MXPA02000173A - Nuevos alcaloides de indolocarbazola de un actinomiceto marino. - Google Patents
Nuevos alcaloides de indolocarbazola de un actinomiceto marino.Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
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- C07D498/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains four or more hetero rings
-
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Abstract
La invencion proporciona compuestos de la formula (1) en donde R1 es un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo que tiene 1 a 6 atomos de carbono o un grupo alcoxi que tiene 1 a 6 atomos de carbono; y R2 es un atomo de hidrogeno, un grupo arilo que tiene 1 a 6 atomos de carbono o un grupo alcoxi que tiene 1 a 6 atomos de carbono; y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. La invencion tambien se refiere a un proceso para obtener los compuestos, composiciones que los contienen y su uso terapeutico. Los compuestos despliegan excelente actividad contra lineas celulares de cancer de mamifero.
Description
NUEVOS ALCALOIDES DE INDOLOCARBAZOLA DE UN ACTINOMICETO MARINO
Campo de la Invención Nuevos alcaloides de indolocarbazola se han aislado del medio de cultivo de un actinomiceto que produce estaurosporina (CLCO-002. Su producción mediante la fermentación bajo condiciones controladas de la cepa, y el aislamiento y purificación de compuestos, se describen en la presente. Los compuestos y el medio de fermentación demuestran actividad significativa en contra de diversas líneas celulares de cáncer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La familia isoenzima de la quinasa C de proteína (PKC) juega un papel calve en la transducción de señal y regulación celular (Y.
Nishizuka, 1 988). De la observación que los esteres de forbol que promueven el tumor son capaces de estimular la actividad PKC (Y.
Nishizuka , 1 984), se concluyó que los inhibidores de esta enzima podrían ser útiles para la quimioterapia de cáncer. Los inhibidores de PKC se han investigado ampliamente como fármacos potenciales para el tratamiento de cáncer. De acuerdo con lo anterior, una meta de la presente invención es proporcionar nuevos agentes antitumorales; estos compuestos son alcaloides con actividad significativa en contra de diversas líneas celulares de cáncer. Todavía otro objetivo de esta invención es proporcionar
ti- A-é A*t-*- í- composiciones farmacéuticas para administrar a un paciente en necesidad del tratamiento utilizando los compuestos descritos en la presente . Los productos microbianos son interesantes debido a que su producción industrian se establece bien en los tiempos actuales. Por lo tanto, otro objetivo de esta invención es dirigirse a la producción de los compuestos activos y a su aislamiento y purificación del medio de fermentación resultante.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona los compuestos de la fórmula (1 ).
(D en donde: R1 es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo alcoxi que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; y R2 es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos
carbono o un grupo alcoxi que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En las definiciones de los grupos R1 y R2 en la fórmula (1 ), los grupos alquilo y la porción de alquilo de los grupos alcoxi son un grupo alquilo de cadena recta o ramificada que tiene de 1 a 6 átomos de carbono tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, ¡sobutilo, sec-butilo, tert-butilo, pentilo, neopentilo y hexilo. Se prefiere que R1 y R2 representen independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, particularmente un átomo de hidrógeno, un grupo metilo o un grupo etilo. En una modalidad particularmente preferida , la presente invención se refiere a 4'-N-metil-5'-hidroxiestaurosporina (IB-97224) y 5'-hidroxiestaurosporina (IB-97225), con fórmulas estructurales:
En esta invención el proceso para obtener los compuestos de la fórmula (1 ) o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, también se describe. El proceso comprende cultivar una cepa de un
sátJti&íßkjteA -.«.-sÉ. iaki . ? ^ i *. ~ í.
microorganismo capaz de producir un compuesto de la fórmula (1 ), recuperando el compuesto de la fórmula (1 ) del medio de cultivo, y, opcionalmente, salificar el compuesto recuperado. Un proceso especialmente preferido para producir los compuestos IB-97224 e IB-97225 comprende cultivar una cepa de un microorganismo capaz de producir IB-97224 e IB-97225 en un medio nutritivo acuoso con fuentes y sales de carbono y nitrógeno asimilables, bajo condiciones aeróbicas controladas sumergidas. Los compuestos IB-97224 e IB-97225 se recuperan y se purifican del medio de cultivo. El cultivo preferido es la cepa CLCO-002, y sus caracteres químicos, bioquímicos y morfológicos muestran que pertenece al grupo Actimomicetales. También pueden utilizarse otras cepas de actinomiceto en el proceso de acuerdo a la invención. Según se describe anteriormente, los compuestos de la fórmula ( 1 ), especialmente IB-97224 e IB-97225, se ha encontrado que tienen una buena actividad en contra de líneas celulares de tumor humano y murino, incluyendo P-388Ü! , HT-29, A-549 y SK-MEL-28. Por lo tanto, la invención también proporciona un método para el tratamiento o profilaxis de tumores malignos en un mamífero, comprendiendo administrar a un mamífero en necesidad de tal tratamiento una cantidad eficaz de un compuesto de la fórmula (1 ) según se define anteriormente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. La invención además se refiere al uso de un compuesto de la fórmula (1 ), según se define anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la elaboración de un medicamento para el
. I, i -1 -i-, , ., t i l - í í É ta miento o profilaxis de tumores malignos en un mamífero. La presente invención también se refiere a preparaciones farmacéuticas que contienen como un ingrediente activo, compuestos de la fórmula (1 ), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, junto con veh ículo o diluyente farmacéuticamente aceptable así como también los procesos para su preparación . Los ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualquier sólido (tabletas, pildoras, cápsulas, granulos, etc. ) o líquido (soluciones, suspensiones o emulsiones) con composición adecuada para la administración oral, local o parenteral, y pueden contener los compuestos puros o en combinación con cualquier veh ículo o compuestos farmacológicamente activos. Estas composiciones pueden necesitar ser estériles cuando se administran parenteralmente. La dosis correcta de una composición farmacéutica variará de acuerdo a la formulación en particular, el modo de aplicación , y el situs en particular, huésped y bacterias o tumor a tratarse. Otros factores como la edad, peso del cuerpo, sexo, dieta, tiempo de administración, grado de excreción, condición del huésped, combinaciones de fármaco, sensaciones a la reacción y severidad de la enfermedad , deberán tomarse en cuenta . La administración puede llevarse a cabo continua o periódicamente dentro de la dosis máxima tolerada.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El Organismo Productor El microorganismo utilizado para la producción de estos nuevos compuestos es preferentemente una cepa de actinomiceto, particularmente cepa de atinomiceto CLCO-002, un cultivo que se ha depositado en la Colección Española de cultivos Tipo en la Universidad de Valencia, España bajo el número de acceso CECT-3347. Este depósito se ha elaborado bajo las condiciones del Tratado de Budapest y todas las restricciones en la disponibilidad del mismo para el público se mantendrán irrevocablemente en garantía de una patente en esta solicitud. El organismo se aisló de una esponja marina no identificada colectada en las aguas de las Islas Canarias. Todos los cultivos se incubaron a 27°C y los registros de los resultados se hicieron semanalmente hasta 21 días. Una descripción del organismo es como sigue: Morfología Los medios de cultivo utilizado para este estudio fueron , medios ISP No. 2, 4, 5 y 6 (Shirling y Gotlieb, 1 966), medio ATCC No. 1 72 (American Type Culture Collection Catalog , 1 989), Czapek Agar (Atlas, 1 993), Bennet Agar (Atlas, 1993), 1 .5% de Agua Agar (Luedemann). Todos los medios se complementaron con 50% de agua de mar artificial Después de 21 días a 28°C se estudió el crecimiento. Se observaron diversos tonos de naranja. No se formó micelio aéreo. Se ramificó el micelio de sustrato. No se observó pigmento soluble. Características Fisiológicas Para los estudios de uso de nitrógeno y carbono se utilizó ISP-9 (Shirling & Cotlieb, 1 966). Debido a la baja velocidad de crecimiento de CLCO-002 bajo los medios definidos, las pruebas de uso de nitrógeno y
i ^ i *-_ , £ í .
carbono mostraron el crecimiento residual de modo que no pudieron obtenerse resultados claros. La resistencia de NaCI se determinó al utilizar el medio ATTC's 1 72 que contiene aumentar las concentraciones de NaCl. La concentración óptima de sal fue de 1 %. No se observó crecimiento con 7% de sal. Composición química de la Célula Aminoácidos: El ácido diaminopimélico se determinó por el método de Hasegawa et al. , (1 983). El isómero de ácido meso-2,6-Diaminopimélico se presentó en el hidrolisato de célula completa de la cepa CLCO-002. Ácidos grasos: FAMEs se determinaron por el método de Van der Auwera er al. , (1 986). La composición de FAME así como también la comparación con otras cepas similares se describe en la Tabla 1 . Mientras que el organismo depositado se prefiere claramente, la presente invención no se restringe o limita a esta cepa u organismos en particular. La intención de los presentes inventores es incluir cualquier otro de los organismos de producción , cepas, o mutantes dentro del alcance de esta invención .
TABLA 1 Composición de FAME de cepa CLCO-002 y sus cepas de actinomiceto. La composición se da como porcentaje del total del contenido de ácidos grasos.
130 h140 140 h150 3-150 150 nao 151 160 171 170 hiai 1-180 Qs- 180 181 l 1 <1 1591 394 671 1 <1 <1 373 cl 1 331 l l 413 l cl as2 cl 988 2292 <1 550 <1 375 128 338 aßo c1 cl cl 103 cl l 121 1034 <1 183 <1 430 <1 563 862 13 <1 <1 943 711 l 460 104 cl 404 110 1894 271 489 <1 <1 443 <1 260 158 113 853 743 l c1 116 <1 <1 318 <1 <1 103 <1 637 40 <1 <1 <1 cl 116 cl cl 1425 282 <1 ais <1 1546 1891 27B 1 215 179 <1 239 964 l cl 33 13 cl 1157 cl 1121 9.96 1 287 <1 103 <1 128 508 439 154 l 176 760 154 <1 340 237 1994 465 117 <1 559 <1 293 444 309 273 cl cl 621 304 <1 168 <1 891 229 153 115 1 188 149 232 225 543 695 1453 131 13 23
MtOC? <1 117 <1 897 124 281 <1 <1 229 153 411 168 490 723 cl 1005 169
NTfUSC? <1 <1 <1 2655 653 <1 1 853 1 <1 730 290 337 359 cl 23 194
SACCAB* <1 306 13 1441 862 104 568 616 455 220 531 202 l l cl cl 143
NQßFRI 151 543 335 452 1 746 309 269 515 235 <1 1 815 475 1703 <1 cl 13 M1SALMO <1 112 128 675 <1 783 753 121 197 101 <1 107 553 1734 cl cl l
M1RUBRA 1 140 138 412 cl 341 727 263 389 217 108 <1 684 1544 125 cl 161
MIROSEO 203 366 514 386 <1 903 302 346 695 117 <1 cl 446 1867 cl 177 cl AJVFOSeO <1 219 124 673 103 694 143 221 361 274 ?m l 433 1754 cl cl <1 IHW4J 10B 191 119 134 <1 643 412 232 234 <1 cl l 571 1215 127 143 l
Fermentación La cepa CLCO-002, cuando se cultivó bajo condiciones controladas en un medio adecuado produce los compuestos IB-97224 e I B- 97225. Esta cepa crece en un medio nutritivo acuoso, bajo condiciones aeróbicas y mesofílicas, preferentemente entre 22°C y 35°C en un pH que varía entre 6.0 y 8.0. Una amplia variedad de medios de cultivo líquidos pueden utilizarse para el cultivo del organismo, los medios útiles son
aquellos que incluyen una fuente de carbono asimilable, tal como almidón , dextrina, molasas de azúcar, glicerol, glucosa y lo similar, una fuente de nitrógeno asimilable tal como las proteínas, hidrosilatos de proteína, comida desgrasada, contacto de maíz, y lo similar, y aniones y cationes inorgánicos útiles tal como sodio, magnesio, potasio, amonio, sulfato, cloro, fosfato, carbonato, y lo similar. Los oligoelementos también pueden agregarse. La aeración se logra preferentemente al suministrar aire al medio de fermentación. La agitación se proporciona por un impulsor mecánico. Se ha encontrado que los tanques de fermentación convencionales se adecúan bien para llevar a cabo el cultivo de este organismo. La adición de nutrientes y control de pH así como también los agentes antiespumantes durante las diversas etapas de fermentación , pueden necesitarse para aumentar la producción y evitar la espumación. Las etapas requeridas necesitadas para la producción de estos compuestos por el organismo preferido son: Comenzar con micelio congelado o liofilizado. Obtener la masa micelial cultivando las células iniciales en frascos de agitación con un medio de cultivo que contiene alguno de los ingredientes anteriormente descritos a temperaturas mesofílicas y en condiciones anaeróbicas, esta etapa puede repetirse varias veces, según sea necesario, y el material colectado se utilizará como un inoculo a sembrar uno o varios de los tanques de fermentación con cualquier medio de cultivo adecuado, si se desea , estos tanques pueden también utilizarse como inoculo, y esta etapa puede repetirse varias veces cuando sea necesario, o pueden servir como la etapa de producción , dependiendo del volumen de medio
f.,í. -.J .Aj.j .itatujt.j. aaim- necesitado. La etapa de producción puede durar de pocos días a más de una semana, dependiendo de la cepa, etapas de inoculo, temperatura y otras condiciones. Una vez que la fermentación ha alcanzado su máxima producción puede cosecharse para el aislamiento de los nuevos compuestos. El medio de producción puede ser diferente al utilizado como inoculo. En la Tabla 2 , se describen los medios típicos que pueden utilizarse como inoculo y la producción de estos nuevos compuestos: TABLA 2
Medio Inócu lo (q/litro ? Medio de Producción (a/litro) Dextrosa 5 Dextrosa 5 Almidón 20 Dextrina 20 Extracto de carne 3 Comida de soya 3 Extracto de levadura 5 Extracto de levadura 5 Peptona 5 Peptona 1 CaCo3 4 CaCo3 4 NaCI 4 NaCI 5 Na2SO4 1 Na2SO4 2.5 KCI 0.5 KCI 0.5 MgCI2 2 MgCI2 0.5 K2HPO4 0.5 K2HPO4 0.5 (N H4)2SO4 0.5 Agua corriente a 1 000 ml
La producción de estos compuestos puede revisarse por el ensayo de medio completo contra A-549 o cualquier otra célula sensible o por HPLC o cualquier otro método con suficiente sensibilidad . Aislamiento de IB-97224 e IB-97225 Los alcaloides IB-97224 e IB-97225 pueden aislarse de la corteza de micelio mediante la extracción con una mezcla adecuada de solvente tal como CHCI3:CH3OH: H2O. La actividad se concentra en la capa inferior. Los extractos de las dos extracciones repetidas pueden combinarse y evaporarse en resequedad in vacuo. La separación y purificación de IB-97224 e IB-97225 del extracto activo crudo puede realizarse por el uso de la combinación adecuada de técnicas cromatográficas convencionales. 5 La fraccionación puede guiarse por la actividad antitumoral de fracciones, o por TLC visualizarse con vanilina en conc. H2SO4, o HPLC analítico con detector de serie fotodiodo. Los análisis de HPLC se realizan a temperatura ambiente (Waters RCM 8x1 0, 8C1 8 1 0 µ de cartucho) utilizando un hidrogenfosfato de sodio de acetonitrilo de fase 10 móvil 0.025 M pH=3 (75:25) y una velocidad de flujo de 2 ml/min . y graficado a 290 nm . Los compuestos de interés mostraron tiempos de retención de 3.92 y 3.29 minutos en IB-97224 e IB-97225 respectivamente. Los datos espectrales dados abajo permiten a los compuestos identificarse como IB-97224 e IB-97225. Los diversos átomos se numeran 15 utilizando el sistema de numeración indicado abajo. Se utilizan las siguientes abreviaciones: Espectros IR: w: débiles; m: medios; s: resistentes, br. amplios Espectros NMR: s: singuletes; d : dobletes; t: tripletes; dd: 20 doblete de dobletes.
it fmtwmriffiímfi . f.-^^^; ^, --* * >* •*•
4'-N-metil-5'-hidroxiestaurosporina (IB-97224) (R2=Me) IR (KBr) vmax/cm"1: 3406 (s, br), 3070 (m), 2925 (s), 2852 (m), 1915 (w, br), 1664 (s), 1583 (s), 1450 (m), 1415 (m), 1391 (s), 1351 (s), 1319 (s), 1281 (s), 1249 (s), 1236 (m), 1223 (m), 1181 (m), 1150 (m), 1117 (s), 1103 (s), 1066 (s), 1018 (m), 988 (m), 887 (w), 835 (w), 816 (w), 742 (s), 698 (w), 664 (w), 636 (w), 609 (w).
1H NMR (300 MHz, CDCI3), d/ppm: 9.43 (1H, d, J 7.7 Hz, C4H), 7.90 (1H, d, J 7.7 Hz, C C8H), 7.76 (1H, d, J 7.7 Hz, C11H), 7.64 (1H, d, J 7.7 Hz, C1 H), 753 (1H, t, J 7.7 Hz, C2H), 7.45 (1H, t, J 7.7 Hz, C10H), 7.38 (1H, t, J 77 Hz, C3H), 7.34 (1H, t, J 7.7 Hz, C9H), 6.52 (1H, s, C6?), 6.50 (1H, s, N6H), 4.99 (1H, s, C7H), 4.43 (1H, d, J 9.9 Hz, C5?), 3.95 (1H, s, C3H),
3.02 (1H, d, J 9.9 Hz, C4'H), 2.48 (3H, s, CH¿), 2.37 (6H, s, N4'(CH3)2),
13C NMR (75 MHz, CDCI3), 173.65 (C5), 137.86 (C11a), 137.12 (C13a) 131.94 (C7a), 130.64 (C12a), 126.79 (C12b), 126.13 (C4), 125.46 (C2) 124.94 (C10), 124.54 (C7c), 123.22 (C4a), 121.49 (C8), 120.43 (C9) 119.98 (C3), 118.89 (C4c), 115.86 (C4b), 114.14 (C7b), 111.46 (C11) 108.97 (C1), 94.92 (C2'), 91.54 (C6'), 79.30 (C3'), 69.50 (C5'), 66.75 (C41) 58.36 (CH3O), 45.79 (C7), 41.67 (N4'(CH3)2), 28.00 (CH3).
UV (7525 CH3CN / 0.025 M Na2HPO4 pH 3), ?max/nm: 370, 354, 334, 320, 291, 242, 206.
m/z (Rápido Bombardeo de Átomo) 497.2 (MH+).
5'-Hidroxiestaurosporina (IB-97225) (R 2^ =1H)
IR (KBr) vmax/cm-1: 3415 (s, br), 3070 (m), 2931 (m), 2851 (m), 1991 (w, br), 1664 (s), 1583 (m), 1453 (s), 1416 (m), 1392 (m), 1352 (s), 1317 (s), 1280 (m), 1236 (m), 1225 (m), 1151 (m), 1130 (m), 1118 (m), 1064 (m), 1036 (m), 1017 (m), 973 (w), 927 (w), 896 (w), 860 (w), 836 (w), 814 (w), 772 (m), 746 (s), 651 (w), 638 (w).
1H NMR (300 MHz, CDCI3), d/ppm: 9.40 (1H, d, J 7.4 Hz, C4H), 7.89 (1H, d, J 7.4 Hz, C8H), 7.85 (1H, d, 7.4, C11H), 7.53 (1H, d, J 8.1 Hz, C1H), 744 (2H, t, J 7.4 Hz, C2H & C10H), 7.31 (2H, t, J 7.4 Hz, C3H & C9H), 649 (1H, d, J 1.2 Hz, C6'H), 6.43 (1H, s, N6H), 4.98 (1H, s, C7H), 4.26 (1H, dd, J 6.8 Hz, 1.2 Hz, C5'H), 4.14 (1H, d, J 2.8 Hz, C3'H), 3.09 (1H, dd, J 6.8
Hz, 2.8 Hz, C4?), 2.71 (3H, s, CH3O), 2.45 (3H, s, CH3), 2.17 (3H, s, CH3N4').
13C NMR (75 MHz, CDCI3), d/ppm: 173.81 (C5), 138.86 (C11a), 137.05 (C13a), 132.17 (C7a), 130.50 (C12a), 126.89 (C12b), 126.13 (C4), 125.53 (C2), 124.67 (C10), 124.52 (C7c), 123.24 (C4a), 121.01 (C8), 120.32 (C9), 119.92 (C3), 118.56 (C4c), 115.64 (C4b), 114.19 (C7b), 113.50 (C11), 108.10 (C1), 92.37 (C2'), 88.38 (C6'), 80.14 (C3'), 70.03 (C5'), 60.11 (C4'), 59.02 (CH3O), 45.88 (C7), 33.68 (CH3N4'), 28.96 (CH3). UV (75:25 CH3CN / 0.025 M Na2HPO4 pH 3), ?max/nm: 370, 354, 334, 320, 291, 242, 206.
m/z (Rápido Bombardeo de Átomo) 483.2 (MH+).
Actividad Biológica Las actividades antitumorales de IB-97224 e IB-97225 se han determinado in vitro en cultivos celulares de leucemia de ratón P-338D?, carcinoma de pulmón humano A-549, carcinoma de colon humano HT-29, y melanoma humano SK-MEL-28. El procedimiento se llevó a cabo utilizando la metodología descrita por Bergeron, et al., (1984), y por Schroeder, et al., (1981). La presente invención se ilustrará además con referencia a los siguientes ejemplos que ayudan al entendimiento de la presente invención, pero que no se interpretan como limitantes de la misma. Todos los porcentajes reportados en la presente, al menos que se especifique de otra forma, se presentan en peso. Todas las temperaturas se expresan en grados Celcius. Todas las incubaciones se llevan a cabo a 28°C y los frascos se agitan en un agitador orbital. Todos los medios y recipientes son estériles y todos los procesos de cultivo asépticos. EJEMPLO 1 Cultivo de Cepa: el medio completo de un cultivo puro de cepa CLCO-002 se conserva congelado en 20% de glicerol. Inoculo: Un cultivo congelado o un cultivo de agar inclinado bien crecido (5% de vol.) se utiliza para sembrar 100 ml de medio de semilla descrito anteriormente contenido en un frasco de agitación de 250 ce. El frasco se incuba durante 48 hr. Se siembran 500 ml del mismo medio en el matraz de Erlenmeyer de 2 L con 1 0% de la primera etapa de inoculo. El matraz se incuba durante 48 h. Fermentación: Con 2.5 L de la segunda etapa de inoculo se siembran 50 L de medio de producción ya descrito en un tanque de fermentación de 75 L. La fermentación se lleva a cabo durante 96 horas con 400 rpm de agitación y flujo de aire de 0.5 V/V. M. Revisar la producción de metabolito secundario mediante el ensayo de medio completo contra A-549 o mediante HPLC. Aislamiento: 1 0 L de medio cosechado completo se filtró para separar la biomasa y otros sólidos. La corteza micelial se extrajo dos veces con un solvente de mezcla (2.4 I) de CHCI3:CH3OH: H2O (2: 1 : 1 ), y la actividad se concentró en la capa inferior. El solvente orgánico se concentró y se evaporó en resequedad in vacuo para producir 3.2 g de extracto crudo. El extracto se cromatografió en gel de sílice columna de
"despunte al vacío". Después de lavar con una mezcla de acetato n-hexano-etilo 1 : 1 , la columna se desarrolló con un gradiente de acetato-metanol de etilo. El progreso de la levigación se revisó para citotoxicidad contra células A-539 y se revisó por TLC (cloroformo-metanol 9: 1 ) y el grupo de fotodiodo de HPLC de fase inversa analítica. Se logró más purificación de fracciones activas (250 mg) mediante la cromatografía de columna en gel de sílice y la actividad se eluyó con cloroformo-metanol 92: 8 y 95: 5. Cada una de estas fracciones se cromatografiaron en una columna de C18 de fase inversa y se eluyó con metanokagua 65:35 para dar 1 2 mg de estaurosporina, 4 mg de IB-97224, y 8 mg de IB-97225. Actividad biológica: Las células antitumorales empleadas han sido P-388D! (cultivo suspensión de un neoplasma linfoide de ratón DBA/2), A-549 (cultivo monocapa de un carcinoma de pulmón macrocítico humano), HT-29 (cultivo monocapa de un carcinoma de colon humano), y SK-MEL-28 (cultivo monocapa de un melanoma humano) Las células P-338D? se sembraron en cavidades de 16 mm en células 1 x104 por cavidad en 1 ml de alícuotas de MEM 5FCS que contiene la concentración indicada de fármaco. Una serie separada de cultivos sin fármaco se sembró como control de crecimiento para asegurar que las células permanecieran en la fase expuesta del crecimiento. Todas las determinaciones se llevaron a cabo por duplicado. Después de tres días de incubación a 37°C en 1 0% de atmósfera CO2 con 98% de humedad, el IC50 se calculó al comparar el crecimiento en cavidades con fármaco con el crecimiento en cavidades de control sin el fármaco. Las células A-549, HT-29, y SK-MEL-28 se sembraron en cavidades de 16 mm en células 2x1 04 por cavidad en 1 ml
- -— "- — -» *--- de alícuotas de MEM 1 0FCS que contiene la concentración indicada del fármaco. Una serie separada de cultivos sin fármaco se sembraron como control de crecimiento para asegurar que las células permanecieran en la fase expuesta del crecimiento. Todas las determinaciones se llevaron a cabo por duplicado. Después de tres días de incubación a 37°C en 1 0% de atmósfera CO2 con 98% de humedad, las cavidades se colorearon con 0.1 % de Violeta Cristal. El IC50 se calculó ai comparar el crecimiento en cavidades con fármaco con el crecimiento en cavidades de control sin el fármaco.
En la Tabla 3 se presenta la actividad expresada como IC5c
(µM) TABLA 3 Línea celular IC50 (µM) IB-97224 IB-97225 P338D! 0.04 0.02 A-549 0.002 0.002 HT-29 0.004 0.004 SK-MEL-28 0.004 0.002
Referencias Citadas Las siguientes referencias se han citado en la presente, y se incorporan de tal modo en la presente para referencia: Nishizuka, Y. , Nature 334: 661 -665, 1 988
ÍJM , .aá^> «-. « ....
Nishizuka, Y., Nature 308: 693-698, 1984 Shirling B.E., y Gotlieb D., Int. J. Syst. Bacteriol. 16: 313-340, 1996 American Type Culture Catalog 17th edition, 1989. Rockville, Maryland, U.S. A. Atlas R.M., Handbook of Microbiological Media, 1993 CRC Inc Boca Ratón, Florida. USA Luedemann G.M. Personal Communication Hasegawa T., Takizawa M., y Tañida S., J. Gen. Appl. Microbiol. 29: 319- 322, 1983 Van der Auwera P., Labbe M., Mayberry W.R., Ferguson K.P , y Lambe D W.Jr., J. Microbiol. Methods 4: 265-275, 1986 Bergeron et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 121: 848-854, 1984 Schroeder ef al., J. Med. Chem , 24: 1078-1981
Claims (1)
- REIVINDICACIONES Los compuestos de la Fórmula (1 ): (1 ) en donde - R1 es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo alcoxi que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; y R2 es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos carbono o un grupo alcoxi que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. 2. Un compuesto según la reivindicación 1 , caracterizado porque R1 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. 3. Un compuesto según la reivindicación 2, caracterizado porque R1 es un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, o un grupo etilo. 4. Un compuesto según la reivindicación 3, caracterizado porque R es un átomo de hidrógeno. 5. Un compuesto según la reivindicación 1 , caracterizado porque R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. 6. Un compuesto según la reivindicación 5, caracterizado porque R2 es un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, o un grupo etilo. 7. Un compuesto según la reivindicación 6, caracterizado porque R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo. 8. Un compuesto según la reivindicación 1 , caracterizado porque: R1 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, y R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. 9. Un compuesto según la reivindicación 8, caracterizado porque: R1 es un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, o un grupo etilo; y R2 es un átomo de hidrógeno, un grupo metilo o un grupo etilo. 1 0. Un compuesto según la reivindicación 1 , caracterizado porque R1 es un átomo de hidrógeno y R2 es un grupo metilo. 1 1 . Un compuesto según la reivindicación 1 , caracterizado porque R1 y R2 son ambos átomos de hidrógeno. 12. Un proceso para la producción de un compuesto de la fórmula (1 ), según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, comprendiendo cultivar Édi^. ». i. *.**- *,,»- .SLX&X.**, . una cepa de un microorganismo capaz de producir un compuesto de la fórmula (1 ), recuperar el compuesto de la fórmula (1 ) del medio de cultivo, y, opcionalmente, salificar el compuesto recuperado. 1 3. Un proceso según la reivindicación 1 2, caracterizado porque el microorganismo es una cepa de actinomiceto. 14. Un proceso según ia reivindicación 1 3, caracterizado porque el microorganismo es la cepa actinomiceto CLCO-002 (CECT-3347). 1 5. Una composición farmacéutica que contiene como un ingrediente activo un compuesto de la fórmula (1 ) según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un veh ículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. 1 6. Un compuesto de la fórmula (1 ) según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para utilizarse como un medicamento. 1 7. El uso de un compuesto de la fórmula (1 ) según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de tumores malignos en un mam ífero. 18. Un método para el tratamiento o profilaxis de tumores malignos en un mamífero, comprendiendo administrar a un mamífero en necesidad de tal tratamiento una cantidad eficaz de un compuesto de la fórmula (1) según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. ^^^^^^t---t^¿^^?j^íi^^? d^^.^iirfí^ ?
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