ES2202880T3 - Macrolidos con actividad antitumoral. - Google Patents

Macrolidos con actividad antitumoral.

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ES2202880T3
ES2202880T3 ES98937654T ES98937654T ES2202880T3 ES 2202880 T3 ES2202880 T3 ES 2202880T3 ES 98937654 T ES98937654 T ES 98937654T ES 98937654 T ES98937654 T ES 98937654T ES 2202880 T3 ES2202880 T3 ES 2202880T3
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Francisco Instituto Biomar S.A. Romero
Fernando Instituto Biomar S.A. Espliego
Instituto Biomar S.A. Fernandez-Puentes Jose Luis
Rosa I. Instituto Biomar S.A. Fernandez-Chimeno
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Abstract

El compuesto al que se hace referencia en esta memoria como IB-96212, que tiene esetructura (I) se puede obtener cultivando una cepa de Micromonospora spl ES25-008, disponible con el número de acceso CECT-3333, que se puede hidrolizar para dar IBG-96212B de estructura (II). El sustituyente azúcar, que es L-rodinosa, puede él mismo derivarse o el azúcar puede estar sustituido, en cualquier caso dando lugar a más derivados de IB-96212 que tienen un grupo distinto de L-rodinosa en la posición del azúcar.

Description

Macrólidos con actividad antitumoral.
Ámbito de la invención
La presente invención se refiere a un nuevo compuesto que es un macrólido y es aislado del caldo de cultivo de un nuevo organismo microbiano marino. La presente invención se refiere además a la producción del nuevo compuesto mediante fermentación aeróbica bajo condiciones controladas y a su aislamiento y purificación, así como a compuestos derivados y a aspectos adicionales basados en el descubrimiento de actividades antitumorales y otras actividades.
Antecedentes de la invención
Los macrólidos llamados oligomicinas y homooligomicinas son conocidos por J. Antibiotics 46: 1334-1341, 1993; J. Antibiotics 45: 171 - 179, 1992 y J. Antibiotics 49: 1275 - 1277, 1996.
Objetivos de la invención
Sigue habiendo necesidad de nuevos compuestos antiproliferativos para el tratamiento de varios tumores humanos, debido al hecho de que las de un gran número de líneas celulares cancerosas, incluyendo las que presentan el fenotipo MDR (MDR = resistentes a drogas múltiples), no son tratadas con eficacia por droga alguna.
Otro objetivo adicional de esta invención es el de aportar composiciones farmacéuticas destinadas a ser administradas a un paciente que necesite tratamiento con el compuesto activo.
Los productos microbianos son interesantes porque su producción industrial está perfectamente establecida en la actualidad. Por consiguiente, otro objetivo de esta invención está dirigido a la producción del compuesto activo y a su aislamiento y purificación a partir del caldo de fermentación resultante, así como a su hidrólisis para su conversión en un compuesto aglicónico y a su derivatización para su conversión en compuestos afines.
Breve exposición de la invención
Esta invención aporta un compuesto que tiene una estructura del tipo de la de un macrólido, al que se llama IB-96212 y que tiene la fórmula siguiente:
1
Se aporta también un proceso para obtener IB-96212, y el proceso preferido comprende el paso de cultivar una cepa de un microorganismo capaz de producir IB-96212 en un medio nutritivo acuoso con fuentes y sales de carbono y nitrógeno asimilables, bajo condiciones aeróbicas en inmersión controladas. Es también parte de esta invención el propio caldo resultante, ya sea no purificado o bien parcialmente purificado y que tiene actividad antitumoral. El compuesto IB-96212 puede ser recuperado y purificado a partir del caldo cultivado. El compuesto y el caldo de fermentación demuestran tener una interesante actividad contra varias células cancerosas humanas entre las que se encuentran las células de leucemia sensitivas y resistentes a drogas múltiples (MDR). Adicionalmente, el IB-96212 presenta actividad antibiótica contra algunas bacterias grampositivas.
De este compuesto IB-96212 puede ser retirado por hidrólisis un tridesoxiazúcar identificado como L-rodinosa, dejando el compuesto aglicónico activo IB-96212B que tiene el sistema de anillo de macrólido de 26 miembros del núcleo del IB-96212 progenitor.
Así, la invención aporta además el compuesto IB-96212B con la estructura:
2
El IB-96212B tiene una actividad equiparable a la del IB-96212 progenitor.
En el compuesto IB-96212, el tridesoxiazúcar que identificamos como L-rodinosa puede ser él mismo derivatizado, o bien el azúcar puede ser sustituido, siendo en cualquier caso obtenidos adicionales derivados de IB-96212 que tienen un grupo distinto de L-rodinosa en la posición del azúcar. Así, más ampliamente, la presente invención aporta un compuesto de la fórmula general:
3
donde R es hidrógeno o un grupo sustituyente.
\newpage
Ilustrativamente, R es hidrógeno o un grupo seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de un grupo sacárido, un grupo hidrocarbilo, un grupo acilo, un grupo heterociclilo o algún otro sustituyente adecuado. La naturaleza del grupo sustituyente no es decisiva. El grupo sacárido es convenientemente un mono-, di- o trisacárido, que puede ser un desoxisacárido. El hidrocarbilo puede ser alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo o alquilarilo, y especialmente alquilo de C_{1}-C_{6}, ciclo-(C_{4}-C_{8})-alquilo, fenilo, naftilo o bencilo. El grupo heterociclilo puede ser un anillo de 4 a 8 miembros que tenga de 1 a 4 heteroátomos, y en especial un anillo de 5 ó 6 miembros que tenga 1 ó 2 heteroátomos elegidos de entre los miembros del grupo que consta de oxígeno, azufre y nitrógeno. El grupo hidrocarbilo, el grupo acilo o el grupo heterociclilo puede ser él mismo sustituido, por ejemplo con 1, 2 ó 3 sustituyentes elegidos de entre los miembros del grupo que consta de alquilo de C_{1}-C_{6}, alcoxi de C_{1}-C_{6}, halógeno, hidroxi, amino u otros grupos.
El cultivo preferido para obtener IB-96212 es una nueva cepa llamada ES25-008, y sus caracteres químicos, bioquímicos y morfológicos demuestran que pertenece al género Micromonospora, estando clasificada taxonómicamente como Micromonospora sp.
Como se ha descrito anteriormente, se ha descubierto que los compuestos IB-96212 e IB-96212B son eficaces en la inhibición de la actividad proliferativa de varias líneas celulares de leucemia humana y murina (líneas celulares resistentes a drogas múltiples (MDR) así como líneas celulares sensitivas), así como contra otros tumores humanos. Resulta de ello que otros compuestos de la fórmula general indicada conservarán tal actividad.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un cromatograma de HPLC (HPLC = cromatografía de líquidos de alta resolución) de IB-96212 purificado;
la Figura 2 es un espectro ultravioleta (UV) de IB-96212 purificado;
la Figura 3 es un espectro infrarrojo (IR) de IB-96212 purificado;
la Figura 4 es un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) protónica (de 1H) de IB-96212 purificado;
la Figura 5 es un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) de carbono-13 (13C) de IB-96212 purificado;
la Figura 6 es un espectro de masa de IB-96212 purificado;
la Figura 7 es un espectro de RMN HMBC de IB-96212 tomado en acetona- d_{6};
la Figura 8 es un espectro de RMN COSY de IB-96212 tomado en acetona- d_{6};
la Figura 9 es un espectro de RMN HMQC a 132 Hz de IB-96212 tomado en acetona-d_{6};
la Figura 10 muestra las correlaciones de RMN de IB-96212B;
la Figura 11 es un espectro de masa de IB-96212B;
la Figura 12 es un espectro de RMN HMBC de 60ms de IB-96212B tomado en acetona-d_{6};
la Figura 13 es un espectro de RMN HMBC de 110ms de IB-96212B tomado en acetona-d_{6};
la Figura 14 es un espectro de RMN COSY de IB-96212B tomado en acetona- d_{6}; y
la Figura 15 es un espectro de RMN HMQC a 145 Hz de IB-96212B tomado en acetona-d_{6}.
Descripción detallada de la invención El Organismo productor
El microorganismo utilizado para la producción de IB-96212 y por consiguiente de IB-96212B es preferiblemente la cepa ES25-008 de Micromonospora sp., del cual ha sido depositado un cultivo en la Colección Española de Cultivos Tipo en la Universidad de Valencia, España, con el número de registro de entrada CECT 3333. Este depósito ha sido efectuado al amparo de lo dispuesto por el Tratado de Budapest, y se le ha dado la fecha de depósito del 4 de agosto de 1997. El organismo fue aislado de una esponja marina no identificada. Los métodos taxonómicos aquí descritos son los indicados en la Tabla 1. Todos los cultivos fueron incubados a 27ºC, y fueron efectuados registros de los resultados semanalmente hasta 21 días.
\newpage
TABLA 1
1. Medios para los estudios de la morfología colonial
Medios ISP Nº 2, 3, 5 y 6: Shirling & Gotlieb. (7).
Medio ATCC Nº 172: Catálogo de la ATCC (ATCC = Colección Americana de Cultivos Tipo)
Agar Czapek Difco
Agar Bennet, Waksman. (9)
Agar con un 1,5% de agua, Luedemann (5)
Todos los medios fueron suplementados con un 50% de agua de mar artificial
2. Estudios de las características fisiológicas
Medio ISP Nº 1, Shirling & Gotlieb. (7)
Resistencia al NaCl: ATCC 172 con un 0, 2, 4, 7 y 10% de NaCl.
Utilización del carbono: ISP-9, E. B. Shirling & D. Gotlieb. (7)
3. Estudios de la composición química
Análisis de los ácidos grasos, Van der Auwera et al. (8)
Análisis del azúcar de las células intactas, Guerrant y Moss. (3)
La siguiente es una descripción del organismo:
Morfología
Tras 21 días a 28ºC se observó crecimiento en caldo ISP2 y 172 suplementado con agua de mar artificial (ASW). Fueron observados varios tonos de naranja en los distintos medios estudiados. No se formó micelio aéreo. El micelio del sustrato era ramificado. Se dan esporas terminales aisladas en el micelio del sustrato. Las esporas eran esféricas. En algunos medios y tras al menos 14 días de incubación puede detectarse cierto sobrecrecimiento de la masa de micelios.
Características fisiológicas
Ni en los medios sólidos ni en los medios líquidos fueron formados pigmentos difusibles por la cepa ES25-008. La resistencia al NaCl era de más de un 4%. La gama de temperaturas de crecimiento óptimo estaba situada entre 25ºC y 35ºC. El organismo creció sobre glucosa, sucrosa, xilosa y manosa como única fuente de carbono, si bien fue negativo el crecimiento sobre rafinosa, inositol, galactosa, fructosa, melibiosa, etanol, glicerol y ramnosa, y fue dudoso el crecimiento sobre manitol.
Composición química de las células Aminoácidos
En el hidrolizado de células intactas de la cepa ES25-008 estaba presente ácido meso-2,6-diaminopimélico.
Ácidos grasos
La composición de ésteres metílicos de ácidos grasos es como se indica a continuación en la Tabla 2:
TABLA 2
13:0 i-14:0 14:0 i-15:0 n-15:0 15:0 i-16:1 i-16:0 16:1 16:0
<1 <1 <1 8.21 1.00 1.09 <1 35.07 <1 1.12
i-17:1 i-17:0 n-17:0 17:1 17:0 i-18:1 i-18:0 cis-18:1 18:0
<1 3.18 3.39 29.48 7.88 1.44 <1 2.30 <1
Azúcares
El espectro de azúcares de las células intactas puso de manifiesto la presencia de xilosa, ribosa y glucosa cuando se efectuó el pertinente análisis por cromatografía de gases. Fueron detectadas trazas de arabinosa. Este espectro agrupa esta cepa dentro del grupo D de Lechevalier et al. (4). Otros azúcares detectados fueron manosa, galactosa, n-inositol y manosamina. El polialcohol arabitol y el ácido murámico eran otros componentes celulares. No se detectó madurosa.
Sobre la base de las características precedentes, el cultivo ha sido determinado como una especie del género Micromonospora que no guarda similitud con ninguna de las cepas de tipo conocido de este género que están disponibles en las colecciones internacionales. El mayor parecido según el análisis cromatográfico de ácidos grasos era con la Micromonospora chalcea ATCC 31395 con una similitud de tan sólo un 80%.
Si bien se prefiere claramente el organismo depositado, la presente invención no queda restringida o limitada a esta cepa en particular o a estos organismos en particular. Es la intención de los presentes inventores incluir cualesquiera otros organismos, cepas o mutantes que produzcan IB-96212.
Fermentación
Al ser cultivado bajo condiciones controladas en un medio adecuado, el microorganismo Micromonospora sp. ES25-008 produce el antibiótico IB-96212. Esta cepa es cultivada en un medio nutritivo acuoso, bajo condiciones aeróbicas y mesofílicas, preferiblemente a una temperatura de entre 24ºC y 35ºC y a un pH de 6,0 a 8,0. Para el cultivo del organismo pueden ser utilizados los de una amplia variedad de medios de cultivo líquidos, siendo medios útiles aquéllos que incluyen una fuente de carbono asimilable tal como almidón, dextrina, melazas de azúcar, glicerol, glucosa, sucrosa y fuentes similares, una fuente de nitrógeno asimilable tal como proteínas, hidrolizados proteínicos, harinas desgrasadas, jarabe de maíz y fuentes similares, y aniones y cationes inorgánicos útiles tales como los de sodio, magnesio, potasio, amonio, sulfato, cloruro, fosfato, carbonato y aniones y cationes similares. Pueden ser también añadidos oligoelementos. La aireación se logra preferiblemente suministrando aire al medio de fermentación. La agitación es efectuada por una hélice mecánica. Se ha comprobado que son perfectamente adecuados para llevar a cabo el cultivo de este organismo los tanques de fermentación convencionales. Para incrementar la producción y evitar la espumación puede ser necesario efectuar una adición de nutrientes y un control del pH así como añadir agentes antiespumantes durante las distintas etapas de la fermentación.
Los pasos requeridos que son necesarios para la producción de IB-96212 por parte del organismo preferido son los siguientes:
Comenzar con micelio congelado o liofilizado. Obtener una masa miceliana cultivando las células iniciales en matraces sacudidores con un medio de cultivo que contenga algunos de los ingredientes anteriormente descritos a temperaturas mesofílicas y en condiciones aeróbicas, pudiendo este paso ser repetido varias veces según sea necesario, y el material recolectado será usado como un inóculo para sembrar uno o varios tanques de fermentación con medio de cultivo apropiado, y si se desea, estos tanques pueden ser utilizados también como inóculo, y este paso puede ser repetido varias veces cuando ello sea necesario, o bien estos tanques pueden servir de etapa de producción, en dependencia del volumen de caldo que sea necesario. El medio de producción puede ser a veces distinto del usado como inóculo.
En la Tabla 3 están descritos medios típicos que pueden ser usados para el desarrollo del inóculo y para la producción de IB-96212.
TABLA 3
Medio de inóculo Medio de producción
Glucosa 5 g Glucosa 5 g
Almidón 20 g Almidón 20 g
Extracto de buey 3 g Soja en polvo 15 g
Extracto de levadura 5 g Extracto de levadura 5 g
Triptona 5 g Triptona 2 g
CaCO_{3} 4 g CaCO_{3} 4 g
NaCl 4 g NaCl 4 g
Na_{2}SO_{4} 1 g Na_{2}SO_{4} 1 g
Kcl 0,5 g Kcl 0,5 g
MgCl_{2} 2 g MgCl_{2} 2 g
K_{2}HPO_{4} 0,5 g K_{2}HPO_{4} 0,5 g
Agua del grifo hasta 1.000 ml Agua del grifo hasta 1.000 ml
La producción de IB-96212 puede ser supervisada mediante análisis del caldo intacto contra la línea celular de la leucemia murina P-388 o bien por HPLC.
Aislamiento de IB-96212
El antibiótico IB-96212 puede ser aislado de la torta de micelios mediante extracción con una adecuada mezcla de disolventes tal como CHCl_{3}:CH_{3}OH:H_{2}O. La actividad queda concentrada en la capa inferior. Los extractos de dos extracciones repetidas pueden ser combinados y evaporados hasta la sequedad in vacuo.
La separación y purificación del IB-96212 a partir del extracto activo bruto puede ser efectuada mediante el uso de la adecuada combinación de técnicas cromatográficas convencionales.
El fraccionamiento puede ser guiado por la actividad antitumoral de las fracciones, o por cromatografía en capa fina (TLC) visualizada con vainillina en H_{2}SO_{4} concentrado o por HPLC analítica con detector de diodo. Los análisis por HPLC son llevados a cabo a temperatura ambiente (Waters RCM 8x10, cartucho 8C18 10) usando como fase móvil metanol:agua 92:8 y una velocidad de flujo de 2 mm/min. y con registro a 225 nm. En estas condiciones, el tiempo de retención de IB-96212 es de 3,64 min. como se muestra en la Fig. 1.
Sobre la base de los análisis detallados de sus varias características espectrales, el compuesto puro puede ser identificado como IB-96212 (véanse los datos reproducidos en las figuras 2 a 6).
El espectro ultravioleta presenta absorción a 225 nm como se indica en la Fig. 2.
En la Fig. 3 de los dibujos acompañantes está ilustrado el espectro de absorción de infrarrojos en KBr.
Los espectros de RMN de 1H y de 13C están ilustrados en la Fig. 4 y en la Fig. 5, respectivamente.
En la Fig. 6 está ilustrado el espectro de masa por bombardeo atómico rápido que presentaba un pico de (M+Na)^{-} a 1021.
Se tabulan de la manera siguiente los datos de RMN de ^{1}H para IB-96212:
TABLA A
posición \deltaH [mult int, J (Hz)] posición \deltaH [mult int, J (Hz)]
1 33 3.52 (1H)
2 5.80 (1H, d, 15.5) 34 1.35 (1H m)
3 6.74 (1H, dd, 10.5, 15.5) 1.68 (1H, m)
4 2.37 (1H, dt, 6.5, 10.0) 35 0.94 (3H, t, 7.5)
5 3.62 (1H, d, 9.0) 36 1.13 (3H, d, 6.5)
6 1.73 (1H, m) 37 0 77 (3H, d, 7.0)
7 4.02 (1H, d, 9.0) 38 1.40 (1H, m)
8 3.62 (1H, d, 9.0) 1.64 (1H, m)
9 3.54 (1H) 39 1.42 (1H, m)
10 4.07 (1H, dd, 4.5, 8.05) 1.54 (1H, m)
TABLA A (continuación)
posición \deltaH [mult int, J (Hz)] posición \deltaH [mult int, J (Hz)]
11 3.46 (1H) 40 0.91 (3H, t, 7.0)
12 41 0.96 (3H, d, 6.5)
13 3.78 (1H, dd, 1.5, 6.5) 42 1.25 (1H, m)
14 1.82 (1H, m) 1.42 (1H, m)
15 1.98 (1H, m) 43 3.68 (1H, m)
2.19 (1H, m) 44 1.08 (3H, d, 6.5)
16 5.42 (1H, ddd, 3.5, 10.5, 14.5) 45 0.75 (3H, d, 7.0)
17 6.03 (1H, dd, 10.5, 14.5) 46 0.92 (3H, d, 7.0)
18 6.01 (1H, dd, 10.5, 14.5) 47 0.78 (3H, d, 6.0)
19 5.16 (1H, dd, 10.0, 14.5) 48 0.82 (3H, d, 7.0)
20 2.26 (1H, dt, 10.0) 5-OH 4.21 (1H, s)
21 1.40 (1H, m) 7-OH 4.90 (1H, s)
1.64 (1H, m) 9-OH 3.50 (1H, s)
22 0.92 (1H, m) 10-OH 4.50 (1H, d, 4.5)
1.58 (1H, m) 11-OH 3.53 (1H, s)
23 3.92 (1H, d, 10.5) 12-OH 3.75 (1H, s)
24 1.95 (1H, m) 13-OH 4.43 (1H, d, 6.5)
25 4.8 1 (1H, dd, 5.0, 11.5) 33-OH 3.38 (1H, d, 6.0)
26 1.75 (1H) 43-OH 3.39 (1H, d, 6.0)
27 1' 6 4.54 (1H, dd, 1.5, 7.7)
28 1.40 (1H, m) 2' 1.43 (1H, m)
1.75 (1H, m) 2.09 (1H, dt, 2.0, 8.5)
29 1.49 (1H, m) 3' 1.46 (1H, m)
1.65 (1H, m) 1.93 (1H, m)
30 1.49 (1H, m) 4' 3.15 (1H, sep, 5.0)
31 3.82 (1H, d, 10.5) 5' 3 31 (1H, dq, 2.5, 6.0)
32 1.66 (1H, m) 6' 1.24 (3H, d, 6.0)
Se tabulan de la manera siguiente los datos de RMN de ^{1}H para IB-96212B:
TABLA B
posición \deltaH [mult int, J (Hz)] posición \deltaH [mult int, J (Hz)]
1 33 3.55 (1H, m)
2 5.80 (1H, d, 15.5) 34 1.37 (1H, m)
3 6.75 (1H, dd, 10.0, 15.5) 1.70 (1H, m)
4 2.45 (1H, dt, 6.5, 10.0) 35 0.95 (3H, t, 7.5)
5 3.65 (1H) 36 1.14 (3H, d, 6.5)
6 1.75 (1H, m) 37 0.85 (3H, d, 7.0)
7 3.94 (1H, d, 8.0) 38 1.45 (1H, m)
8 3.62 (1H) 1.59 (1H, m)
9 3.63 (1H) 39 1.35 (1H, m)
10 4.14 (1H, d, 6.5) 1.55 (1H, m)
11 3.50 (1H) 40 0.88 (3H, t, 7.0)
12 41 0.98 (3H, d, 6.5)
13 3.78 (1H, broad s) 42 1.25 (1H, m)
14 1.85 (1H, m) 14.5 (1H, m)
15 2.10 (1H, m) 43 3.80 (1H, m)
2.22 (1H, m) 44 1.08 (3H)
16 5.45 (1H, ddd, 3.5, 10.5, 14.5) 45 0.78 (3H, d, 7.0)
17 6.01 (1H, dd, 10.0, 14.5) 46 0.93 (3H, d, 7.0)
TABLA B (continuación)
posición \deltaH [mult int, J (Hz)] posición \deltaH [mult int, J (Hz)]
18 6.08 (1H, dd, 10.0, 14.5) 47 0.80 (3H, d, 6.0)
19 5.18 (1H, dd, 10.5, 14.5) 48 0.83 (3H, d, 7.0)
20 2.35 (1H, dt, 10.0) 5-OH
21 1.46 (1H, m) 7-OH
1.65 (1H, m) 9-OH
22 1.02 (1H, m) 10-OH
1.60 (1H, m) 11-OH
23 3.96 (1H, d, 10.5) 12-OH
24 1.93 (1H, m) 13-OH 4.24 (1H, broad s)
25 4.90 (1H, dd, 5.5, 11.5) 3340H 3.40 (1H, d, 6.4)
26 1.75 (1H) 4340H 3.43 (1H, d)
27 1'
28 1.40 (1H, m) 2'
1.77 (1H, m) 3'
29 1.50 (1H, m) 4'
1.65 (1H, m)
30 1.52 (1H, m) 5'
31 3.84 (1H, d, 10.0) 6'
32 1.68 (1H, m) 4'-OH
Se tabulan de la manera siguiente los datos de RMN de ^{13}C para IB-9212 e IB-96212B:
TABLA C
posición IB-96212\delta_{C} IB-96212B\delta_{C} posición IB- 96212\delta_{C} IB-96212B\delta_{C}
1 165.2 165.3 28 33.1 32.8
2 122.7 122.5 29 28.8 28.8
3 150.7 150.7 30 31.7 31.7
4 42.5 42.0 31 74.1 74.2
5 80.8 80.6 32 39.9 39.9
6 36.4 36.5 33 73.6 73.6
7 77.5 78.6 34 28.8 28.8
8 83.5 74.0 35 9.7 9.7
9 71.6 73.0 36 18.4 18.2
10 69.1 71.0 37 4.5 4.9
11 70.9 72.1 38 38.0 38.4
12 76.7 77.5 39 17.2 17.2
13 68.0 70.6 40 15.2 15.2
14 34.0 34.3 41 15.0 15.1
15 39.2 39.2 42 46.9 46.7
16 131.6 131.5 43 65.3 65.4
17 133.1 133.2 44 24.8 24.8
18 132.1 132.3 45 6.7 6.5
19 137.5 137.5 46 12.4 12.3
20 41.8 41.2 47 18.2 18.1
21 33.1 33.1 48 9.8
22 32.2 31.7 1' 104.4
23 68.9 68.7 2' 31.0
24 36.7 37.0 3' 31.9
25 76.7 76.6 4' 71.4
26 38.7 38.8 5' 77.6
27 99.1 99.1 6' 18.7
Inicialmente sobre la base de los datos de las Figuras 1 a 6, asignamos la estructura ilustrada en nuestra presentación de patente GB de prioridad, pero haciendo uso de los datos adicionales de las Figuras posteriores tanto para IB- 96212 como para IB-96212B, llegamos a la estructura de IB-96212 como sigue:
4
El sustituyente del azúcar puede ser retirado mediante hidrólisis para dejar el compuesto IB-96212B de fórmula:
5
El azúcar de IB-96212 puede ser derivatizado de manera convencional, o bien el IB-96212B puede ser derivatizado de manera convencional para sustituir el azúcar con otro grupo sustituyente, obteniendo con ello un compuesto de la fórmula:
6
donde R puede ser variado como se desee.
Actividad biológica
El compuesto IB-96212 presenta buena actividad antibacteriana contra Micrococcus luteus y alguna actividad contra Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis pero a concentraciones más altas. La actividad antimicrobiana del compuesto IB-96212 fue estudiada incubando cepas seleccionadas con distintas concentraciones de IB-96212 en medio líquido de Mueller-Hinton a 35ºC.
Los compuestos IB-96212 e IB-96212B despliegan buena actividad antitumoral contra varias líneas de células cancerosas de mamífero. La actividad antitumoral ha sido detectada in vitro cultivando las células tumorales siguiendo la metodología descrita por Bergeron et al. (2) y por Schroeder et al. (6). Ha sido observada actividad contra varios tumores humanos tales como la leucemia, el carcinoma de colon, el carcinoma de pulmón no células pequeñas, el melanoma y tumores similares.
Algunos tumores eran más sensitivos que otros. Por ejemplo, se comprobó que las células de leucemia y las células de leucemia resistentes a drogas múltiples eran al menos 100 veces más sensitivas que el carcinoma de colon.
La actividad in vivo fue también valorada en grupos de ratones hembra con P388, mediante inyección cada día de los días 1 a 5, habiendo sido obtenidos los siguientes resultados que están indicados en la Tabla 4.
TABLA 4
mg/kg total peso corporal variación del peso día de la muerte tiempo de supervivencia
dosis inyec. total día 0 día 5
IB-96212 0.02 0.1 21.6\pm0.5 22.6\pm0.5 0.8 2,6,10,10,13 8.2\pm3.8
IB-96212 0.01 0.05 20.6\pm1.0 21.7\pm0.7 1.1 9,11,13,13,14 12.0\pm1.8
IB-96212 0.005 0.025 22.0\pm1.2 22.9\pm0.6 0.8 10,10,11,11,13 11.0\pm1.1
POS 21.0\pm1.2 21.4\pm1.1 0.5 8,8,8,8,8,9,9,9 8.4\pm0.5
La presente invención se refiere también a preparaciones farmacéuticas que contienen como ingrediente activo compuesto IB-96212 o IB-96212B u otro derivado de la fórmula general indicada, así como a los procesos para su preparación.
Los ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualesquiera formas sólidas (tabletas, píldoras, cápsulas, gránulos, etc.) o líquidas (soluciones, suspensiones o emulsiones) que tengan una composición adecuada para la administración oral, tópica o parenteral, y pueden contener el compuesto puro, o las composiciones pueden tener que ser estériles cuando sean administradas por vía parenteral.
La dosificación correcta de una composición farmacéutica de IB-96212, IB- 96212B o un derivado variará según la formulación concreta, el modo de aplicación y el situs, el huésped y el tumor que en concreto se traten. Deberán ser tomados en consideración otros factores tales como la edad, el peso corporal, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la velocidad de excreción, el estado del huésped, las combinaciones de drogas, las sensitividades reactivas y la gravedad de la enfermedad. La administración puede ser llevada a cabo de manera continua o periódica dentro de la dosis máxima tolerada.
Ejemplos de la invención
Se ilustra a continuación más ampliamente la presente invención haciendo referencia a los ejemplos siguientes, que servirán de ayuda para comprender la presente invención pero no deberán ser interpretados como limitaciones de la misma. A no ser que se especifique lo contrario, todos los porcentajes aquí indicados son porcentajes en peso. Todas las temperaturas son expresadas en grados Celsius. Todas las incubaciones son efectuadas a 28ºC, y los matraces son sacudidos en un sacudidor orbital. Todos los medios y recipientes son estériles, y todos los procesos de cultivo son asépticos.
Ejemplo 1
Cultivo Madre: Se conserva congelado en glicerol al 20% caldo entero de un cultivo puro de Micromonospora sp. ES25-008.
Inóculo: Es usado un cultivo congelado o un cultivo inclinado en avanzado crecimiento (5% volumétrico) para sembrar 100 ml de medio de siembra anteriormente descrito contenido en un matraz de sacudimiento de 250 cm^{3}. El matraz es incubado durante 48 horas. 500 ml del mismo medio en matraz Erlenmeyer de 2 l son sembrados con un 10% del inóculo de la primera etapa. El matraz es incubado durante 48 horas.
Fermentación: Con 2,5 l de inóculo de la segunda etapa se siembran 50 l de medio de producción ya descrito en un tanque de fermentación de 17 l. La fermentación es efectuada durante 96 horas con agitación a 400 rpm y un caudal de aire de 0,5 V/V.M. Se verifica la producción de metabolito secundario mediante análisis del caldo entero contra P-388 o por HPLC.
Ejemplo 2
Aislamiento: 10 l de caldo entero recolectado fueron filtrados para separar la biomasa y otros sólidos. La torta de micelios fue sometida a extracción dos veces con un disolvente mixto (2,4 l) de CHCl_{3}:CH_{3}OH:H_{2}O (2:1:1), quedando la actividad concentrada en la capa inferior. El disolvente orgánico fue concentrado y evaporado hasta la sequedad in vacuo, habiendo sido así obtenidos 450 mg de extracto bruto.
El extracto fue sometido a cromatografía sobre gel de sílice usando como disolvente eluyente una mezcla de hexano y acetato de etilo. Fueron eluídos con hexano/acetato de etilo 30:70 44 mg de una fracción con actividad antitumoral. Se logró una purificación adicional mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice, y la actividad fue eluída con cloroformo/metanol 92:8, habiendo sido así obtenidos 19 mg de sustancia seca. La última purificación fue efectuada mediante cromatografía en columna sobre fase invertida C18 usando metanol/agua 90:10 como disolvente eluyente, habiendo sido así obtenidos 12 mg de IB-96212 puro.
Ejemplo 3
Hidrólisis para la conversión en IB-96212B: 31 mg de IB-96212 fueron disueltos en 3 ml de CHCl_{3}:CH_{3}OH 1:1 y fueron añadidos a 10ml de una solución al 15% de H_{2}SO_{4}, y la mezcla fue mantenida en reflujo por espacio de 3 horas. La mezcla de reacción fue diluida con 15 ml de agua y fue sometida a extracción dos veces con 25 ml de CHCl_{3}, para obtener 30 mg de producto de reacción que fue analizado por cromatografía sobre gel de sílice y eluído con CHCl_{3}:CH_{3}OH 96:4. Como producto de la hidrólisis fueron obtenidos 20 mg de la aglicona.
Ejemplo 4
Actividad biológica: Las células empleadas para los experimentos de la actividad antitumoral fueron P-388 (cultivo en suspensión de un neoplasma linfoide de ratón DBA/2) A-549 (cultivo monocapa de un carcinoma de pulmón macrocítico humano), HT-29 (cultivo monocapa de un carcinoma de colon humano) y MEL-28 (cultivo monocapa de un melanoma humano) y las otras líneas celulares indicadas.
Fueron sembradas células P-388 en cavidades de 16 mm a razón de 1x10^{4} células por cavidad en partes alícuotas de 1ml de MEM 5FCS que contenía la concentración de droga indicada. Los de un conjunto aparte de cultivos sin droga fueron sembrados como control del crecimiento para asegurar que las células permaneciesen en la fase exponencial de crecimiento. Todas las determinaciones fueron efectuadas por duplicado. Después de tres días de incubación a 37º en atmósfera de CO_{2} al 10% con una humedad de un 98%, las cavidades fueron coloreadas con violeta cristal al 0,1%. La IC50 fue calculada comparando el crecimiento en las cavidades con droga con el crecimiento en las cavidades de control sin la droga.
En la Tabla 5 están indicadas las actividades expresadas como IC50 en mcg/ml
TABLA 5
Compuesto P-388 P388MDR MIEL8226 A-549 HT-29 MEL-28 CV1
IB-96212 0.0001 0.001 0.005 1.00 1.00 1.00 0.0002
IB-96212B 0.001 1 1.2 1 0.001
cisplatino 2.5 2.5 2.5 5 2.5
adriamicina 0.02 1 0.002 0.05 0.02
taxol 0.2 >2 0.002 0.002 0.002
etopósido 0.1 10 0.1 1 0.5
La actividad antimicrobiana del compuesto IB-96212 fue estudiada incubando los microorganismos sometidos a ensayo con IB-96212 en medio líquido de Mueller- Hinton a 35ºC. La MIC fue determinada mediante la aparición de turbidez en el medio de incubación tras 24 horas de incubación con IB-96212. En la Tabla 6 están indicados estos resultados. El IB-96212 presenta actividad bactericida contra bacterias grampositivas.
TABLA 6
Microorganismo MIC(\mug/ml)
Escherichia coli >100
Klebsiella pneumoniae >100
Pseudomonas aeruginosa >100
Staphylococcus aureus 100
Bacillus subtilis 100
Micrococcus luteus 0.4
Referencias
Han sido citadas en la presente las referencias siguientes:
(1)
American Type Culture Catalog 17th edition 1989. Rockville, Md. U.S.A.
(2)
Bergeron, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm., 121:848, 1984
(3)
Guerrant G. O., and C. W. Moss, Anal. Chem. 56:633, 1984
(4)
Lechevalier M. P., et al. J. Bacteriol. 105:313, 1971
(5)
Luedernann G. M. Personal Communication
(6)
Schroeder, et al., J. Med. Chem., 24:1078, 1981
(7)
Shirling B. E., and D. Goblieb. Int. J. Syst. Bacteriol. 16:313, 1966
(8)
Van der Auwera et al. J. Microbiol. Methods 4:265, 1986
(9)
Waksman, S. A. The Actinomycetcs vol. II: 331, 1961
La presente invención ha sido descrita en detalle, incluyendo las realizaciones preferidas de la misma. Sin embargo, se comprenderá que tomando en consideración la presente descripción los expertos en la materia pueden incorporar modificaciones y/o mejoramientos.

Claims (13)

1. Compuesto de la fórmula general:
7
donde R es hidrógeno o un grupo sustituyente.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que R es hidrógeno o un grupo seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de un grupo sacárido, un grupo hidrocarbilo, un grupo acilo o un grupo heterociclilo.
3. Compuesto según la reivindicación 1, que es el compuesto al que aquí se denomina IB-96212 y tiene la estructura siguiente:
8
o el compuesto al que aquí se denomina IB-96212B, y que tiene la estructura siguiente:
9
4. El compuesto al que aquí se denomina IB-96212 según la reivindicación 1, donde:
la Figura 1 es un cromatograma de HPLC de IB-96212 purificado;
la Figura 2 es un espectro ultravioleta (UV) de IB-96212 purificado;
la Figura 3 es un espectro infrarrojo (IR) de IB-96212 purificado;
la Figura 4 es un espectro de RMN protónica (de 1H) de IB-96212 purificado;
la Figura 5 es un espectro de RMN de carbono-13 (13C) de IB-96212 purificado; y
la Figura 6 es un espectro de masa de IB-96212 purificado.
5. Proceso que es para producir el compuesto IB-96212 según la reivindicación 3 ó 4 y comprende el paso de cultivar una cepa de un microorganismo capaz de producir el compuesto IB-96212 en un medio nutritivo acuoso bajo condiciones controladas.
6. El proceso de la reivindicación 5, que comprende además los pasos de aislar y purificar el compuesto IB-96212 a partir del caldo de cultivo.
7. El proceso de la reivindicación 5 ó 6, en el que el microorganismo productor de IB-96212 es la cepa de cultivo ES25-008 que está depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de registro de entrada CECT- 3333.
8. Proceso que es para producir el compuesto IB-96212B de la reivindicación 3 y comprende la hidrólisis del compuesto IB-96212 de la reivindicación 3.
9. Proceso para producir un compuesto según la reivindicación 1 en el cual R no es hidrógeno, comprendiendo dicho proceso la derivatización del compuesto de la reivindicación 1 en el que R es hidrógeno.
10. Uso de un compuesto de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cánceres de mamífero sensibles al compuesto.
11. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 1.
12. Composición farmacéutica antitumoral que comprende el compuesto IB- 96212 o IB-96212B en una cantidad eficaz contra uno o varios tumores de mamífero.
\newpage
13. La cepa Micromonospora sp. ES25-008 que ha sido depositada con el número de registro de entrada CECT-3333.
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