CN102965300B

CN102965300B - 一种小单孢菌菌株、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN102965300B
Application number: CN201210347856.7A
Authority: CN
Inventors: 彭飞; 连云阳; 王传喜; 谢阳; 林如; 江宏磊; 江红
Original assignee: Fujian Institute of Microbiology
Current assignee: Fujian Institute of Microbiology
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2012-09-19
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2032-09-19
Also published as: CN102965300A

Abstract

本发明提供了一种小单孢菌菌株、制备方法及其应用，本发明从海洋沉积物中分离并筛选到一株抗肿瘤活性很好的放线菌，该放线菌为小单孢菌菌株FIM07-0019(Mciromonospora sp.FIM07-0019)，并利用该小单孢菌菌株FIM07-0019制备出发酵液，再将所述发酵液经提取、正相硅胶柱层析、C18反相柱层析等处理，提取分离得到对肿瘤细胞具有细胞毒活性的大环内酯类化合物，该大环内酯类化合物为研究开发新的抗肿瘤药物提供了天然药物化学研究基础和先导化合物，对开发利用中国的海洋药物资源具有重要价值。

Description

一种小单孢菌菌株、制备方法及其应用

【技术领域】

本发明涉及一种小单孢菌菌株，该小单孢菌菌株的制备方法，及该小单孢菌菌株的应用。

【背景技术】

小单孢菌属（Micromonospora）属于放线菌目小单孢菌科（Micromonosporaceae），因菌丝上着生单个孢子而得名，该属菌为革兰氏阳性菌,不抗酸,好氧或微好气,化能异养菌,基内菌丝发达,分枝有隔。在基内菌丝上长单个孢子,有梗或无梗,孢子不游动。小单孢菌是抗生素的重要来源。临床上应用的许多氨基糖抗生素如庆大霉素等都是小单孢菌产生的。目前从该属发现的抗生素种类仅次于链霉菌，达450种以上。1987年从Caliche土壤样品中分离的棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora subsp.calichensis产生结构新颖的烯二炔类抗肿瘤抗生素Calicheamicin γ₁。该化合物细胞毒性高，至少是多柔比星的1000倍。该药物的第一个抗体靶向化疗药物CMA-676（Mylotarg）^TM以在临床应用，它可治疗严重、快速发展的致命性疾病急性骨髓性白血病（acute myeloid leukaemia）。从斐济海鞘(Polysyncraton lithostrotum)中分离到小单孢菌Micromonospora lomaiviticins,它产生抗肿瘤和细胞毒的抗生素Lomaiviticins即Lomaiviticins A和B（重氮苯并芴葡萄糖苷对称二聚体）。Lomaiviticins是很强的破坏DNA的药物，BIA<0.1ng/spot。Lomaiviticins A对许多肿瘤细胞株作用强，IC50为0.01-98ng/ml,细胞毒作用方式与已知DNA损害剂多柔比星、丝裂霉素不同。它还具有很强的抗金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的作用，MIC为6-25ng/spot,已进入I期临床实验。综上所述，在小单孢菌中已发现了一些具有重要商业价值的次级代谢产物，它们是新生素和其他生物活性物质的重要微生物来源。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种小单孢菌菌株。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题之一的：一种小单孢菌菌株，所述菌株为小单孢菌菌株FIM07-0019（Mciromonospora sp.FIM07-0019），于2012年8月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6474。

本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，通过提取分离该新菌株的发酵液获得了一种能够抑制肿瘤的大环内脂类化合物。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题之二的：一种所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，包括以下步骤：

（1）制备小单孢菌菌株FIM07-0019发酵液：将一铂环小单孢菌菌株FIM07-0019的燕麦琼脂斜面培养物接入种子培养基，于温度35℃，转速220rpm/min下培养48h；然后按10%的移种量转入发酵培养基，并于温度28℃，转速220rpm/min下振荡培养96～120h；

（2）提取：将（1）中获得的小单孢菌菌株FIM07-0019发酵液于4500rpm离心15min以获得上清液和菌丝体；所述菌丝体用2倍于菌丝体体积的甲醇浸泡，经减压浓缩后再用水稀释；将稀释液与上清液合并后一起流经大孔吸附树脂Hp-20，再用甲醇洗出并浓缩，最后浓缩物用等体积的乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩，得浸膏状提取物；

（3）分离:将（2）中获得的提取物采用正相硅胶柱层析，用体积比100：0，98：2，95：5，90：10，80：20，70：30，50：50，0：100的氯仿-甲醇溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，并收集Rf值为0.6的馏份；再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，用体积比1:1的甲醇-氯仿洗脱，薄层层析检测，并收集Rf值为0.6的馏份；再经C₁₈反相柱层析，以甲醇-水梯度洗脱，流速为1ml/min，且所述甲醇-水梯度为：甲醇含量在30min内从0到100%；薄层层析检测，并收集Rf值为0.6的馏份；再将馏份经制备型高压液相色谱进行分离，以60%乙腈溶液洗脱，流速为1.5ml/min，得到大环内脂类化合物。

进一步地，所述薄层层析的展层剂为体积比9:1氯仿-甲醇溶剂。

进一步地，所述种子培养基的组分为：可溶性淀粉1.5%，葡萄糖0.5%，蛋白胨0.5%，酵母粉0.5%，MgSO₄·7H₂O0.05%，NaCl0.05%，（NH₄）₂SO₄0.05%，K₂HPO₄0.05%，CaCO₃0.1%，蒸馏水配制，pH为7.5；且所述种子培养基中各组分的百分数均为质量分数。

进一步地，所述发酵培养基的组分为：可溶性淀粉4%，葡萄糖0.5%，蛋白胨0.5%，花生饼粉2.0%，MgSO₄·7H₂O0.05%，K₂HPO₄0.05%，CaCO₃0.1%，蒸馏水配制，pH为7.5，且所述发酵培养基中各组分的百分数均为质量分数。

本发明所要解决的技术问题之三在于提供一种所述的小单孢菌菌株制备的大环内脂类化合物，其具有很强的抗肿瘤活性。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题之三的：一种所述的小单孢菌菌株制备的大环内脂类化合物，结构式如下：

本发明的有益效果在于：提供了一种新的小单孢菌菌株，并且提供了从该菌株发酵液中提取分离得到的大环内脂类化合物的方法，该大环内脂类化合物对肿瘤细胞具有细胞毒活性，为研究开发新的抗肿瘤药物提供天然药物化学研究基础和先导化合物，对开发利用中国的海洋药物资源具有重要价值。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

图1是本发明中小单孢菌菌株FIM07-0019在高氏-天冬素琼脂上28℃培养15天的形态示意图。

图2是本发明中小单孢菌菌株FIM07-0019基于16S rRNA基因序列的系统发育树的示意图。

图3是本发明中大环内脂类化合物的氢核磁共振图谱。

图4是本发明中大环内脂类化合物的碳核磁共振图谱。

图5是本发明中大环内脂类化合物的异核多键相关图谱。

图6是本发明中大环内脂类化合物的氢氢化学位移相关二维图谱。

图7是本发明中大环内脂类化合物的异核单量子相关图谱。

图8是本发明中大环内脂类化合物的135度无畸变级化转移增益图谱。

菌株保藏

本发明中的小单孢菌菌株FIM07-0019（Mciromonospora sp.FIM07-0019），于2012年8月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6474。

【具体实施方式】

一种小单孢菌菌株，所述菌株为小单孢菌菌株FIM07-0019（Mciromonospora sp.FIM07-0019），于2012年8月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6474。

所述小单孢菌菌株FIM07-0019的分离方法，包括以下步骤：

步骤100：将2克采集于智利南部43°32′0′S，72°52′0′W，水深20米的海底海泥用无菌陈海水稀释成10^-1和10^-2倍；

步骤200：分别取原液及稀释过的样品悬液0.1mL涂布于燕麦琼脂培养基进行菌种分离，并于30℃下培养2周，得到小单孢菌菌株FIM07-0019。

所述燕麦琼脂培养基组分为：燕麦粉2%、琼脂2%、重铬酸钾50mg/L、微量元素溶液0.1ml/100ml，其余成分为水，且所述水包括质量比为1：1的蒸馏水和海水；所述微量元素溶液包括如下组分：FeSO₄·7H₂O0.1_g，MnCl₂·4H₂O0.1g，ZnSO₄·7H₂O0.1g，蒸馏水1000ml。

所述小单孢菌菌株FIM07-0019的鉴定:

（1）小单孢菌菌株FIM07-0019在高氏-天冬素琼脂斜面培养基上28℃培养10天后，得到菌株的主要形态及生物学特征：菌落呈圆形，直径1-3cm，菌落稍隆起，表面光滑，面上覆盖一层黑色的孢子层。基丝分枝，不断裂，基丝及分枝的顶端上着生单个的孢子，孢子堆积成簇似葡萄串，孢子椭圆形，外壁光滑（见图1）；所述高氏-天冬素琼脂斜面培养基的组分为：可溶性淀粉2%，L-天冬素0.05%，KNO₃0.1%，K₂HPO₄·3H₂O0.05%，NaCl0.05%，MgSO₄·7H₂O0.05%，CaCO₃0.1%，琼脂1.8%，pH7.5。

小单孢菌菌株FIM07-0019的培养特征见表1，基丝橙黄色，孢子层黑色，在ISP2、ISP3上产生或深或浅的棕褐色的可溶性色素，不产生气生菌丝。硝酸盐还原阴性，凝固并胨化牛奶，不液化明胶，水解淀粉，能利用纤维素，不产生黑色素和H₂S，在含5%NaCl的燕麦琼脂上会生长，能很好的利用淀粉、蔗糖、葡萄糖、木糖、麦芽糖、甘露糖、纤维二塘、海藻糖、乳糖、半乳糖、蜜二糖、棉子糖、水杨素，不利用鼠李糖、L-山梨糖、甲壳素、菊糖、甘油、肌醇、赤藓醇、卫茅醇、山梨醇、乙酸钠、阿东糖醇、琥珀酸钠。

表1菌株FIM07-0019的培养特征

注：色谱采用“美国ISCC-NBS标准色彩（267种非发光体色)”

（2）小单孢菌菌株FIM07-0019基因组DNA采用酶解法提取，得到的DNA样品储存于-20℃，将该DNA样品作为DNA模板进行16S rRNA基因PCR扩增：

上游引物27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（如SEQID NO2所示）;

下游引物1492r：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'（如SEQID NO3所示）。

反应体系为：

16S rDNA PCR扩增程序为：

PCR产物送北京三博公司测序；测序结果如SEQID NO1所示。

将所测得的16S rDNA序列与GenBank数据库中已有序列进行比对，及进行同源性分析;在LPSN（http://www.bacterio.cict.fr）网站上选取相应的模式株16S rRNA基因序列，系统进化分析用CLUSTAL-X软件进行比对，生成的比对文件用TREECONW软件邻接法进行系统进化分析，拓扑分析为1000次重复取样的结果；结果发现菌株FIM07-0019与稀有放线菌小单孢菌属（Micromonospora）发表生效的模式菌株Micromonospora coxensisMTCC8093^T(GenBank accession Number:AB241455)的同源性最高，相似性达99.0%，可知，菌株FIM07-0019为小单孢菌属（Micromonospora）的一个新菌株，其系统发育树见图2。

一种利用所述小单孢菌菌株FIM07-0019制备大环内脂类化合物的方法，包括以下步骤：

（1）制备小单孢菌菌株FIM07-0019发酵液：将一铂环小单孢菌菌株FIM07-0019的燕麦琼脂斜面培养物接入种子培养基，于温度35℃，转速220rpm/min下培养48h；然后按10%的移种量转入发酵培养基，并于温度28℃，转速220rpm/min下振荡培养96～120h；所述种子培养基的组分为：可溶性淀粉1.5%，葡萄糖0.5%，蛋白胨0.5%，酵母粉0.5%，MgSO₄·7H₂O0.05%，NaCl0.05%，（NH₄）₂SO₄0.05%，K₂HPO₄0.05%，CaCO₃0.1%，蒸馏水配制，pH为7.5；且所述种子培养基中各组分的百分数均为质量分数。所述发酵培养基的组分为：可溶性淀粉4%，葡萄糖0.5%，蛋白胨0.5%，花生饼粉2.0%，MgSO₄·7H₂O0.05%，K₂HPO₄0.05%，CaCO₃0.1%，蒸馏水配制，pH为7.5，且所述发酵培养基中各组分的百分数均为质量分数。

（3）分离:将（2）中获得的提取物采用正相硅胶柱层析，用体积比100：0，98：2，95：5，90：10，80：20，70：30，50：50，0：100的氯仿-甲醇溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，并收集Rf值为0.6的馏份；再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，用体积比1:1的甲醇-氯仿洗脱，薄层层析检测，并收集Rf值为0.6的馏份；再经C₁₈反相柱层析，以甲醇-水梯度洗脱，流速为1ml/min，且所述甲醇-水梯度为：甲醇含量在30min内从0到100%；薄层层析检测，并收集Rf值为0.6的馏份；再将馏份经制备型高压液相色谱进行分离，以60%乙腈溶液洗脱，流速为1.5ml/min，得到大环内脂类化合物。其中，所述薄层层析的展层剂为体积比9:1氯仿-甲醇溶剂。

所述大环内脂类化合物为白色无定形粉末，其分子式为C₃₀H₅₂O₇，溶于甲醇，丙酮，乙腈，乙酸乙酯和二甲亚砜等有机溶剂，不溶于水。所述大环内脂类化合物的HR-ESI-MS谱结果如下：

测量值:m/z=547.3586[M+Na]⁺

理论值:m/z=547.3605[M+Na]⁺。

所述大环内脂类化合物的¹H核磁共振波谱（DMSO-d₆,400MHz）数据如下所示：

δ(ppm):δ7.06(1H,dd,J=12.0,16.0H_Z),6.30(1H,dd,J=12.0,16.0H_Z),6.10(1H,m,J=4.0,8.0,16.0H_Z),5.77(1H,d,J=16.0H_Z),4.75(1H,d,J=8.0H_Z),4.73(1H,d,J=8.0H_Z),3.96(1H,m),3.83(1H,dd,J=8.0,4.0HZ),3.28(1H,m),2.96(1H,br),2.55(1H,m),2.55(1H,m,J=16.0,8.0H_Z),2.45(1H,m,J=16.0,8.0H_Z),1.74(1H,m),1.51(3H,s),1.53(1H,m),1.47(1H,m),1.42(1H,m),1.41,(2H,br.d,J=12.0H_Z),1.31(2H,m),1.31(2H,m),1.30(2H,m),1.30(1H,m),1.27(1H,m),1.23(1H,m);1.04(1H,m),1.04(3H,m),0.88(3H,d,J=8.0H_Z),0.84(3H,d,J=8.0H_Z),0.82(3H,t,J=8.0H_Z),0.54(3H,d,J=4.0H_Z)。

所述大环内脂类化合物的¹³C核磁共振波谱（DMSO-d₆,100MHz）数据如下所示：

δ(ppm):δ166.3(C-1,C),144.2,(C-3,CH),140.2(C-5,CH),134.3(C-14,C),133.0(C-15,CH),130.3(C-4,CH),119.9(C-2,CH),78.6(C-10,C),78.3(C-19,CH),77.6(C-11,CH),71.4(C-23,CH),71.3(C-9,CH),67.6(C-7,CH),41.8(C-17,CH₂),41.8(C-13,CH₂),39.7(C-6,CH₂),36.7(C-22,CH₂),34.7(C-8,CH₂),34.0(C-18,CH),30.6(C-12,CH),30.3(C-24,CH₂),29.6(C-16,CH),29.2(C-20,CH₂),22.5(C-21,CH₂),21.6(C-27,CH₃),20.6(C-30,CH₃),19.2(C-29,CH₃),16.8(C-28,CH₃),16.7(C-26,CH₃),10.6(C-25,CH₃)。

此外，本发明还测定了该化合物多种核磁共振图谱，如图5-8所示，从而确定了该化合物所有的碳原子和氢原子的归属及该化合物的化学结构，确定其为结构新颖的大环内脂类化合物，其结构式如下：

对所述大环内脂类化合物进行体外抗肿瘤试验：试验所用细胞株为国际通用的肿瘤细胞株:乳腺癌细胞MDA-MB-231、结肠癌细胞SW620、肝癌细胞SMMC7721和白血病细胞HeLa-60。

（1）细胞培养液的制备：在450ml的RPMI1640溶液中加入50ml胎牛血清、50mg/500ml氨苄青霉素，50mg/500ml链霉素溶液，得到细胞培养液。其中，所述RPMI1640溶液、胎牛血清、青链双抗溶液的厂商均为广东英韦创津生物科技（北京）有限公司。

（2）肿瘤细胞的培养：将上述四种肿瘤细胞分别用步骤（1）所获得的细胞培养液在37℃下，5%CO₂孵育箱中培养；然后取对数生长期的四种肿瘤细胞分别用0.25%胰蛋白酶消化，并调节细胞悬液密度至1×10⁵～4×10⁵个/mL，并按100μL/孔接种于96孔培养板，于5%CO₂、37℃条件下培养24h；然后将孔内的培养液吸净；

（3）将所述大环内脂类化合物100mg溶解到1ml乙醇中以获得储存液，将储存液用步骤（1）所得的细胞培养液稀释成7种浓度的溶液，即所述大环内脂类化合物的浓度分别为：200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.12μg/ml。

（4）每一种肿瘤细胞均对应设有七实验组和一空白组，七实验组为：往经步骤（2）处理所得的96孔培养板中分别加入经步骤（3）处理得到的大环内脂类化合物溶液，该化合物的终浓度为：100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.5625μg/ml，每孔加入100μL，每实验组设置三个平行孔；

一空白组：往经步骤（2）处理所得的96孔培养板中加入步骤（1）所得的细胞培养液，且空白组设三个平行孔。

（5）将经过步骤（4）处理后的培养板在37℃下，5%CO₂孵育箱中培养；在培养24h，48h和72h后，分别取出相应的孔板，倒置显微镜下观察，并拍下细胞的形态图；72h后每孔加入MTT液[即3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，溶入10ml的磷酸盐缓冲液中，配成5mg/ml的溶液。]（MTT的厂商为SIGMA公司）10μL，于孵育箱中继续孵育3-4h；吸净培养液，每孔加入150μL的二甲亚砜，在脱色摇床上摇动约10min溶解结晶，选择570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔的光吸收值，记录结果。按如下公式计算药物对肿瘤细胞抑制率：

肿瘤细胞生长抑制率(IC)=(OD对照组-OD实验组)/OD对照组×100%。

肿瘤细胞生存率=OD实验组/OD对照组×100%。

用SPSS软件分析半数致死浓度IC₅₀。试验结果见表2:

表2本发明的大环内脂类化合物对肿瘤细胞的IC₅₀（μM）

本发明的大环内脂类化合物在高浓度时可以引起细胞死亡，随浓度的降低，对肿瘤细胞生长的抑制作用减弱。

从该大环内脂类化合物的体外抗肿瘤活性试验表明：其有很强的抗肿瘤活性,因而其为研究开发新的抗肿瘤药物提供天然药物化学研究基础和先导化合物，对开发利用中国的海洋药物资源具有重要价值。

Claims

1.一种小单孢菌菌株，其特征在于：所述菌株为小单孢菌菌株FIM07-0019（Mciromonospora sp.FIM07-0019），于2012年8月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6474。

2.一种利用权利要求1所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：

3.如权利要求2所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，其特征在于：所述薄层层析的展层剂为体积比9:1氯仿-甲醇溶剂。

4.如权利要求2所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，其特征在于：所述种子培养基的组分为：可溶性淀粉1.5%，葡萄糖0.5%，蛋白胨0.5%，酵母粉0.5%，MgSO₄·7H₂O0.05%，NaCl0.05%，（NH₄）₂SO₄0.05%，K₂HPO₄0.05%，CaCO₃0.1%，蒸馏水配制，pH为7.5；且所述种子培养基中各组分的百分数均为质量分数。

5.如权利要求2所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，其特征在于：所述发酵培养基的组分为：可溶性淀粉4%，葡萄糖0.5%，蛋白胨0.5%，花生饼粉2.0%，MgSO₄·7H₂O0.05%，K₂HPO₄0.05%，CaCO₃0.1%，蒸馏水配制，pH为7.5，且所述发酵培养基中各组分的百分数均为质量分数。

6.一种利用权利要求1所述的小单孢菌菌株制备的大环内脂类化合物，其特征在于：结构式如下：