CN115197192B - 一种大环内酯化合物曲霉内酯a - Google Patents

一种大环内酯化合物曲霉内酯a Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种曲霉大环内酯衍生物曲霉内酯A，涉及曲霉大环内酯制备方法及其抗菌应用技术领域，化合物的结构式如说明书附图1所示，该曲霉内酯A为一种新结构的6,7位双键且5,9位为双羟基取代的大环内酯化合物曲霉内酯A，在后续的抗菌活性测试中，曲霉内酯A能显著抑制4株人体致病细菌生长，MIC为6.4～12.6μg/mL，且对2株农业致病细菌抑菌效果显著，对魔芋软腐菌的MIC为9.8μg/mL，对猕猴桃细菌性溃疡病菌的MIC为4.0μg/mL，曲霉内酯A能显著抑制污染猪肉金葡菌和枯草菌的生长，延长食品的储存时间，曲霉内酯A可以在制备抗菌药物及抗菌农药前体中应用，为下一步抗菌成分的医药及农药研究应用奠定了物质基础。

Description

一种大环内酯化合物曲霉内酯A
技术领域
本发明涉及曲霉大环内酯制备方法及其抗菌应用技术领域，具体为一种大环内酯化合物曲霉内酯A。
背景技术
抗生素的发现和应用是人类医药史上的杰出贡献。但是，抗生素的滥用引起了病原菌耐药性日益增强，使得临床可用的抗生素日渐缺乏，造成耐药菌感染的形势越发严峻。随着经济贸易全球化，耐药菌株在国际间迅速传播，导致细菌耐药现象在全球的飞速扩散。病原微生物也会造成食品污染，造成食品的腐败和变质，危害人类健康。
对细菌耐药性的遏制策略主要集中在两个方面，一是维持现有抗菌药的有效性，包括预防感染、合理用药、联合用药、改良剂型等；二是促进抗菌新药的开发，包括加快开发合适的新药和疫苗等。新型抗菌药物的结构类型与传统抗生素不同，作用机制也有差别，所以能对耐药菌发挥疗效，并且不会产生交叉耐药性。与传统的放线菌源抗生素相比，真菌源的抗生素呈高速发展的趋势，数目逐渐增多。因此，加快新的抗菌药物研究，发现新结构的抗菌物质，解决耐药菌问题，为临床提供更有效的药物前体化合物，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
（一）
针对现有技术的不足，本发明提供了一种大环内酯化合物曲霉内酯A，该化合物可以在制备抗菌药物及抗菌农药前体中应用，为抗菌药物开发提供了有效的药物前体，也为下一步的药效研究奠定了物质基础。
（二）
为实现上述为抗菌药物开发提供了有效的药物前体以及为下一步的药效研究奠定了物质基础目的，本发明提出了一种新结构的大环内酯化合物曲霉内酯A，常见的24元大环内酯为4,5位双键且7位为羟基取代，本发明提出的曲霉内酯A为6,7位双键且5,9位为双羟基取代，化合物的结构式如说明书附图1所示：
根据本发明的第二方面，提出了大环内酯化合物曲霉内酯A在用于制备抗菌药物和抗菌农药前体中的应用。
根据本发明的第三方面，提出了制备大环内酯化合物曲霉内酯A的方法，包括以下步骤：
（1）杂色曲霉菌活化：将杂色曲霉菌划线复活，并接种到PDA固体培养基，然后在培养箱中进行活化；
（2）种子液的培养：再用手术刀从步骤（1）中的PDA固体培养基中切下菌落小块，接种到YPD液体培养基中，并在摇床上震荡培养即可得到种子液；
（3）发酵：将步骤（2）中得到的种子液接种到大米固体培养基中，并在恒温恒湿箱中静置培养发酵；
（4）粗提：将步骤（3）中得到的大米发酵物加入乙酸乙酯，冷浸提取后，合并提取液减压浓缩至无乙酸乙酯味得到粗浸膏；
（5）分离纯化：将步骤（4）中所述粗浸膏利用硅胶柱色谱除杂后，再用大孔树脂柱色谱洗脱后，再将目标亚组分利用高效液相色谱进行分离纯化。
优选的，步骤（1）中所述培养箱的培养温度为28℃，培养时间为7天。
优选的，步骤（2）中所述摇床的培养温度为28℃，摇床的转速为160rpm，培养时间为5天。
优选的，步骤（3）中所述大米固体培养基的配制方法为：60~120g大米、80~160 mL水，浸泡过夜后100~120℃高压灭菌10~50min，所述恒温恒湿箱中静置培养发酵温度为28℃，培养时间为30天。
优选的，步骤（5）中所述大孔树脂柱色谱洗脱梯度为10%~100%甲醇-水。
优选的，步骤（5）中所述目标亚组分为50%~90%甲醇-水段。
优选的，步骤（5）中所述高效液相色谱洗脱液为甲醇与水体积比为45%~75%的甲醇-水，检测波长为230 nm。
（三）
与现有技术相比，本发明提供了一种大环内酯化合物曲霉内酯A，具备以下有益效果：
本发明提出了一种新结构的6,7位双键且5,9位为双羟基取代的大环内酯化合物曲霉内酯A，后续的研究中发现曲霉内酯A能显著抑制4株人体致病细菌生长，MIC为6.4～12.6μg/mL，且对2株农业致病细菌抑菌效果显著，对魔芋软腐菌的MIC为9.8μg/mL，对猕猴桃细菌性溃疡病菌的MIC为4.0μg/mL，曲霉内酯A能显著抑制污染猪肉金葡菌和枯草菌的生长，延长食品的储存时间。曲霉内酯A可在制备抗菌药物及抗菌农药前体中应用，为下一步的药效研究奠定了物质基础。
附图说明
图1为本发明曲霉内酯A化合物的结构式；
图2为本发明曲霉内酯A的关键HMBC和1H-1H COSY信号；
图3为本发明曲霉内酯A的质谱图；
图4为本发明曲霉内酯A的1H-NMR图；
图5为本发明曲霉内酯A的13C-NMR图；
图6为本发明曲霉内酯A的1H-1HCOSY图；
图7为本发明曲霉内酯A的HSQC图；
图8为本发明曲霉内酯A的HMBC图；
图9为本发明曲霉内酯A对魔芋软腐菌和猕猴桃软腐菌的抑菌效果图；
图10为实施例二中化合物的1H和13C核磁数据表格
图11为实施例三中曲霉内酯A的对4株致病菌的MIC表格
图12为实施例四中曲霉内酯A的对4株致病菌的MIC表格。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例一：菌种的发酵和提取
杂色曲霉(Aspergillus versicolor)，购买于美国标准菌株保藏中心（ATCC），保藏号为ATCC28286。将该菌种划线复活，接种到PDA固体培养基，28℃培养箱中活化7天。用手术刀从PDA培养基中切下菌落小块，接种到YPD液体培养基中，于28℃和160rpm的摇床上震荡培养5天得到种子液。然后将种子液接种到大米固体培养基中，在28℃恒温恒湿箱中静置培养30天。取大米发酵物，每200g发酵物加乙酸乙酯400mL，冷浸提取2次，合并提取液减压浓缩至无乙酸乙酯味得到乙酸乙酯浸膏。
实施例二：曲霉内酯A的分离和鉴定
将浸膏上硅胶柱色谱分段，分别用石油醚-乙酸乙酯洗脱(40:1～1:4)，合并后分为7段(A-G)。将D-F段合并上MCI柱，吸附过夜，以10%、30%、50%、70%、90%、100%甲醇-水梯度洗脱，每个梯度合并旋干至无液体，得到6个亚组分。将第5亚组分（70%部分）用半制备高效液相色谱进行分离纯化，流动相：60%MeOH，流速4.0mL/min，检测波长230nm，出峰时间27.5～28.3min。将该峰接出，旋蒸至全干，得到白色固体8.3mg。将该白色固体进行质谱和一维二维核磁分析结果如说明书附图2-8所示，确定该化合物结构如说明书附图1所示。质谱正离子模式[M+H]+m/z393.24、[M+NH4]+m/z410.25，负离子模式[M+Cl]-m/z427.70，由此可知化合物的分子量为392，结合氢谱碳谱可知化合物分子式为C24H40O4。其1H和13C核磁数据如说明书附图10中表格所示。由1H和13C核磁数据可知化合物存在1个羰基（C-1），3个烯键（C-2和C-3、C-6和C-7、C-18和C-19），3个连氧碳（C-5、C-9、C-23）。结合1H-1HCOSY、HSQC和HMBC等二维核磁数据对信号进行归属，由关键HMBC信号H-3到C-1和C-5、H-5到C-6和C-7、H-7到C-8和C-9、H-9到C-8和C-10、H-18到C-16和C-17、H-19到C-20和C-21、H-23到C-21、H-22到C-20、H-24到C-22和C-23确定大环内酯的长链结构片段。由H-23到C-1的关键HMBC信号确定24元内酯环的形成。常见的24元大环内酯为4,5位双键且7位为羟基取代，本发明提出的曲霉内酯A为6,7位双键且5,9位为双羟基取代。
实施例三：对人体致病菌的抑制实验1
抗菌实验所用农业致病细菌为金葡菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ATCC 6633）、大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 25922）和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853)。所用细菌在牛肉膏蛋白胨培养基平板上37°C活化24h，挑取菌落加入MH培养液（Mueller-HintonBroth）中，震荡培养6h，稀释菌液至1.0×104～1.0×106CFU/mL备用。曲霉内酯A用DMSO溶解，用MH培养液稀释成200.0、100.0、50.0、25.0、12.5μg/mL的待测溶液。空白组加入200μLMH培养液，阳性组加入100μL阳性药溶液和100μL菌悬液，测试组加入100μL待测样品溶液和100μL菌悬液，生长组加入100μLMH培养液和100μL菌悬液。37°C条件下培养24h后，用酶标仪测定530nm下的OD值，每一组设置3个平行。MIC（最小抑菌浓度）值为菌液OD值下降一半的药物浓度，利用GraphPadPrism5软件统计分析并计算MIC值和±SD（标准差）值。结果显示，曲霉内酯A对4株人体致病细菌抑菌效果显著，MIC为6.4～12.6μg/mL。具体如说明书附图11中表格所示。
实施例四：对人体致病菌的抑制实验2
抗菌实验所用农业致病细菌为金葡菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ATCC 6633）、大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 25922）和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853)。所用细菌在牛肉膏蛋白胨培养基平板上37°C活化24h，挑取菌落加入MH培养液（Mueller-HintonBroth）中，震荡培养6h，稀释菌液至1.0×104～1.0×106CFU/mL备用。曲霉内酯A用DMSO溶解，用MH培养液稀释成160、80.0、40.0、20.0、10.0μg/mL的待测溶液。空白组加入160μLMH培养液，阳性组加入80μL阳性药溶液和80μL菌悬液，测试组加入80μL待测样品溶液和80μL菌悬液，生长组加入80μLMH培养液和80μL菌悬液。37°C条件下培养24h后，用酶标仪测定530nm下的OD值，每一组设置3个平行。MIC（最小抑菌浓度）值为菌液OD值下降一半的药物浓度，利用GraphPadPrism5软件统计分析并计算MIC值和±SD（标准差）值。结果显示，曲霉内酯A对4株人体致病细菌抑菌效果显著，MIC为5.1～11μg/mL。具体如说明书附图12中表格所示。
实施例五：对农业致病细菌的抑菌作用
抗菌实验所用农业作物致病细菌为魔芋软腐菌（Erwinia carotovora var.carotovora）和猕猴桃细菌性溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）。所用菌种在牛肉膏蛋白胨培养基平板上37°C活化24h，挑取菌落加入MH培养液中，震荡培养6h，稀释菌液至1.0×104～1.0×106CFU/mL备用。曲霉内酯A用DMSO溶解，用MH培养液稀释成200.0、100.0、50.0、25.0、12.5μg/mL的待测溶液。空白组加入200μLMH培养液，阳性组加入100μL阳性药溶液和100μL菌悬液，测试组加入100μL不同浓度曲霉内酯A溶液和100μL菌悬液，生长组加入100μLMH培养液和100μL菌悬液。37°C条件下培养24h后，用酶标仪测定530nm下的OD值，每一组设置3个平行。结果表明（如说明书附图9），12.5μg/mL的曲霉内酯A对魔芋软腐菌的抑制率达48.9%，6.25μg/mL的曲霉内酯A对魔芋软腐菌的抑制率为37.5%，由此计算出曲霉内酯A对魔芋软腐菌的MIC为9.8μg/mL。12.5μg/mL的曲霉内酯A对猕猴桃细菌性溃疡病菌的抑制率达74.4%，6.25μg/mL的曲霉内酯A对猕猴桃细菌性溃疡病菌的抑制率为34.88%，由此计算出曲霉内酯A对猕猴桃细菌性溃疡病菌的MIC为4.0μg/mL。曲霉内酯A对2株农业致病细菌抑菌效果显著。
实施例六：对食品的抑菌保鲜作用1
瘦肉样品（猪肉）购买自本地生鲜超市，并在购买后30分钟内立即运送到实验室。将肉类样品制备成1.5g/块的小块，于121ºC下灭菌15分钟，灭菌后，质量损失约为0.5g，产生1g/块的熟肉样品，冷却待用。将熟肉样品分别浸入1×MIC、2×MIC和无菌水组中（作为对照组），10s后，将样品置于无菌培养皿中30分钟，直到溶液完全被吸收到熟肉样品中。用于进行后续的试验。将肉块置于稀释至1.0×103～1.0×104CFU/mL的金黄色葡萄球菌标准株(Staphylococcus aureus ATCC 25923)和枯草芽孢杆菌标准株(Bacillus subtilis ATCC6633)菌液中。将接种细菌的熟肉样品在4ºC冰箱中进行储存，在第0、3、6和9天测定熟肉样品中菌落总数。从4ºC冰箱中储存的熟肉样品取出，在无菌操作台中按照1g : 9mL的比例将熟肉样品与无菌生理盐水进行充分混合。将菌种混合物用无菌生理盐水进行10倍系列梯度稀释，用移液器分别从适宜梯度的试管中吸取100μL的混合液均匀的涂布于NB固体培养基表面，倒置培养于37ºC恒温培养箱中，过夜培养后进行菌落计数，每组设置三个平行。在对污染猪肉金葡菌的抑菌实验中，1×MIC和2× MIC的曲霉内酯A都表现出明显的抑菌活性，在存放初期的3天内，1×MIC浓度就足以抑制金葡菌生长，存放后期，2×MIC浓度效果更明显，使猪肉的保鲜时间延长1倍多。在对污染猪肉枯草菌的抑菌实验中，1×MIC和2×MIC的曲霉内酯A也表现出明显的抑菌活性，2×MIC浓度效果更明显。
实施例七：对食品的抑菌保鲜作用2
瘦肉样品（猪肉）购买自本地生鲜超市，并在购买后30分钟内立即运送到实验室。将肉类样品制备成1.5g/块的小块，于121ºC下灭菌15分钟，灭菌后，质量损失约为0.5g，产生1g/块的熟肉样品，冷却待用。将熟肉样品分别浸入0.5×MIC、3×MIC和无菌水组中（作为对照组），10s后，将样品置于无菌培养皿中30分钟，直到溶液完全被吸收到熟肉样品中。用于进行后续的试验。将肉块置于稀释至0.5×103～0.5×104CFU/mL的金黄色葡萄球菌标准株(Staphylococcus aureus ATCC 25923)和枯草芽孢杆菌标准株(Bacillus subtilisATCC 6633)菌液中。将接种细菌的熟肉样品在4ºC冰箱中进行储存，在第0、3、6和9天测定熟肉样品中菌落总数。从4ºC冰箱中储存的熟肉样品取出，在无菌操作台中按照1g : 12mL的比例将熟肉样品与无菌生理盐水进行充分混合。将菌种混合物用无菌生理盐水进行10倍系列梯度稀释，用移液器分别从适宜梯度的试管中吸取100μL的混合液均匀的涂布于NB固体培养基表面，倒置培养于37ºC恒温培养箱中，过夜培养后进行菌落计数，每组设置三个平行。在对污染猪肉金葡菌的抑菌实验中，0.5×MIC和3× MIC的曲霉内酯A都表现出明显的抑菌活性，在存放初期的3天内，0.5×MIC浓度可以在一定程度上抑制金葡菌生长，存放后期，3×MIC浓度效果非常明显，使猪肉的保鲜时间延长接近1.5倍多。在对污染猪肉枯草菌的抑菌实验中，0.5×MIC和3×MIC的曲霉内酯A也表现出一定的抑菌活性，其中3×MIC浓度效果非常明显。
综上所述，本发明提出了一种新结构的6,7位双键且5,9位为双羟基取代的大环内酯衍生物曲霉内酯A，后续的研究中发现曲霉内酯A能显著抑制4株人体致病细菌生长，MIC为6.4～12.6μg/mL，且对2株农业致病细菌抑菌效果显著，对魔芋软腐菌的MIC为9.8μg/mL，对猕猴桃细菌性溃疡病菌的MIC为4.0μg/mL，曲霉内酯A能显著抑制污染猪肉金葡菌和枯草菌的生长，延长食品的储存时间。此类化合物可在制备抗菌药物及抗菌农药前体中应用，为下一步的抗菌药效研究奠定了物质基础。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种大环内酯化合物曲霉内酯A，其特征在于：所述化合物的结构式如下：
。
2.根据权利要求1所述的大环内酯化合物曲霉内酯A在制备抗菌药物和抗菌农药中的应用。
3.制备权利要求1所述大环内酯化合物曲霉内酯A的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）杂色曲霉菌活化：将杂色曲霉菌划线复活，并接种到PDA固体培养基，然后在培养箱中进行活化；
（2）种子液的培养：再用手术刀从步骤（1）中的PDA固体培养基中切下菌落小块，接种到YPD液体培养基中，并在摇床上震荡培养即可得到种子液；
（3）发酵：将步骤（2）中得到的种子液接种到大米固体培养基中，并在恒温恒湿箱中静置培养发酵；
（4）粗提：将步骤（3）中得到的大米发酵物加入乙酸乙酯，冷浸提取后，合并提取液减压浓缩至无乙酸乙酯味得到粗浸膏；
（5）分离纯化：将步骤（4）中所述粗浸膏利用硅胶柱色谱除杂后，再用大孔树脂柱色谱洗脱后，再将目标亚组分利用高效液相色谱进行分离纯化。
4.根据权利要求3所述的制备权利要求1所述大环内酯化合物曲霉内酯A的方法，其特征在于：步骤（1）中所述培养箱的培养温度为28℃，培养时间为7天。
5.根据权利要求3所述的制备权利要求1所述大环内酯化合物曲霉内酯A的方法，其特征在于：步骤（2）中所述摇床的培养温度为28℃，摇床的转速为160rpm，培养时间为5天。
6.根据权利要求3所述的制备权利要求1所述大环内酯化合物曲霉内酯A的方法，其特征在于：步骤（3）中所述大米固体培养基的配制方法为：60~120g大米、80~160 mL水，浸泡过夜后100~120℃高压灭菌10~50min，所述恒温恒湿箱中静置培养发酵温度为28℃，培养时间为30天。
7.根据权利要求3所述的制备权利要求1所述大环内酯化合物曲霉内酯A的方法，其特征在于：步骤（5）中所述大孔树脂柱色谱洗脱梯度为10%~100%甲醇-水。
8.根据权利要求3所述的制备权利要求1所述大环内酯化合物曲霉内酯A的方法，其特征在于：步骤（5）中所述目标亚组分为50%~90%甲醇-水段。
9. 根据权利要求3所述的制备权利要求1所述大环内酯化合物曲霉内酯A的方法，其特征在于：步骤（5）中所述高效液相色谱洗脱液为甲醇与水体积比为45%~75%的甲醇-水，检测波长为230 nm。
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