MXPA00001303A - Macrolidos con actividad anti-tumoral. - Google Patents

Abstract

El compuesto aqui presentado como IB96212, teniendo la estructura (i) puede ser obtenido cultivando la cepa Micromonospora sp. ES25-008, disponible bajo el numero de acceso CECT-3383, y pueden ser hidrolizada para dar IB-96212B teniendo la estructura (II). El substituyente de azucar, el cual es L-rodinosa por si mismo puede ser derivatizado o el azucar puede ser remplazado, en cualquier caso dando derivados adicionales de IB-96212 teniendo un grupo diferente a L-rodinosa en la posicion del azucar.

Description

MACROLIDOS CON ACTIVIDAD ANTITUMORAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un compuesto macrólido novedoso aislado del caldo de cultivo de un nuevo organismo microbiano marino. La presente invención además se refiere a la producción del compuesto novedoso a través de fermentación aeróbica bajo condiciones controladas y su aislamiento y purificación, así como a compuestos derivados, y a aspectos adicionales basados en el descubrimiento de actividades.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los macrólidos denominados oligomicinas y homo-oligomicinas son conocidos de J. Antibiotics 46:1334-1341, 1993; J, Antibiotics 45: 171-179, 1992; y J. Antibiotics 49: 1275-1277, 1996.

OBJETOS DE LA INVENCIÓN Se siguen necesitando nuevos compuestos antiproliferativos para el tratamiento de varios tumores en seres humanos, debido al hecho de que un alto número de líneas de célula de cáncer, incluyendo aquellas que exhiben fenotipo MDR no son suficientemente tratadas por ningún fármaco.

Otro objeto más de esta invención es proporcionar composiciones farmacéuticas para administrar a un paciente con la necesidad de dicho tratamiento con el compuesto activo. Los productos microbianos son interesantes debido a que su producción industrial está bien establecida en la actualidad . Por lo tanto, otro objeto de esta invención está dirigido a la producción del compuesto activo y a su aislamiento y purificación a partir del caldo de fermentación resultante, así como a la hidrólisis a un compuesto aglicona y derivatización a compuestos relacionados.

COM PENDIO DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona un compuesto con una estructura de tipo macrólido, desig nada I B-96212 , de la sig uiente fórmula : Un proceso para obtener IB-96212 también se proporciona, y el proceso preferido comprende cultivar una cepa de un microorganismo capaz de producir IB-96212 en un medio nutriente acuoso con fuentes asimilables de carbono y nitrógeno y sales, bajo condiciones aeróbicas controladas y sumergidas. El mismo calor resultante, ya sea no purificado o parcialmente purificado y teniendo actividad antitumoral, también es parte de esta invención. El compuesto IB-96212 puede ser recuperado y purificado del caldo cultivado. El compuesto y el caldo de fermentación demuestran actividad de interés contra varias células cancerosas humanas, entre ellas células de leucemia sensibles y resistentes a fármacos múltiples (MDR). Además, IB-96212 presenta actividad antibiótica contra algunas bacterias Gram-positivas. A partir de este compuesto IB-96212, se puede remover a través de hidrólisis un azúcar tridesoxi identificada como L-rodinosa, dejando el compuesto aglicona activo IB-96212B, el cual tiene el sistema de anillo de macrólido de 26 miembros en el núcleo del IB-96212 de origen. De esta manera, la invención además proporciona el compuesto IB-96212B con la estructura: IB-96212B tiene actividad comparable con 113-96212 de origen. En el compuesto IB-96212, el azúcar tridesoxi, el cual se identifica como L-rodinosa, por si mismo puede ser derivatizado o el azúcar puede ser reemplazado, en cualquier caso dando derivados adicionales de IB-96212 teniendo un grupo diferente a L-rodinosa en la posición del azúcar. De esta manera, más ampliamente, la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula general: en donde R es hidrógeno o un grupo substituyente. Ilustrativamente, R es hidrógeno, o un grupo seleccionado de un grupo sacárido, un grupo hidrocarbilo, un grupo acilo, un grupo heterociclilo, o algún otro substituyente adecuado. La naturaleza del grupo substituyente no es crítica. El grupo sacárido convenientemente es un mono, di o trisacárido, el cual puede ser desoxisacárido. El hidrocarbilo puede ser alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo o alquilarilo, especialmente alquilo de d-Ce, cicloalquilo (C4-C8), fenilo, naftilo o bencilo. El grupo heterociclilo puede ser un anillo de 4 a 8 miembros teniendo de 1 a 4 átomos heterogéneos, especialmente un anillo de 5 o 6 miembros teniendo 1 o 2 átomos heterogéneos seleccionados de oxígeno, azufre o nitrógeno. El grupo hidrocarbilo, el grupo acilo o el grupo heterociclilo por sí mismos pueden ser substituidos, por ejemplo, con 1, 2 o 3 substituyentes seleccionados entre alquilo de C^Ce, alcoxi de C^Ce, halógeno, hidroxi, amino, u otros grupos.

El cultivo preferido para obtener IB-96212 es una nueva cepa designada ES25-008, y sus caracteres químicos, bioquímicos y morfológicos mostrados que pertenecen al género Micromonospora, siendo taxonómicamente clasificados como Micromonospora sp. Como se describió anteriormente, se ha encontrado que los compuestos IB-96212 y IB-96212B son efectivos para inhibir la actividad proliferativa de varias células de leucemia humanas y de murino resistentes a fármacos múltiples (MDR) así como líneas de células sensibles, así como agonistas de otros tumores humanos. Se sabe que otros compuestos de la fórmula general dada retendrán dicha actividad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un cromatograma de HPL C IB-96212 purificado; La Figura 2 es un espectro ultravioleta (UV) de IB-96212 purificado; La Figura 3 es un espectro infrarrojo (IR) de IB-96212 purificado; La Figura 4 es un espectro de NMR de protón (1H) de IB-96212 purificado; La Figura 5 es un espectro de NMR de carbono-13 (13C) de IB-96212 purificado; La Figura 6 es un espectro de masa de IB-96212 purificado; La Figura 7 es un espectro de NMR de HMBC de IB-96212 tomado en acetona-d6; La Figura 8 es un espectro de NMR de COSY de IB-96212 tomado en acetona-d6; La Figura 9 es un espectro de NMR 132 Hz de HMQC de IB-96212 tomado en acetona-d6; La Figura 10 muestra las correlaciones de NMR de IB-96212B; La Figura 11 es un espectro de masa de IB-96212B; La Figura 12 es un espectro de NMR de 60 ms de HMBC de IB-96212B tomado en acetona-d6; La Figura 13 es un espectro de NMR de 110 ms de HMBC de IB- 96212B tomado en acetona-d6; La Figura 14 es un espectro de NMR de COSY de IB-96212B tomado en acetona-d6; y La Figura 15 es un espectro de NMR de 145 Hz de HMQC de IB-96212B tomado de acetona-d6.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El Organismo de Producción: El micro-organismo utilizado para la producción de IB-96212 y de esta manera para IB-96212B es preferiblemente Micromonospora sp. cepa ES25-008, un cultivo que ha sido depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo en la Universidad de Valencia, España bajo el número de acceso CECT 3333. Este depósito se hizo bajo las provisiones de Tratado de Budapest y se le proporciono la fecha de depósito del 4 de agosto de 1997. El organismo fue aislado de una esponja marina no identificada. Los métodos taxonómicos descritos aquí son aquellos reportados en el Cuadro 1. Todos los cultivos fueron incubados a 27°C y se realizaron registros de resultados semanalmente hasta 21 días.

CUADRO 1 1. Medios para estudios de morfología de colonia: Medio ISP Nos. 2, 3, 5 y 6: Shirling & Gotlieb. (7). Medio ATCC No. 172: Catálogo ATCC. Czapek Agar Difco Agar Bennet, Waksman. (9) Agar de Agua al 1.5%, Luedemann (5) Todos los medios fueron suplementados con ASW al 50%. 2. Estudios característicos fisiológicos: Medio ISP No. 1, Shirling y Gotlieb. (7) Resistencia NaCI: ATCC 172 con 0, 2, 4, 7 y 10% de NaCl. Utilización de carbono: ISP-9, E. B. Shirling & D. Gotlieb. (7) 3. Estudios de composición guímica: Análisis de ácidos grasos, Van der Auwera y otros (8) Análisis de azúcar de célula entera, Guerrant y Moss. (3) Una descripción del organismo es como sigue: Morfología: Después de 21 días a 28°C, se observó un crecimiento en el caldo ISP2 y 172 suplementado con agua de mar artificial (ASW). Se observaron varias sombras de color naranja en los diferentes medios estudiados. No se formó ningún micelio aéreo. El micelio de substrato se ramificó. Las esporas terminales aisladas sobre el micelio de substrato, ocurrieron. Las esporas fueron esféricas. Se pudo detectar en alguno de los medios algo de sobre crecimiento de la masa de micelios, y después de por lo menos 14 días de incubación.

Características fisiológicas: No se encontraron pigmentos capaces de difusión a través de la cepa ES25-008, ni en los medios sólidos ni líquidos. La resistencia al NaCI fue sobre el 4%. La escala de temperatura de crecimiento óptima fue entre 25°C y 35°C. El organismo creció sobre glucosa, sacarosa, xilosa y mañosa como la única fuente de carbono, sin embargo, el crecimiento sobre rafinosa, inositol, galactosa, fructosa, melibiosa, etanol, glicerol y ramanosa fue negativa, y el crecimiento sobre manitol fue incierto.

Composición química de la célula: Aminoácidos: Estuvo presente ácido Meso-2,6-diaminopimélico en el hidrolizato de célula entera de la cepa ES25-008. Ácidos grasos: Composición de FAME es como sigue en el Cuadro 2.

CUADRO 2 13:0 i-14:0 14:0 ¡-15:0 n-15:0 15:0 i-16:1 ¡-16:0 16:1 16:0 <1 <1 <1 8.21 1.00 1.09 <1 35.07 <1 1.12 ¡-17:1 ¡-17:0 n-17:0 17:1 17:0 i-18:1 i-18:0 Cis-18:1 18:1 <1 3.18 3.39 29.49 7.88 1.44 <1 2.30 <1 Azúcares: El patrón de azúcar de célula entera mostró la presencia de xilosa, ribosa y glucosa cuando se analizó a través de cromatografía de gas. Se detectó arabinosa en cantidades huella. Este patrón agrupó esta cepa dentro del grupo D de Lechevalier y otros (4). Otros azúcares detectados fueron mañosa, galactosa, m-inositol y manosamina. El arabitol de polialcohol y el ácido murámico fueron otros componentes celulares. No se detectó madurosa. Con base en las características precedentes, el cultivo fue determinado como una especie del género micromonoespora, sin ninguna similitud a ninguna de las cepas de tipo conocido de este género disponible en las colecciones internacionales. La semejante más cercana mediante análisis cromatográficp de ácido graso fue Micromonospora chalcea ATCC 31395 solamente con una similitud del 80%. Aunque el organismo depositado es claramente preferido, la presente invención no está restringida o limitada a esta cepa u organismos particulares. La intensión de la presente invención es incluir cualquier otro organismo productor de IB-96212, cepas o mutantes dentro del alcance de esta invención.

Fermentación: La micromonoespora sp. ES25-008 cuando se cultiva bajo condiciones controladas en un medio adecuado, produce el antibiótico IB-96212. Esta cepa se desarroiló en un medio nutriente acuoso, bajo condiciones aeróbicas y mesofílicas, preferiblemente de entre 24°C y 35°C a una escala de pH de entre 6.0 y 8.0. Una amplia variedad de medios de cultivo líquidos puede ser utilizada para el cultivo del organismo, los medios útiles son aquellos que incluyen una fuente de carbono asimilable tal como almidón, dextrina, melazas de azúcar, glicerol, glucosa, sacarosa, y similares. Una fuente, una fuente de nitrógeno asimilable tal como proteínas, hidrolizatos de proteína, harinas desgrasadas, mazorca, y similares, y aniones y cationes inorgánicos útiles tales como sodio, magnesio, potasio, amonio, sulfato, cloro, fosfato, carbonato, y similares. También se pueden agregar elementos huella. La aireación preferiblemente se logra suministrando aire al medio de fermentación. Se proporciona agitación a través de un impulsor mecánico. Se encontró tanques de fermentación convencionales son muy adecuados para realizar el cultivo de este organismo. La adición de n utrientes y el pH de control así como agentes antiespumantes durante las diferentes etapas de fermentación , puede ser necesaria para incrementar la producción y evitar la formación de espuma. Los pasos requeridos para la producción de I B-96212 a través del organismo preferido son : Empezar con micelio congelado o liofilizado. Obtener una masa micelial cultivando las células iniciales en matraces de agitación con u n medio de cultivo conteniendo alg unos de los ingredientes descritos anteriormente a tem peraturas mesofílicas y bajo condiciones aeróbicas, este paso puede ser repetido varias veces según sea necesario y el material recolectado será utilizado como un inoculo para sembrar uno o más tanques de fermentación con el medio de cultivo apropiado, si se desea , estos tanques pueden ser utilizados tam bién com o inoculo , y este paso puede ser repetido varias veces cuando sea necesario , o pueden servir com o la etapa de producción , dependiendo del vol umen de caldo necesario . Algunas veces, el medio de producción puede ser diferente de aquel utilizado como inoculo . En el Cuadro 3 , se describen medios típicos q ue pueden ser utilizados para el desarrollo de inoculo y la producción de I B-9621 2.

CUADRO 3 Medio de Inoculo Medio de Producción Glucosa 5g Glucosa 5 g Almidón 20 g Almidón 20 g Extracto de carne 3 g Harina de soya 15 g Extracto de levadura 5 g Extracto de levadura 5 g Triptona 5g Triptona 2 g CaCO34 g CaCO34 g NaCI 4 g NaCI 4 g Na2SO4 1 g Na2SO4 1 g KCl 0.5 g KCl 0.5 g MgCI22 g MgCI22 g K2HPO4 0.5 g K2HPO40.5 g Agua corriente para 1,000 ml Agua corriente para 1,000 ml La producción de IB-96212 puede ser verificada a través de un ensayo completo de caldo contra leucemia de murino de línea de célula P-388 o por HPLC.

AISLAMIENTO DE IB-96212 El antibiótico IB-96212 puede ser aislado de la torta de micelio a través de extracción con una mezcla adecuada de solvente tal como CHCI3:CH3OH:H2O. La actividad se concentró en la inferior. Los extractos de dos extracciones repetidas pueden ser combinados y evaporados a sequedad al vacío. La separación y purificación de IB-96212 del extracto antiguo crudo puede realizarse a través del uso de la combinación apropiada de técnicas cromatográficas convencionales. El fraccionamiento puede ser guiado a través de la actividad antitumoral de fracciones, o a través de TLC visualizado con vainillina en H2SO concentrado o HPLC analítico con detector de disposición de diodo. Se realizaron análisis de HPLC a temperatura ambiente (Waters RCM 8x10, 8C18 19 cartucho) utilizando como fase móvil metanokagua, 92:8, y una velocidad de flujo de 2 mm/min, y se graficaron a 225 nm. Bajo estas condiciones, el tiempo de retención de IB-96212 es de 3.64 min como se muestra en la Figura 1. Con base en el análisis detallado para sus características espectrales, el compuesto puro puede ser identificado como IB-96212 (ver datos producidos en las Figuras 2 a 6). El espectro UV muestra la absorción a 225 mn según reportado en la Figura 2. El espectro de absorción infrarrojo en KBr se muestra en la Figura 3 de los dibujos anexos. Los espectros de 1H y 13C N. M. R. Se reportan en la Figura 4 y la Figura 5, respectivamente. El espectro de FAB-MS desplegó un pico (M + Na)" a 1021, y se reporta en la Figura 6.

Los datos de 1H de NMR para IB-96212 se tabulan como sigue: Posición dH [mult.int. J(Hz) Posición dH [mult.int. J(Hz) 1 33 3.52 (1H) 2 5.80 (1H,d, 15.5) 34 1.35 (1Hm) 1.68 (1H,m) 3 6.74(1H, dd, 10.5, 15.5) 35 0.94 (3H, t, 7.5) 4 2.37 (1H, dt, 6.5, 10.0) 36 1.13 (3H, d, 6.5) 5 3.62 (1H, d, 9.0) 37 077 (3H, d, 7.0) 6 1.73 (1H, m) 38 1.40 (1H, m) 1.64 (1H,m) 7 4.02 (1H, d, 9.0) 39 1.42 (1H,m) 1.54 (1H,m) 8 3.62 (1H), d, 9.0) 40 0.91 (3H, t, 7.0) 9 3.54 (1H) 41 0.96 (3H, d, 6.5) 10 4.07 (1H, dd,4.5, 8.5) 42 1.25 (1H,m) 1.42 (1H, m) 11 3.46 (1H) 43 3.68 (1H, m) 12 44 1.08 (3H, d, 6.5) 13 3.78 (1H, dd, 1.5,6.5) 45 0.75 (3H, d, 7.0) 14 1,82 (1H, m) 46 0.92 (3H, d, 7.0) 15 1.98 (1H, m) 47 (0.78 (3H, d, 6.0) 2.19 (1H, m) 16 5.42 (1H, ddd, 3.5, 10.5, 145) 48 0.82 (3H, d, 7.0) 17 6.03 (1H, dd, 10.5, 14.5) 5-OH 4.21 (1H, s) 18 6.01 (1H, dd, 10.5, 14.5) 7-OH 4.90 (1H,s) 19 5.16 (1H, dd, 10.0, 14.5) 9-OH 3.50 (1H,s) 20 2.26 (1H, dt, 10.0) 10-OH 4.50 (1H, d, 4.5) 21 1.40 (1H,m) 11 -OH 3.53 (1H,s) 1.64 (1H, m) 22 0.92 (1H,m) 12-OH 3.75 (1H,s) 1.58 (1H,m) 23 3.92 (1H,d, 10.5) 13-OH 4.43 (1H, d, 6.5) 24 1.95 (1H, m) 33-OH 3.38 (1H, d, 6.0) 25 4.81 (1H, dd, 5.0, 11.5) 43-OH 3.39 (1H, d, 6.0) 26 1,75 (1H) r 4.54 (1H, dd, 1.5,7.7) 27 2' 1.43 (1H, m) 2.09 (1H, dt, 2.0, 8.5) 28 1.40 (1H,m) 3' 1.46 (1H, m) 1.75 (1H,m) 1.93 (1H, m) 29 1.49 (1H, m) 4' 3.15 (1H, sep, 5.0) 1.65 (1H, m) 30 1.49 (1H,m) 5' 3.31 (1H, dq, 2.5, 6.0) 31 3.82 (1H,d, 10.5) 6' 1.24 (3H,d, 6.0) 32 1.66 (1H, m) 4'-OH 4.04 (1H, d, 5.0) Los datos de 1H de NMR para IB-96212B se tabulan como sigue: Posición dH [mult.int. J(Hz) Posición dH [mult.int. J(Hz) 1 33 3.55 (1H, m) 2 5.80 (1H,d, 15.5) 34 1.37 (1Hm) 1.70 (1H,m) 3 6.75 (1H, dd, 10.5, 15.5) 35 0.95 (3H, t, 7.5) 4 2.45 (1H,dt, 6.5, 1 0.0) 36 1.14 (3H, d, 6.5) 5 3.65 (1H) 37 0.85 (3H, d, 7.0) 6 1.75 (1H, m) 38 1.44 (1H, m) 1.59 (1H, m) 7 3.94 (1H, d, 8.0) 39 1.35 (1H, m) 1.55 (1H, m) 8 3.62 (1H) 40 0.88 (3H, t, 7.0) 9 3.63 (1H) 41 0.98 (3H, d, 6.5) 10 4.14 (1H, d, 6.5) 42 1.25 (1H, m) 1.45 (1H, m) 11 3.50 (1H) 43 3.80 (1H, m) 12 44 1.08 (3H) 13 3.78 (1H, s amplia) I 45 0.78 (3H, d, 7.0) 14 1.85 (1H, m) 46 0.93 (3H, d, 7.0) 15 2.10 (1H, m) 47 (0.80 (3H, d, 6.0) 2.22 (1H, ) 16 5.45 (1H, ddd, 3.5, 10.5, 14.5) 48 0.83 (3H, d, 7.0) 17 6.01 (1H, dd, 10.0, 14.5) 5-OH 18 6.08(1H,dd, 10.0, 14.5) 7-OH 19 5.18 (1H, dd, 10.5, 14.5) 9-OH 20 2.35 (1H, dt, 10.0) 10-OH 21 1.46 (1H,m) 11 -OH 1.65 (1H,m) 22 1.02 (1H,m) 12-OH 1.60 (1H,m) 23 3.96 (1H,d, 10.5) 13-OH 4.24 (1H,s amplia) 24 1.93 (1H,m) 3340H 3.40 (1H, d, 6.4) 25 4.90 (1H, dd, 5.5, 11.5) 4340H 3.43 (1H,d) 26 1.75 (1H) r 27 2' 28 1.40 (1H, m) 3' 1.77 (1H,m) 29 1.50 (1H,m) 4' 1.65 (1H, m) 30 1.52 (1H, m) 5' 31 3.84 (1H,d, 10.0) 6' 1.24 (3H, d, 6.0) 32 1.68 (1H, m) 4'-OH Los datos de 1H de NMR para IB-96212 y IB-96212B se tabulan Posición IB-96212dc IB-96212Bdc Posición IB-96212dc IB-96212Bdc 1 165.2 165.3 28 33.1 32.8 2 122.7 122.5 29 28.8 28.8 3 150.7 150.7 30 31.7 31.7 42.5 42.0 31 74.1 74.2 5 80.8 80.6 32 39.9 39.9 6 36.4 36.5 33 73.6 73.6 77.5 78.6 34 28.8 28.8 83.5 74.0 35 9.7 9.7 71.6 73.0 36 18.4 18.2 10 69.1 71.0 37 4.5 4.9 11 70.9 72.1 38 38.0 38.4 2 76.7 77.5 39 17.2 17.2 13 68.0 70.6 40 15.2 15.2 4 34.0 34.3 41 15.0 15.1 5 39.2 39.2 42 46.9 46.7 6 131.6 131.5 43 65.3 65.4 7 133.1 133.2 44 24.8 24.8 8 132.1 132.3 45 6.7 6.5 9 137.5 137.5 46 12.4 12.3 0 41.8 41.2 47 18.2 18.1 1 33.1 33.1 48 9.8 2 32.2 31.7 1' 104.4 3 68.9 68.7 2' 31.0 4 36.7 37.0 3' 31.9 5 76.7 76.6 4' 71.4 6 38.7 38.8 5' 77.6 7 99.1 99.1 6' 18.7 Inicialmente con base en los de las Figuras 1 a 6, se asignó la estructura mostrada en la prioridad de patente GB presentada, pero con el beneficio de los datos adicionales de las últimas Figuras tanto pata IB-96212 como para IB-96212B, y se llegó a la estructura de IB-96212, como sigue: El substituyente de azúcar puede ser removido a través de hidrólisis para dejar el compuesto IB-96212B de la fórmula: El azúcar es IB-96212 puede ser derivatizado en una forma convencional, o el IB-96212B puede ser derivatizado en una forma convencional para reemplazar el azúcar con otro grupo substituyente, dando así un compuesto de la fórmula: en donde R puede ser variado según se desee.

ACTIVIDAD BIOLÓGICA El compuesto IB-96212 muestra una buena actividad antibacteriana contra Micrococcus luteus y algo de actividad contra Staphylococcus aureus y Bacillus Subtilis, pero a concentraciones más altas. La actividad antimicrobiana del compuesto IB-96212 se estudió incubando cepas seleccionadas con diferentes concentraciones de IB-96212 en el medio líquido de Mueller-Hinton a 35°C. IB-96212 y IB-96212B desplegaron una buena actividad antitumoral contra varias líneas de célula de cáncer de mamífero. La actividad antitumoral fue detectada in vitro cultivando las células tumorales siguiendo la metodología descrita por Bergeron, y otros (2), y por Schroeder y otros (6). La actividad contra varios tumores humanos como leucemia, carcinoma de colón, carcinoma de pulmón NSC, melanoma, y similares, ha sido observada. Algunos tumores fueron más sensibles que otros. Por ejemplo se encontró que las células de leucemia y las células de leucemia de MDR fueron por lo menos 100 veces más sensibles que el carcinoma de colón. La actividad in vivo también fue analizada en grupos de ratones hembra con P388, a través de inyección de QD 1-5 ip, dando los siguientes resultados mostrados en el Cuadro 4.

CUADRO 4 Dosis mg/kg Peso del cuerpo Cambio de Día de muerte Tiempo de inyectada total DiaO Día 5 peso sobrevivencia IB-96212 0.02 .1 21.6±0.5 22.6±0.5 0.8 2,6,10,10,13 8.2±3.8 IB-96212 0.01 .05 20.6±1.0 21.7+0.7 1.1 9,11,13,13,14 12.0±1.8 IB-96212 0.005 .025 22.0±1.2 22.9±0.6 0.8 10,10,11,11,13 11.0±1.1 POS 21.0±1.2 21.4+1.1 0.5 8,8,8,8,8,9,9,9 8.4±0.5 La presente invención también se refiere a preparaciones farmacéuticas, las cuales contienen como compuesto de ingrediente activo IB-96212 o IB-96212B, u otro derivado de la fórmula general dada, así como los procesos para su preparación. Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualquier sólido (tabletas, pildoras, cápsulas, granulos, etc.) o líquidos (suspensiones o emulsiones en solución) con la composición adecuada para administración oral, tópica o parenteral, y pueden contener el compuesto puro o composiciones que puedan ser necesarias y que sean estériles cuando se administren parenteralmente. La dosis correcta de una composición farmacéutica de IB-96212, IB-96212B o un derivado variará de acuerdo con la formulación particular, el modo de aplicación, y el sitio particular, huésped o tumor que será tratado. Otros factores tales como la edad, peso del cuerpo, sexo, dieta, tiempo de administración, velocidad de excreción, condición del huésped, combinaciones del fármaco, sensibilidades de reacción y severidad de la enfermedad deberán ser tomados en cuenta. La administración puede ser realizada continua o periódicamente dentro de la dosis tolerada máxima.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN La presente invención será ilustrada adicionalmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, los cuales ayudan a entender la presente ¡nvención, pero los cuales no están construidos como limitaciones de la misma. Todos los porcentajes aquí reportados, a menos que se indique otra cosa, están presentados en peso. Todas las temperaturas se expresan en grados Celsius. Todas las incubaciones se realizaron a 28°C y los matraces se agitaron en un agitador orbital. Todos los medios y recipientes son estériles y todos los procesos de cultivo asépticos.

EJEMPLO 1 Cultivo de Abastecimiento: Caldo entero de un cultivo puro de Micromonoespora sp. ES25-008 se conservó congelado en glicerol al 20%. Inoculo: Un cultivo congelado o un cultivo inclinado bien desarrollado (15% volumen) se utilizó para sembrar 100 ml del medio de siembra descrito anteriormente contenido en un matraz de agitación de 250 ce. El matraz se incubó durante 48 horas, 500 ml del mismo medio en un matraz de Erlenmeyer de 2 litros se sembró con 10 ml de inoculo de primera etapa. El matraz se incubó durante 48 horas. Fermentación: Con 2.5 litros del inoculo de segunda etapa se sembraron 50 litros del medio de producción ya descrito en un tanque de fermentación de 17 litros. La fermentación se realizó durante 96 horas con una agitación a 400 rpm y un flujo de aire de 0.5 V/V.M. Se verificó la producción de metabolito secundaria a través del análisis de caldo entero contra P-388 o a través de HPLC.

EJEMPLO 2 Aislamiento; se filtraron 10 litros del caldo cosechado entero para separar la biomasa y los otros sólidos. La torta de micelio se extrajo dos veces con un solvente de mezcla (2.4 litros) de CHCI3:CH3:OH:H2O (2:1:1), la actividad se concentró en la capa inferior. El solvente orgánico se concentró y se evaporó a sequedad al vacío para producir 450 mg del extracto crudo. El extracto se cromatografió sobre gel de sílice utilizando una mezcla de hexano/acetato de etilo como el solvente de elusión. Se eluyeron 44 mg de una fracción con actividad antitumoral con hexano/acetato de etilo, 30:70. Se logró la purificación adicional a través de cromatografía de columna sobre gel de sílice y la actividad se eluyó con cloroformo/metanol, 92:8, para producir 19 mg de materia seca. La última purificación se realizó a través de cromatografía de columna sobre fase inversa C18 utilizando metanol/ agua, 90:10, como el solvente de elusión para producir 12 mg de IB-96212 puro.

EJEMPLO 3 Hidrólisis de IB-96212B: se disolvieron 31 mg de IB-96212 en 3 mi de CHCI3:CH3OH 1:1 y se agregaron a 10 ml de una solución al 15% de H S04 y se mantuvo en reflujo durante 3 horas. La mezcla de reacción se diluyó con 15 ml de agua y se extrajo 2 veces con 25 ml de CHCI3 para obtener 30 mg del producto de reacción, el cual fue analizado a través de cromatografía sobre gel de sílice y se eluyó con CHCI3.CH3OH 96:4. Se obtuvieron 20 mg de la aglicona como producto de ia hidrólisis.

EJEMPLO 4 Actividad biológica: las células antitumorales empleadas fueron P-388 (cultivo de suspensión de un neoplasma linfoide de ratón DBA/2), A-549 (cultivo de monocapa de un carcinoma de pulmón macrocítico humano, HT-29 (cultivo de monocapa de un carcinoma de colon humano), y MEL-28 (cultivo de monocapa de un melanoma humano), y de otras líneas de célula indicadas. Las células P-388 fueron sembradas en cavidades de 16 mm a 1 x 104 células por cavidad en alícuotas de 1 ml de MEM 5FCS conteniendo la concentración de fármaco indicada. Un grupo separado de cultivo sin fármaco fue cosechado como control de crecimiento para asegurar que las células permanecieron en una fase exponencial de crecimiento. Todas las determinaciones se realizaron por duplicado. Después de 3 días de incubación a 37°C en una atmósfera de CO2 al 10% con 98% de humedad, las cavidades fueron teñidas con violeta de cristal al 0.1%. La IC50 se calculó comparando el crecimiento en las cavidades con fármaco con el crecimiento en cavidades de control sin el fármaco. En el Cuadro 5 se presenta la actividad expresada como IC50 en mcg/ml.

CUADRO 5 Compuesto P-388 P388 DR MIEL8226 A-549 HT-29 MEL-28 CVI IB-96212 0.0001 0.001 0.0005 1.00 1.00 1.00 0.0002 IB-96212B 0.001 1 1.2 1 0.001 Cis-platina 2.5 2.5 2.5 5 2.5 Adriamicina 0.02 1 0.002 0.05 0.02 Taxol 0.2 >2 0.002 0.002 0.002 etopóxido 0.1 10 0.1 1 0.5 La actividad antimicroblana del compuesto IB-96212 se estudió incubando los microorganismos probados con IB-96212 en un medio líquido de Mueller-Hinton a 35°C. La MIC se determinó a través de la aparición de turbiedad en el medio de incubación después de 24 horas de incubación con IB-96212. En el Cuadro 6 se muestran estos resultados. IB-96212 muestra una actividad bactericida contra bacterias Gram positivas.

CUADRO 6 Micro-Organismo MIC (µg/ml) Escherichia coli >100 Klebsiella pneumoniae >100 Pseudomonas aeruginosa >100 Staphylococcus aureus >100 Bacillus subtilis >100 Micrococcus luteus 0.4 Referencias En la presente se citaron las siguientes referencias, y éstas se incorporan aquí por referencia: (1) American Type Culture Catalog 17th edición, 1989. Rockville, Maryland, U. S. A. (2) Bergeron y otros, Biochem. Biophys. Res. Comm., 121:848, 1984 (3) Guerrant G. O., y C. W. Moss, Anal. Chem. 56:633, 1984. (4) Lechevalier M. P., y otros, J. Bacteriol. 105:313, 1971 (5) Leudemann G. M. Personal Communication (6) Schroeder, y otros, J. Med. Chem., 24:1078, 1981. (7) Shirling B. E., y D. Goblieb. Int. J. Syst. Bacteriol. 16:313, 1966 (8) Van der Auwera y otros, J. Microbiol. Methods 4:265, 1986. (9) Waksman, S. A. The actinomycetes vol. 11:331, 1961.

La presente invención ha sido descrita con detalle, incluyendo sus modalidades preferidas, sin embargo, se apreciará que aquellos expertos en la técnica, después de considerar la presente descripción, pueden hacer modificaciones y/o mejoras.

Claims (10)

* ! 29 REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto de la fórmula: en donde R es hidrógeno o un grupo substituyente,

2.- Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R es hidrógeno, o un grupo seleccionado de un grupo sacando, un grupo hidrocarbilo, un grupo acllo o un grupo heterociclilo.

3.- Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, siendo el compuesto denominado en la presente como IB-96212, teniendo la estructura: o el compuesto denominado en ia presente como IB-96212B, teniendo la estructura:

4.- El compuesto referido en la presente como IB-96212, en donde: La Figura 1 es un cromatograma de HPLC de IB-96212 purificado; La Figura 2 es un espectro ultravioleta (UV) de IB-96212 purificado; La Figura 3 es un espectro infrarrojo (IR) de IB-96212 purificado; La Figura 4 es un espectro de NMR de protón (1H) de IB-96212 purificado; La Figura 5 es un espectro de NMR de carbono-13 (13C) de IB-96212 purificado; La Figura 6 es un espectro de masa de IB-96212 purificado;

5.- El proceso para producir el compuesto IB-96212, de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, que comprende cultivar una cepa de un microorganismo capaz de producir el compuesto IB-96212 en un medio nutriente acuoso bajo condiciones controladas.

6.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además aislar y purificar el compuesto IB-96212 del caldo de cultivo.

7.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en donde el microorganismo de producción de IB-96212 es la cepa de cultivo substancialmente pura ES25-008, disponible bajo el número de acceso CECT-3333, de la Colección Española de Cultivos Tipo.

8.- Un proceso para producir el compuesto IB-96212B de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende la hidrólisis del compuesto IB-96212 de la reivindicación 3.

9.- Un proceso para producir un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R no es hidrógeno, que comprende la derivatización del compuesto de la reivindicación 1 , en donde R es hidrógeno.

10.- El uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 , para el tratam iento de cánceres de mam ífero sensibles al compuesto. 1 1 .- Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 . 12.- Una composición farmacéutica antitumoral que comprende el compuesto IB-96212 o IB-96212B en una cantidad efectiva contra uno o más tumores de mamífero. 13.- La cepa Micromonospora sp ES25-008, disponible bajo el número de acceso CECT-3333.