CN111548954B - 四种蒽醌类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

四种蒽醌类化合物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及从黑翅土白蚁共生链霉菌(Streptomyces tanashiensis BYF112)液体发酵物中提取的四种新蒽醌类化合物及其制备方法和应用。具体而言，本发明公开了四种新蒽醌类化合物，其结构式为：

Description

四种蒽醌类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及黑翅土白蚁共生菌株及其四种新活性代谢产物的制备和抗菌，抗癌应用。
背景技术
昆虫共生放线菌是一类重要的微生物，能产生具有生物活性的代谢产物，如抗生素、免疫抑制剂、抗氧化剂和抗肿瘤化合物等，具有重要的药物开发价值。链霉菌许多次级代谢产物在抗肿瘤、抗菌、杀虫等领域广泛应用，具有良好的研究前景。由于天然活性药物具有低毒、高效的特点，得到许多人的信赖，而化疗作为肿瘤治疗的重要手段，副作用较大，可导致人体免疫功能下降、消化障碍、骨髓抑制等，所以人们希望从自然界分离纯化更多抗肿瘤活性产物，近几年，天然活性药物的筛选成为一个热点，从微生物中分离抗肿瘤活性产物，开发更多抗肿瘤药物，是一种必然趋势。同时细菌耐药性这一问题日益突显，通过发现新的抗生素药物是解决这一问题重要途径之一。而昆虫共生放线菌菌是一类研究较少的特殊环境微生物。相对于陆生土壤来源微生物，它具有广泛的来源和丰富的多样性，同时共生菌在与寄主的长期共同进化过程中形成了独特的生理特性和代谢途径，是新活性代谢物的理想来源。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种黑翅土白蚁共生链霉菌(Streptomycestanashiensis BYF112)菌株及其代谢产物和用途。
为解决上述技术问题，本发明提供链霉菌BYF112(Streptomyces tanashiensisBYF112)，其保藏号为：CCTCC M 2019474BYF-112，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2019年6月20号。
本发明还同时提供链霉菌BYF112发酵液的制备方法，包括以下步骤：
1)活化好的链霉菌(Streptomyces tanashiensis BYF112)接入高氏一号液体培养基中，于27.5-28.5℃(较佳为28℃)、160-180rmp/min(较佳为170rmp/min)的条件下培养2-3d (较佳为3d)作为种子液。备注说明：活化为经高氏一号固体培养基的活化；即，具体为：从保藏菌种的高氏试管斜面中取孢子接种于新鲜的高氏一号固体培养基上，然后28℃恒温箱中倒置培养，得到活化好的链霉菌。一般而言，将活化好的链霉菌的菌体块(约2～3g) 接种到装有100mL高氏一号液体培养基中于上述条件下进行培养；就能得到种子液；
2)、将种子液按照1％～2％体积比的接种量接入高氏一号液体培养基中，于27.5～28.5℃ (较佳为28℃)、160～180rpm/min(较佳为170rpm/min)的条件下培养6～8d(较佳为7d)，得链霉菌发酵液。
本发明还同时提供了利用上述链霉菌BYF112发酵液制备链霉菌BYF112代谢产物的方法，包括以下步骤：
1)、将链霉菌BYF112发酵液利用纱布(例如为4层纱布)进行过滤，得滤液；将滤液经乙酸乙酯萃取后，真空减压浓缩干燥(于0.1个负压的真空度，45℃)，得链霉菌BYF112 发酵液粗提物(为暗红色)；
2)、将链霉菌BYF112发酵液粗提物用硅胶柱层析进行粗分，采用二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比依次为：100:0,100:1,100:2,100:4,100:8,100:16, 100:32；进而相应得到7个馏分：F1～F7；
3)、将F2和F3分别进行如下操作：浓缩后通过凝胶柱和甲醇重结晶方法；总共得到4个链霉菌BYF112代谢产物。
备注说明：F2对应得到的是化合物3和化合物4，F3对应得到的是化合物1和化合物2。
本发明还同时提供了利用上述方法制备而得的4种链霉菌BYF112代谢产物，分别具有如下结构式：
Figure GDA0003663100960000021
本发明还同时提供了上述链霉菌BYF112的用途：用于抑制金黄色葡萄球菌和四链球菌生长，对人体黑色素肿瘤细胞和人体胃癌细胞的生长有抑制作用。
在本发明中，链霉菌BYF112代谢产物的抗菌用法和用量可参照青霉素钠和硫酸庆大霉素的用法和用量。抗癌用法和用量可参考广谱药物阿霉素。
即，本发明的第一个目的是提供一种黑翅土白蚁共生链霉菌BYF112(Streptomyces tan ashiensis BYF112)菌株及其用途；本发明的第二个目的是提供上述的黑翅土白蚁共生链霉菌BYF112(Streptomyces tanashiensis BYF112)菌株的培养物；本发明的第三个目的是提供上述培养物的制备方法；本发明的第四个目的是提供上述培养物的用途；本发明的第五个目的是提供具有抑制金黄色葡萄球菌和四链球菌生长作用的抗菌剂，具有抑制人体黑色素肿瘤细胞和人体胃癌细胞生长作用的抗癌药物。
综上所述，本发明提供了黑翅土白蚁共生链霉菌BYF112(Streptomycestanashiensis BYF11 2)，该菌代谢产物具有抑制金黄色葡萄球菌和四链球菌生长的活性，对人体黑色素肿瘤细胞和人体胃癌细胞也有抑制活性，因此对开发新型抗菌剂和抗癌药物具有重要的价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的四种新蒽醌类化合物的结构式。
图2为本发明实施例提供的化合物termstrin A(1)的1H NMR(DMSO)谱图。
图3为本发明实施例提供的化合物termstrin A(1)的13C NMR(DMSO)谱图。
图4为本发明实施例提供的化合物termstrin B(2)的1H NMR(acetone)谱图。
图5为本发明实施例提供的化合物termstrin B(2)的13C NMR(acetone)谱图。
图6为本发明实施例提供的化合物termstrin C(3)的1H NMR(DMSO)谱图。
图7为本发明实施例提供的化合物termstrin C(3)的13C NMR(DMSO)谱图。
图8为本发明实施例提供的化合物termstrin D(4)的1H NMR(DMSO)谱图。
图9为本发明实施例提供的化合物termstrin D(4)的13C NMR(DMSO)谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明做进一步的解释。
实施例1、黑翅土白蚁共生链霉菌BYF112(Streptomyces tanashiensis BYF112)的分离、纯化与鉴定：
供试黑翅土白蚁采自江苏省江阴市政府绿化带。从新挖掘的白蚁巢中，用无菌镊子取出兵蚁(20头)至于灭菌离心管中，加入1mL PH7.4的无菌PBS缓冲液，震荡得到漂洗液；再用无菌水将其稀释成10-1、10-2、10-3三个浓度梯度。分别取各浓度梯度稀释液0.2mL涂布于高氏一号固体培养基上，于28℃恒温箱中倒置培养。待菌落长出后，从菌落边缘挑取少量孢子，转接到新的高氏培养基上，如此反复转接得到单菌落，并将该单菌落BYF112保存至高氏试管斜面备用。
用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取上述样品的基因组DNA，采用16S rRNA基因序列通用引物按照常规方法进行PCR扩增。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。所得序列经16S rRNA基因同源性分析鉴定该菌株为Streptomyces tanashiensis。
上述高氏一号培养基配方为：KNO3 1g，K2HPO4·3H2O 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,NaCl 0.5g,FeSO4·7H2O 0.01g,可溶性淀粉20g，H2O 1.0L,PH 7.2，并于1.1个大气压，121℃下灭菌20min。将上述链霉菌Streptomyces tanashiensis BYF112转接至高氏一号试管斜面保存备用。对上述链霉菌BYF112进行了菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CC TCC)；保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2019年6月20日；保藏号：CCTCC M2019474 BYF-112。
实施例2、黑翅土白蚁共生链霉菌Streptomyces tanashiensis BYF112的液体发酵：
链霉菌Streptomyces tanashiensis BYF112的活化：从保藏菌种的高氏一号试管斜面中取带菌孢子接种于新鲜的高氏一号固体培养基上，于28℃恒温箱中倒置培养，得到活化好的链霉菌BYF112。将活化好的链霉菌BYF112的菌体块(约2～3g)接种到装有100mL高氏一号液体培养基的250mL三角瓶中，于28℃，170rpm/min的条件下培养3d作为种子液；共接种6～7瓶。然后按照1％体积比的接种量，将5ml的种子液转接入装有400mL高氏一号液体培养基的1000mL三角瓶中，于28℃，180rpm/min的条件下培养7d；得链霉菌BYF1 12发酵液(简称发酵液)。
实施例3、黑翅土白蚁共生链霉菌Streptomyces tanashiensis BYF112代谢产物的分离纯化：
将按照实施例2所述方法制备而得的40L发酵液经4层纱布过滤，所得滤液用等体积的乙酸乙酯进行萃取，共萃取3次，将萃取液经真空浓缩干燥(于0.1个负压的真空度，45℃)，得到褐色的发酵液粗提物(26.23g)。将所得的发酵液粗提物(26.23g)用硅胶柱层析(200～300 目的硅胶，约26g)进行分，采用二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比依次为：100:0,100:1,100:2,100:4,100:8,100:16,100:32；每种洗脱液的用量分别约为510 0ml、4500ml、3750ml、3000ml、2250ml、1500ml、1500ml，流速为10ml/min。不同的梯度洗脱所得分别进行收集。
将所得的第2种洗脱部分F2进行浓缩(于0.1个负压的真空度，45℃)后于甲醇中进行重结晶和过凝胶柱的方法，能分别得到化合物3(红色粉末，约20mg)和化合物4(红色粉末，约21mg)。对所得的第3种洗脱部分F3进行同样的处理(即，浓缩后于过凝胶柱和甲醇中进行重结晶)，得到化合物1(红褐色粉末，约30mg)和化合物2(红色粉末，约0.2g) 共得到上述4个单一代谢产物。最后结合多种波谱技术对所述4个化合物进行结构鉴定。
上述4个化合物的波谱数据为：
化合物1：红褐色粉末，ESI-MS:m/z calcd.for 354.0740(C19H14O7).1H NMR(600MHz,DMSO)δ7.28(s,1H,H-4),7.32(d,J＝7.9Hz,1H,H-6),7.78(t,j＝7.9Hz,1H,H-7),7.71(d, J＝7.9Hz,1H,H-8),6.02(s,1H,H-1'),2.90(s,2H,H-3'),1.99(s,3H,H-5'),11.83(brs,1H, 3-OH),12.41(br s,1H,5-OH),13.25(brs,1H,1-OH),11.83(br s,1H,4'-OH).13CNMR(150 MHz,DMSO)δ162.6(C-1)118.1(C-2),163.1(C-3),108.4(C-4),132.3(C-4a),161.6(C-5),123.9(C- 6),137.2(C-7),118.7(C-8),133.4(C-8a),185.3(C-9),108.6(C-9a),187.3(C-103),115.7(C-10a),117.6 (C-1'),136.0(C-2'),39.6(C-3'),171.9(C-4'),23.8(C-5') 。
化合物2：红色粉末，ESI-MS:m/z calcd.for 412.0794(C21H16O9).1H NMR(600MHz，Acetone)δ7.38(s,1H,H-4),7.32(d,J＝7.2Hz,1H,H-7),7.80(d,7.2Hz,1H,H-7),7.81(d,J＝7. 2Hz,1H,H-8),6.33(s,1H,H-1'),5.66(s,1H,H-3'),2.01(s,3H,C-5'),2.08(s,3H,C-6').12. 52(br s,1H，5-OH),13.34(br s,1H,1-OH).11.83(br s,1H,3-OH)13C NMR(150MHz, Acetone)δ1639(C-1),118.6(C-2),163.1(C-3),109.0(C-4),134.5(C-4a),163.3(C-5),124.9(C- 6),138.1(C-7),119.9(C-8),134.8(C-8a),187.0(C-9),110.6(C-9a),188.7(C-10),117.0(C-10a), 122.3(C-1'),136.5(C-2'),73.4(C-3'),169.9(C-4'),19.4(C-5'),170.4(C-6'),20.6(C-7') 。
化合物3：红色粉末，ESI-MS:m/z calcd.for 384.0845(C20H16O8).1H NMR(600MHz，DMSO)δ7.13(s,1H,H-4),7.59(s,1H,H-6),7.87(s,1H,H-7),7.86(s,1H,H-8),5.75(s,1 H,H-1'),2.74(d,J＝17.52,1H,H-3'),2.81(d,J＝17.16,1H,H-3'),1.44(s,3H,H-5'),13.49(b r s,1H,1-OH),13.48(br s,1H,5-OH),3.95(s,3H,3-OMe).13C NMR(150MHz,DMSO)δ163.2(C-1),113.4(C-2),160.1(C-3),108.1(C-4),135.5(C-4a),160.1(C-5),119.2(C-6),118.7 (C-7),118.7(C-8),135.0(C-8a),180.2(C-9),107.8(C-9a),189.7(C-10),120.3(C-10a),82.4(C- 1'),75.0(C-2'),44.28(C-3'),175.4(C-4'),28.9(C-5'),56.4(3-OMe) 。
化合物4：红色粉末，ESI-MS:m/z calcd.for 384.0845(C20H16O8).1H NMR(600MHz，DMSO)δ7.28(s,1H,H-3),7.68(d,J＝8.0,1H,H-6),7.94(d,J＝8.0,1H,H-7),7.93(d,J＝8.0, 1H,H-8),5.83(s,1H,H-1'),3.08(d,J＝16.7,1H,H-3'),2.53(d,J＝16.8,1H,H-3'),1.39(s, 3H,C-5'),13.07(br s,1H,4-OH),13.27(br s,1H,1-OH),4.00(s,3H,5-OMe).13CNMR (150MHz,DMSO)δ154.1(C-1),133.8(C-2),128.5(C-3),155.2(C-4),113.3(C-4a),160.8(C-5), 119.9(C-6)，136.3(C-7),119.1(C-8),134.6(C-8a),187.0(C-9),112.2(C-9a),186.2(C-10),109. 5(C-10a),81.3(C-1'),76.1(C-2'),44.6(C-3'),175.2(C-4'),23.6(C-5'),56.6(5-OMe)。
上述4个化合物的结构式为：
Figure GDA0003663100960000041
实施例4、黑翅土白蚁共生链霉菌Streptomyces tanashiensis BYF112的代谢产物对金黄色葡萄球菌和四链球菌的抑制作用：
将金黄色葡萄球菌和四联球菌从保存试管中接到新鲜的LB固体培养基中，倒置于37℃恒温培养箱中24h后，使用接种环将活化好的菌接到LB液体培养基中，12h后用无菌水将菌液稀释成约1×108cfu/mL浓度，取0.1mL稀释后均匀涂布在LB固体培养基上，然后将孔直径为6mm的滤纸片灭菌备用。将4种单体代谢产物和两种阳性对照(青霉素钠和硫酸庆大霉素)分别配比成6mg/mL的浓度，用0.22μm的有机相微孔滤膜过滤后，取5μL 6mg/mL 的4种代谢产物和两种阳性对照加入上述灭菌后的滤纸片中(30μg/滤纸片)，挥干后将含药物滤纸片放入之前涂布好的LB固体培养基中，将培养基放入37℃恒温培养箱中倒置培养。在24h后对金黄色葡萄球菌和在48h后对四链球菌使用十字交叉法测量抑菌圈直径，每组三个重复。
实验结果见表1，结果表明，链霉菌Streptomyces tanashiensis BYF112的代谢产物对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用以化合物1和4的效果最好，抑菌圈平均直径分别为12.85和11.17mm，与阳性对照青霉素钠活性相当，并好于阳性对照硫酸庆大霉素；而化合物2对金黄色葡萄球菌的生长也有一定的抑制作用，抑菌圈平均直径分别为9.13mm，与硫酸庆大霉素相比有着相当的活性，但与青霉素钠相比只有中等活性。同时4种代谢产物中只有化合物 1和2对四链球菌有着一定的抑制活性，与阳性对照相比较弱。
表1.链霉菌Streptomyces tanashiensis BYF112的代谢产物对金黄色葡萄球菌和四链球菌的抑制活性(30μg/滤纸片)。
Figure GDA0003663100960000051
备注说明：抑菌圈直径(mm)：结果用三组重复实验平均值±标准差表示；硫酸庆大霉素和青霉素钠作为阳性对照，(效价：USP级，≥590μ/mg)；NI表示无活性。
实施例5、黑翅土白蚁共生链霉菌Streptomyces tanashiensis BYF112的代谢产物对人黑素瘤细胞系(A375)和人胃癌细胞系(MGC-803)的抑制作用：
用MTT法评估了代谢物1-4对肿瘤细胞人黑素瘤细胞系(A375)，人胃癌细胞(MGC-803) 和人正常细胞L-02的细胞毒活性。上述细胞在含有1％青霉素和链霉素的10％胎牛血清 (FBS)的改良培养基(DMEM)生长，培养条件为：37℃，5％CO2，阿霉素作为阳性对照。将上述细胞接种在96孔板中，使其生长20小时，然后加入浓度为0.16、0.8、4、20、 100μM的化合物，48小时后将MTT(20μL，5mg/mL)添加到每个孔中，在37℃下孵育 4小时后，向每个孔中添加150μL二甲基亚砜(DMSO)，然后摇动平板15分钟。最后，IC50值由490nm处的吸光度确定。
实验结果见表2，结果表明，化合物1对肿瘤细胞系A375和MGC-803表现出中等的细胞毒活性，IC50值为22.76和36.65μM，低于主要的蒽醌类药物阿霉素的IC50值，但对正常细胞L-02没有毒性。
表2.链霉菌Streptomyces tanashiensis BYF112的代谢产物对人黑素瘤细胞系(A375)、人胃癌细胞系(MGC-803)和人正常细胞L-02的体外细胞毒性(IC50，μM)。
Figure GDA0003663100960000052
备注说明：IC50值：结果用三组重复实验平均值±标准差表示；“-”表示没有活性。
综合实施例4、实施例5的实验结果表明，黑翅土白蚁共生链霉菌Streptomycestanashiensis BYF112代谢产物具有很好的抗菌和抗癌活性，因此对开发新型抗生素和新型抗癌药物具有重要的价值和潜力。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.链霉菌(Streptomyces tanashiensis)BYF112，该菌种于2019年6月20日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC M 2019474。
2.四种蒽醌类化合物的制备方法，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
1)、将权利要求1所述的链霉菌BYF112接种到高氏一号培养基中，26-28℃，160-180rpm培养2-3天，得种子液；
2)、将种子液接种在高氏一号培养基中，160-180rmp，27.5-28.5℃发酵，6.5-7.5天；即得发酵液；
3)、将步骤2)所得发酵液过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥，得粗浸膏；
4)、将步骤3)所得粗浸膏进行硅胶柱层析分段，采用二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比依次为100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32；从而分别得到7个洗脱部分F1～F7；
5)、将所得的第2种洗脱部分F2进行浓缩后于甲醇中进行重结晶和凝胶柱层析，分别得到化合物3和化合物4；对所得的第3种洗脱部分F3进行同样的处理，得到化合物1和化合物2；所述浓缩的 条件为：0.1个负压的真空度，45℃；所述化合物1为红褐色粉末；所述化合物2为红色粉末；化合物1-4分别具有如下结构式：
Figure FDA0003683404720000011
3.根据权利要求2所述的四种蒽醌类化合物的制备方法，其特征在于，发酵培养基的成分 为/L：KNO3 1g，K2HPO4·3H2O 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,NaCl 0.5g,FeSO4·7H2O 0.01g,可溶性淀粉20g，H2O 1.0L,pH7.2。
4.如权利要求2所述的四种蒽醌类化合物在制备抑菌药物中的用途，其特征是：其中化合物1和化合物2抑制金黄色葡萄球菌、四链球菌的生长；化合物4抑制金黄色葡萄球菌的生长。
5.如权利要求2所述的化合物1在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的用途，其特征是：化合物1抑制人体黑色素肿瘤细胞和人体胃癌细胞的生长。
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