υ_max/cm^–1: 3415 (s, br), 3070 (m), 2931 (m), 2851 (m), 1991 (w, br), 1664 (s), 1583 (m), 1453 (s), 1416 (m), 1392 (m), 1352 (s), 1317 (s), 1280 (m), 1248 (m), 1236 (m), 1225 (m), 1151 (m), 1130 (m), 1118 (m), 1064 (m), 1036 (m), 1017 (m), 973 (w), 927 (w), 896 (w), 860 (w), 836 (w), 814 (w), 772 (m), 746 (s), 651 (w), 638 (w).
¹H-NMR 300 MHz, CDCl₃), δ/ppm: 9,40 (1H, d, J 7,4 Hz. C4H), 7,89 (1H, d, J 7,4 Hz, C8H), 7,85 (1H, d, 7,4, C11H, 7,53 (1H, d, J 8,1 Hz, C1H), 7,44 (2H, t, J 7,4 Hz, C2H & C10H), 7,31 (2H, t, J 7,4 Hz, C3H & C9H, 6,49 (1H, d, J 1,2 Hz, C6'H), 6,43 (1H, s, N6H, 4,98 (1H, s, C7H), 4,26 (1H, dd, J 6,8 Hz, 1,2 Hz, C5'H), 4,14 (1H, d, J 2,8 Hz, C3'H), 3,09 (1H, dd, J 6,8 Hz, 2,8 Hz, C4'H), 2,71 (3H, s, CH ₃O), 2,45 (3H, s, CH ₃ ), 2,17 (3H, s, CH ₃N4').
¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃), δ/ppm: 173,81 (C5), 138,86 (C11a), 137,05 (C13a), 132,17 (C7a), 130,50 (C12a), 126,89 (C12b), 126,13 (C4), 125,33 (C2), 124,67 (C10), 124,52 (C7c), 123,24 (C4a), 121,01 (C8), 120,32 (C9), 119,92 (C3), 118,56 (C4c), 115,64 (C4b), 114,19 (C7b), 113,50 (C11), 108,10 (C1), 92,37 (C2'), 88,38 (C6'), 80,14 (C3'), 70,03 (C5'), 60,11 (C4'), 59,02 (CH₃O), 45,88 (C7), 33,68 (CH₃N4'), 28,96 (CH₃).
UV (75:25 CH₃CN/0,025 M Na₂HPO₄ pH 3), λ_max/nm: 370, 354, 334, 320, 291, 242, 206.
m/z (Fast Atom Bombardment) 483,2 (MH⁺).
BIOLOGISCHE AKTIVTTÄT
Die Antitumor-Aktivitäten von IB-97224 und IB-97225 sind in vitro in Zellkulturen von Mäuseleukämie P-388D, humanem Lungenkarzinom A-549, humanem Kolonkarzinom HT-29 und humanem Melanom SK-MEL-28 bestimmt worden. Das Verfahren wurde unter Verwendung der Methodik durchgeführt, die von Bergeron et al. (1984) und von Schroeder et al. (1981) beschrieben ist.
Die vorliegende Erfindung wird mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, welche das Verständnis der vorliegenden Erfindung unterstützen, aber welche nicht als deren Begrenzungen ausgelegt werden sollen. Alle hier berichteten Prozentsätze sind, wenn nicht anderweitig festgelegt, durch das Gewicht dargestellt. Alle Temperaturen sind in °C ausgedrückt. Alle Inkubationen werden bei 28°C durchgeführt und die Kolben werden in einem Umlaufrüttler geschüttelt. Alle Medien und Rezipienten sind steril und alle Kulturverfahren aseptisch.
BEISPIEL 1
Vorratskultur: Die gesamte Brühe einer reinen Kultur des Stamms CLCO-002 wird gefroren in 20% Glycerin aufbewahrt.
Impfkultur: Eine gefrorene Kultur oder eine gut gewachsene Schrägröhrchenkultur (5 Vol.-%) wird verwendet, um 100 ml des vorher beschriebenen Impfmediums, enthalten in einem 250-cm³-Schüttelkolben, zu beimpfen. Der Kolben wird während 48 h inkubiert. 500 ml des gleichen Mediums in einem 2-1-Erlenmeyerkolben werden mit 10% der Impfkultur der ersten Stufe geeimpft. Der Kolben wird während 48 Stunden inkubiert.
Fermentierung: Man beimpfe 50 l des schon beschriebenen Produktionsmediums in einem 75-l-Fermentierungstank mit 2,5 1 Impfkultur der zweiten Stufe. Die Fermentierung wird während 96 Stunden unter Rühren mit 400 U/min und einem Luftstrom von 0,5 V/V.M. ausgeführt.
Man überwache die Erzeugung von sekundärem Metabolit durch Prüfung der gesamten Brühe gegen A-549 oder durch HPLC.
Isolierung: 10 l der gesamten geernteten Brühe wurden filtriert, um die Biomasse und andere Feststoffe abzutrennen. Der Myzelkuchen wurde zweimal mit einem gemischten Lösungsmittel (2,4 l) aus CHCl₃:CH₃OH:H₂O (2:1:1) extrahiert, und die Aktivität wurde in der unteren Schicht konzentriert. Das organische Lösungsmittel wurde eingeengt und im Vakuum zur Trockene eingedampft, wobei sich 3,2 g roher Extrakt ergaben. Der Extrakt wurde auf einer Silicagel-"Vakuum-Flash"-Säule chromatographiert. Nach dem Waschen mit einem Gemisch von n-Hexan-Ethylacetat 1:1 wurde die Säule mit einem Ethylacetat-Methanol-Gradienten entwickelt. Der Fortschritt der Eluierung wurde auf Cytotoxizität gegen A-539-Zellen kontrolliert und durch TLC (Chloroform-Methanol 9:1) und analytische Umkehrphasen-HPLC-Photodiodenarray überwacht. Weitere Reinigung der aktiven Fraktionen (250 mg) wurde durch Säulenchromatographie auf Silicagel erreicht, und die Aktivität wurde mit Chloroform-Methanol 92:8 und 95:5 eluiert. Jede von diesen Fraktionen wurde auf einer Säule mit C18-Umkehrphase chromatographiert und mit Methanol-Wasser 65:35 eluiert, wobei sich 12 mg Staurosporin, 4 mg IB-97224 und 8 mg IB-97225 ergaben.
Biologische Aktivität: Die verwendeten Antitumorzellen waren P-388D, (Suspensionskultur eines lymphoiden Neoplasmas von DBA/2-Maus), A-549 (Monoschichtkultur eines humanen makrozytischen Lungenkarzinoms), HT-29 (Monoschichtkultur eines humanen Kolonkarzinoms) und SK-MEL-28 (Monoschichtkultur eines humanen Melanoms). P-388D₁-Zellen wurden in 16-mm-Vertiefungen mit 1×10⁴ Zellen pro Vertiefung in 1-ml-Aliquots von MEM SFCS, enthaltend die angegebene Konzentration von Arzneimittel, geimpft. Eine gesonderter Satz von Kulturen ohne Arzneimittel wurde als Kontrolle des Wachstums geimpft, um sicherzustellen, daß die Zellen in der exponentiellen Phase des Wachstums blieben. Alle Bestimmungen wurden doppelt ausgeführt. Nach drei Tagen Inkubation bei 37°C in 10-%-CO₂-Atmosphäre mit 98% Feuchtigkeit wurde die IC₅₀ berechnet, indem das Wachstum in Vertiefungen mit Arzneimittel mit dem Wachstum in Kontrollvertiefungen ohne das Arzneimittel verglichen wurde. A-549-, HT-29- und SK-MEL-28-Zellen wurden in 16-mm-Vertiefungen mit 2×104 Zellen pro Vertiefung in l-ml-Aliquots von MEM 1OFCS, enthaltend die angegebene Konzentration von Arzneimittel, geimpft. Ein gesonderter Satz von Kulturen ohne Arzneimittel wurde als Kontrolle des Wachstuns geimpft, um sicherzustellen, daß die Zellen in der exponentiellen Phase des Wachstums blieben. Alle Bestimmungen wurde doppelt ausgeführt. Nach drei Tagen Inkubation bei 37°C in 10-%-CO₂-Atmosphäre mit 98% Feuchtigkeit wurde die Vertiefung mit 0,1% Kristallviolett gefärbt. Die IC₅₀ wurde berechnet, indem das Wachstum in Vertiefungen mit Arzneimittel mit dem Wachstum in Kontrollvertiefungen ohne das Arzneimittel verglichen wurde.
In Tabelle 3 ist die Aktivität, ausgedrückt als IC₅₀ (μM), dargestellt.
TABELLE 3
ZITIERTE LITERATURSTELLEN
Die folgenden Literaturstellen sind hier zitiert worden und sie werden hiermit hierin durch Bezugnahme einbezogen.
Nishizuka Y., Nature 334: 661-665, 1988
Nishizuka Y., Nature 308: 693-698, 1984
Shirling B. E. und Gotlieb DSh., Inr. JSyst. Bacteriol. 16: 313-340, 1966
American Type Culture Catalog 17. Auflage, 1989. Rockville, Maryland, USA
Atlas R.M., Handbook of Microbiological Media, 1993 CRC Inc. Boca Raton, Florida, USA
Luedemann G. M., persönliche Mitteilung
Hasegawa 7., Takizawa M. und ., J. Gen. Appl. Microbiol. 29: 319-322, 1983
Van der Auwera P., Labbe M., Mayberry W.R., Ferguson K.P. und Lambe D.W. Jr., J. Microbiol. Methods 4: 265-275, 1986
Bergeron et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 121: 848-854, 1984
Schroeder et al., J. Med. Chem., 24: 1078, 1981.

Claims

Verbindungen der Formel (1):
wobei: R' ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist und R² ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist; und pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R' ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R' ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei R' ein Wasserstoffatom ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R² ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist.
Verbindung nach Anspruch 5, wobei R² ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 6, wobei R² ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe ist.
8. Verbindung nach Anspruch 1, wobei: R¹ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist und R² ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist.
Verbindung nach Anspruch 8, wobei: R¹ ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe ist und R² ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R' ein Wasserstoffatom ist und R² eine Methylgruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ und R² beide Wasserstoffatome sind.
Verfahren für die Herstellung einer Verbindung der Formel (1), wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 11, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, umfassend Züchten eines Stammes eines Mikroorganismus, der imstande ist, eine Verbindung der Formel (1) zu erzeugen, Gewinnen der Verbindung der Formel (1) aus der Kulturbrühe und, gegebenenfalls, Bilden des Salzes der gewonnenen Verbindung.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Mikroorganismus ein Actinomycetestamm ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Mikroorganismus der Actinomycetestamm CLCO-002 (CECT-3347) ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als aktiven Bestandteil eine Verbindung der Formel (1), wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 11, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
Verbindung der Formel (1), wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 11, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon zur Verwendung als Medikament.
Verwendung einer Verbindung der Formel (1), wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 11, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe von malignen Tumoren bei einem Säugetier.