CN108530379B - 一种天然Rakicidins类化合物Rakicidin G及其提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于天然化合物技术领域，具体涉及一种天然Rakicidins类化合物Rakicidin G及其发酵提取方法。本发明从海洋小单孢菌发酵液中分离得到新的Rakicidins组分Rakicidin G。本发明天然化合物Rakicidin G对人结肠癌细胞HCT‑8和人胰腺癌细胞PANC‑1具有较好的体外抑制作用，对乏氧培养的肿瘤细胞HCT‑8和PANC‑1活性较常氧的分别强7.7倍和18.66倍，对抗艰难梭菌等厌氧菌活性优良，是一种结构新颖活性优良的次级代谢产物，具有较高的药用价值。

Description

一种天然Rakicidins类化合物Rakicidin G及其提取方法
技术领域
本发明属于天然化合物技术领域，具体涉及一种天然Rakicidins类化合物Rakicidin G及其发酵提取方法。
背景技术
目前，已从海洋微生物的代谢产物中分离出几百种生物活性物质，其中部分是可能有临床应用价值的抗肿瘤抗生素，Rakicidins化合物即是其中一类重要的化合物，目前已报道从小单孢菌和链霉菌中发现了一系列具有抗肿瘤活性或抑菌活性的Rakicidins化合物：如1995年，Kimberly D.Mcbrien等人在Micromonospora sp.R385-2中发现了Rakicidin A和B；2000年，Hu Jin-Feng等人从Streptomyces sp.GT61042中发现了Rakicidin C；2010年，Yasuhiro Igarashi等从Streptomyces sp.MWW064中发现了Rakicidin D；2014年，Naoya Oku等人在Micromonospora sp.TP-A0860中发现了RakicidinE；2017年，Shigeru Kitani等人在Streptomyces sp.GKU220中发现了Rakicidin F。
在从海洋小单孢菌筛选新抗肿瘤生物活性物质过程中，我们发现海洋Micromonospora sp.FIM 02-523能够产生包括Rakicidin A在内的一系列具有抗肿瘤活性的脂肽类化合物，近些年的研究也发现Rakicidin A具有卓越的乏氧选择性抗肿瘤细胞活性，在乏氧条件下抗结肠癌HCT-8细胞活性是常氧条件下的17.5倍。Takeuchi(2011)首次报道Rakicidin A在乏氧条件下能诱导髓性慢性白血病干细胞的凋亡，虽然该化合物抗乏氧肿瘤细胞及抗肿瘤干细胞(CSC)的作用机制虽不清楚，但Rakicidin A己被许多同行认为是一个极富开发前景的抗乏氧肿瘤细胞及抗CSC药物。
发明人课题组于2006年在国内首先报道从海洋来源的小单孢菌中分离到化合物Rakicidin A和B，并对Rakicidin B的体外抗肿瘤活性进行考察，发现其对肿瘤细胞株K562、L929的生长有明显抑制作用；2016年又分离得到Rakicidin A、B以及一种新的Rakicidins化合物--Rakicidin B1，其在常氧、乏氧状态下能够对肿瘤细胞具有明显的体外抑制作用；同时采用移植人结肠癌HCT-8肿瘤斑马鱼模型测试了这3个化合物的体内抑瘤活性，结果表明，Rakicidin A、B、B1均对斑马鱼体内的HCT-8细胞移植瘤均有抑制活性，且初步试验表明，其抗乏氧肿瘤细胞是基于其能有效抑制HIF-1(乏氧诱导因子-1)的表达。研究进一步测定了Rakicidin A、B、B1化合物对HCT-8、MGC803、A549、A375、Hep G2和CASKI五种人肿瘤细胞株的细胞毒活性，结果显示3个化合物对这些肿瘤细胞株均具有显著的抑制活性。可见，Rakicidins化合物具有极好的临床应用前景。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种天然Rakicidins类化合物Rakicidin G，并进一步公开其发酵提取方法。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种天然Rakicidins类化合物Rakicidin G及其药学上可接受的盐，所述化合物Rakicidin G具有如下式(Ⅰ)所示的结构：
Figure GDA0001717198950000021
本发明还公开了一种制备所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin G的方法，其特征在于，所述Rakicidin G是由保藏编号为CGMCC No.12132的小单孢菌Micromonosporasp.FIM02-523经发酵及分离获得。
本发明所述小单孢菌Micromonospora sp.FIM02-523，是从福建省莆田海滩土中筛选获得，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCCNo.12132。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日：2016年2月18日。
优选的，所述的制备所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin G的方法，包括如下步骤：
(1)取保存的小单孢菌Micromonospora sp.FIM02-523进行发酵，收集发酵液固液分离获得菌丝体；将所得菌丝体用甲醇或乙醇浸泡，收集浸泡液；
(2)以D3502大孔树脂吸附柱进行层析，并分别以60％和65％的乙醇-水进行梯度洗脱，收集65％乙醇-水洗脱液；
(3)将收集的洗脱液以HZ816树脂吸附柱进行层析，并分别以62％、64％和66％的乙醇-水溶液进行梯度洗脱，收集含有Rakicidin G的66％的乙醇洗脱液；
(4)以乙酸乙酯或二氯甲烷萃取所得洗脱液，浓缩获得粗品后用甲醇溶解，进行半制备液相色谱分离，并以体积比620：380的乙腈-水进行洗脱，分段收集，即得。
所述步骤(2)中，所述D3502大孔树脂吸附柱的径高比为1：5-1：10，装柱体积2.5-4.0L，吸附流速为30-45ml/min。
所述步骤(3)中，所述HZ816树脂吸附柱径高比为1：5-1：8，装柱体积2.2-3L，吸附流速为25-35ml/min。
所述步骤(4)中，所述半制备液相色谱为Welch Material，5μm，250mm×10mm，控制洗脱液流速8ml/min。
本发明还公开了所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin G及其药学上可接受的盐用于制备具有抗肿瘤活性和抗临床致病厌氧菌活性药物的用途。
所述肿瘤包括人结肠癌、人胰腺癌；所述致病厌氧菌包括艰难梭菌、消化链球菌、牙龈卟啉单胞菌和痤疮丙酸杆菌。
所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin G及其药学上可接受的盐的日服用剂量为1-5000mg/天，也可根据剂型的不同和疾病严重程度，使用剂量超出该范围。
本发明还公开了一种治疗致病厌氧菌感染疾病的药物，以所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin G及其药学上可接受的盐为活性成分，并添加药学上可接受的载体。
所述药物可以是普通片剂或胶囊、缓释片剂或胶囊、控释片剂或胶囊、口服液、注射剂等制剂学上常规的制剂形式。
本发明从海洋小单孢菌发酵液中分离得到新的Rakicidins组分Rakicidin G，该化合物结构与已知的Rakicidin A相比，仅在脂肽侧链不同，少一个亚甲基，Rakicidin G的侧链末端为乙基，而Rakicidin A的为异丙基。本发明天然化合物Rakicidin G对人结肠癌细胞HCT-8和人胰腺癌细胞PANC-1具有较好的体外抑制作用，对乏氧培养的肿瘤细胞HCT-8活性较常氧的强7.7倍，对乏氧培养的肿瘤细胞PANC-1活性较常氧的强18.66倍，对抗艰难梭菌等厌氧菌活性优良，是一种结构新颖活性优良的次级代谢产物，具有较高的药用价值。
实验例
一、抗肿瘤活性测试
分别将Rakicidin G样品溶解在DMSO中使得溶度达到4ug/ml，再分别稀释使得终浓度为2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml、0.0625ug/ml、0.03125ug/ml、0.015625ug/ml。
普通培养：取处于指数增长期的人结肠癌细胞HCT-8、人胰腺癌细胞PANC-1分别种在96孔板里(细胞浓度为HCT-8 5.0×104个/ml，PANC-1 4.0×104个/ml，100ul/孔)，培养24hr使其贴壁，加100ul/孔带药新鲜培养基，每个浓度设3个复孔；并设空白对照孔(只加培养基)作为阴性对照，同样设3个复孔；同样以现有技术已发现的Rakicidin A和RakicidinB化合物作为效果参照，同样设3个复孔。继续培养至72hr，终止培养。
分别将Rakicidin G样品溶解在DMSO中使得溶度达到4ug/ml，再分别稀释使得终浓度为1.3333ug/ml、0.4444ug/ml、0.148148ug/ml、0.0493827ug/ml、0.0164609ug/ml、0.00548697ug/ml、0.00182899ug/ml、0.000609663ug/ml；Rakicidin A和Rakicidin B同样处理。
乏氧培养：取处于指数增长期的人肠癌细胞HCT-8、人胰腺癌细胞PANC-1分别种在96孔板里(细胞浓度为HCT-8 5.0×104个/ml，PANC-1 4.0×104个/ml，100ul/孔)，乏氧通气30分钟，关闭通气阀门，放入培养箱37℃，培养24hr使其贴壁，加100ul/孔带药新鲜培养基，每个浓度设3个复孔，并设空白对照孔(只加培养基)作为阴性对照，同样设3个复孔。乏氧通气30分钟，关闭通气阀门，放入培养箱37℃，继续培养至72hr，终止培养。
MTT法检测：将终止培养的细胞，每孔加5mg/ml的MTT 20ul，在培养箱继续培养4小时，弃上清，每孔加入150ul DMSO溶液，摇床10分钟轻轻地混匀，在490nm波长下酶标仪读出每孔的OD值，并计算抑制率。通过对抑制率的换算，使用SPSS软件计算出IC50值，结果见下表1和表2。
抑制率(％)＝(阴性对照组OD值-实验组OD值)/阴性对照组OD值×100％。
表1Rakicidin G乏氧状态下对人结肠癌细胞HCT-8的抑制活性
Figure GDA0001717198950000051
Figure GDA0001717198950000061
表2Rakicidin G乏氧状态下对人胰腺癌细胞PANC-1的抑制活性
Figure GDA0001717198950000062
上述结果表明，本发明化合物Rakicidin G具有强效抗肿瘤活性特别是抗乏氧肿瘤细胞活性，对乏氧培养的肿瘤细胞HCT-8活性较常氧的强7.7倍，对乏氧培养的肿瘤细胞PANC-1活性较常氧的强18.66倍。
二、抗致病厌氧菌活性测试
取化合物Rakicidin G在DMSO中溶解成0.64mg/ml，其测试浓度为：128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125ug/ml。
测试所剩溶液将放置于-20℃，抗生素甲硝唑作为参照化合物。
2×溶液的配制：最高浓度为256ug/ml，紧接着在96深孔板中经过10次的两倍稀释，得到所需的2×溶液。用工作站分装l00ril到96孔圆底板，第12列是阴性对照，仅含相同体积的培养基。
细菌接种物的准备：提前2-3天在相应生长平板上进行接种，培养基包括：Brucella broth supplemented with hemin(5g/mL)，Vitamin K1(1g/mL)，and lysedhorse blood(5％v/v)。实验当天将细菌浓度调到约(1-2)×106CFU/ml，然后转移100ul到96-孔圆底板中(上述准备的加有化合物Rakicidin G的96孔板)。
MIC测定：将以上得到的96-孔圆底板放置于37℃，85％湿度条件下，厌氧条件下培养46-48小时。细菌生长被完全或明显抑制的浓度点将被定义为该化合物的MIC，结果见下表3。
表3Rakicidin G抗菌活性
Figure GDA0001717198950000071
上述抗菌测试结果表明，化合物Rakicidin G具有抗艰难梭菌、消化链球菌、牙龈卟啉单胞菌、痤疮丙酸杆菌等临床致病厌氧菌活性。
具体实施方式
实施例1Rakicidin G的制备
本实施例所述化合物Rakicidin G的制备，包括如下步骤：
取保存的小单孢菌Micromonospora sp.FIM02-523(保藏编号为CGMCC No.12132)进行发酵，发酵培养条件参照文献(江红，林如，郑卫，等.海洋青铜小单孢菌FIM02-523产生的脂肽类化合物FW523的分离鉴别和生物学活性[J].中国抗生素杂志，2006，31(5)：267-270)，具体包括：取一铂环小单孢菌Micromonospora sp.FIM02-523高氏天冬素琼脂斜面培养物接入种子培养基(可溶性淀粉1.5％、葡萄糖0.5％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、(NH4)2SO4 0.05％、K2HPO4·3H2O 0.05％、NaCl 0.05％、MgSO4·7H2O 0.05％、CaCO3 0.1％，自来水配制，pH7.5)，于32℃、240r/min震荡培养48h；随后5％移种量转入发酵培养基(可溶性淀粉2％、蔗糖0.5％、干酪素1.0％、玉米浆0.5％、MgSO4·7H2O 0.04％、FeSO4·7H2O0.005％、CuSO4·5H2O 0.005％、CoCl2·6H2O 0.0005％、CaCO3 0.3％，自来水配制，pH7.5)，于32℃、240r/min震荡培养96-120h，收集发酵液并于4500rpm离心15min后，获得菌丝渣，把获得的菌丝渣用2倍体积的90％的乙醇过夜浸泡2次，将含有酒精的菌丝渣再次于4500rpm离心15min后将上清液合并，得到发酵提取液；
取发酵提取液45L，并稀释至乙醇浓度为55％，随后以D3502大孔树脂吸附柱层析(径高比为1：8，装柱体积3.0L)，吸附流速为35ml/min，分别用60％和65％的乙醇水洗脱3BV、8BV(倍柱体积)，用HPLC(YMC ODS C18柱，5μm，250mm×4.6mm)检测洗脱液(乙腈-水700：300，柱温40℃，流速1.0mL/min，波长262nm)，收集含有Rakicidin G的65％的乙醇洗脱液(22L)；
将上述收集的洗脱液稀释至乙醇浓度为60％，以HZ816树脂吸附柱进行层析(径高比为1：6，装柱体积2.5L)，控制吸附流速为30ml/min，用62％、64％和66％的乙醇-水溶液进行洗脱，分别洗脱2BV、2BV和6BV，以HPLC(YMC ODS C18柱，5μm，250mm×4.6mm)跟踪检测洗脱液(乙腈-水700：300，柱温40℃，流速1.0mL/min，波长262nm)，收集含有Rakicidin G的66％的乙醇水溶液(12L)；
取收集的洗脱液浓缩至约1/3体积，用等体积二氯甲烷萃取三次，减压浓缩，得粗品，并将所得粗品，用甲醇溶解，使用半制备液相色谱(5μm，250mm×10mm，WelchMaterial)，以体积比620：380的乙腈-水进行洗脱，控制流速8ml/min，HPLC检测收集液，得到样品Rakicidin G。
经观察及检测，本实施例制得的所述化合物Rakicidin G为白色无定型粉末，可溶于氯仿、甲醇、DMSO，不溶于水。
高分辨质谱(HR-ESI-MS)显示，其分子离子峰[M+Na]+为615.3924，推断其分子式为C31H52N4O7，不饱和度为8。1HNMR显示该化合物有4个双键质子[δH 6.87(1H,d,J＝15.0Hz),6.16(1H,d,J＝15.0Hz),5.44(1H,s),5.33(1H,s)]，5个可交换质子[δH 8.89(1H,s),8.05(1H,d,J＝10.0Hz),7.28(1H,s),7.31(1H,s),5.67(1H,d,J＝6.0Hz)]，4个甲基质子[δH2.95(3H,s),1.05(3H,d,J＝6.9Hz),0.93(3H,d,J＝6.7Hz),0.84(3H,t,J＝7.0Hz)]。
13CNMR和DEPT135显示该分子含有31个碳信号，包括5个季碳(δC 172.5,172.0,169.1,167.5,165.9)，4个双键碳[包含一个sp2亚甲基碳(δC 116.9)，两个sp2次甲基碳(δC137.8,118.7)]，6个sp3次甲基碳[包含两个连氧碳原子(δC 78.0,72.3)]，14个sp3亚甲基碳和4个甲基碳原子(δC 36.5,15.3,14.0,13.2)。
所有的氢质子通过HSQC谱1H-13C相关进行指认。1H-1H COSY相关谱和质子的耦合常数显示该化合物含有4个独立的自旋耦合体系：NH-2-C-2-C-3-OH-3，C-9-C-10，C-30-C-14-C-15-C-16(C-31)-C-17-C-18和C-28-C-29-C-30。结合1H-1H COSY和HMBC可知，H-2与C-1/C-5相关，H-3与C-4相关，OH-3与C-2/C-3相关，Ha-6与C-5/C-7相关，H-7与C-6/C-8相关，H-9与C-8/C-11相关，H-10与C-8/C-11相关，Hb-12与C-10/C-11相关，H-15与C-1相关，H-30与C-13/C-14/C-15相关，H-31与C-15/C-16/C-17相关，以及H-29与C-27/C-28相关，氢和碳的化学位移列于下表4。
表4氢和碳的化学位移
Figure GDA0001717198950000091
Figure GDA0001717198950000101
可见，本实施例制得化合物Rakicidin G结构正确。
实施例2Rakicidin G的制备
本实施例所述化合物Rakicidin G的制备，包括如下步骤：
取保存的小单孢菌Micromonospora sp.FIM02-523进行发酵，发酵过程同实施例1，收集发酵液并于4500rpm离心15min后，获得菌丝渣，把获得的菌丝渣用2倍体积的90％的乙醇过夜浸泡2次，将含有酒精的菌丝渣再次于4500rpm离心15min后将上清液合并，得到发酵提取液；
取发酵提取液30L，并稀释至乙醇浓度为50％，随后以进行D3502大孔树脂吸附柱层析(径高比为1：5，装柱体积2.5L)，吸附流速为45ml/min，分别用60％和65％的乙醇水洗脱2.5BV、6BV，用HPLC(YMC ODS C18柱，5μm,250mm×4.6mm)检测洗脱液(乙腈-水700：300，柱温40℃，流速1.0mL/min，波长262nm)，收集含有Rakicidin G的65％的乙醇洗脱液(13L)；
将上述收集的洗脱液稀释至乙醇浓度为55％，以HZ816树脂吸附柱进行层析(径高比为1：8，装柱体积3.0L)，控制吸附流速为35ml/min，用62％、64％和66％的乙醇-水溶液进行洗脱，分别洗脱2BV、2BV和5BV，以HPLC(YMC ODS C18柱，5μm,250mm×4.6mm)跟踪检测洗脱液(乙腈-水700：300，柱温40℃，流速1.0mL/min，波长262nm)，收集含有Rakicidin G的66％的乙醇水溶液(11.5L)；
取收集的洗脱液浓缩至约1/3体积，用等体积乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩，得粗品，并将所得粗品，用甲醇溶解，使用半制备液相制备(5μm，250mm×10mm，WelchMaterial)，以体积比620：380的乙腈-水进行洗脱，控制流速8ml/min，HPLC(YMC ODS C18柱，5μm，250mm×4.6mm)检测收集液，得到样品Rakicidin G。经检测，产物结构正确。
实施例3Rakicidin G的制备
本实施例所述化合物Rakicidin G的制备，包括如下步骤：
取保存的小单孢菌Micromonospora sp.FIM02-523进行发酵，发酵过程同实施例1，收集发酵液并于4500rpm离心15min后，获得菌丝渣，把获得的菌丝渣用2倍体积的90％的乙醇过夜浸泡2次，将含有酒精的菌丝渣再次于4500rpm离心15min后将上清液合并，得到发酵提取液；
取发酵提取液55L，并稀释至乙醇浓度为60％，随后以进行D3502大孔树脂吸附柱层析(径高比为1：8，装柱体积4.0L)，吸附流速为30ml/min，分别用60％和65％的乙醇水洗脱3.5BV、9BV，用HPLC检测(YMC ODS C18柱，5μm，250mm×4.6mm)洗脱液(乙腈-水700：300，柱温40℃，流速1.0mL/min，波长262nm)，收集含有Rakicidin G的65％的乙醇洗脱液(28L)；
将上述收集的洗脱液稀释至乙醇浓度为60％，以HZ816树脂吸附柱进行层析(径高比为1：5，装柱体积2.2L)，控制吸附流速为25ml/min，用62％、64％和66％的乙醇-水溶液进行洗脱，分别洗脱2.5BV、3BV和6BV，以HPLC(YMC ODS C18柱，5μm，250mm×4.6mm)跟踪检测洗脱液(乙腈-水700：300，柱温40℃，流速1.0mL/min，波长262nm)，收集含有Rakicidin G的66％的乙醇水溶液(12L)；
取收集的洗脱液浓缩至约1/3体积，用等体积二氯甲烷萃取三次，减压浓缩，得粗品，并将所得粗品，用甲醇溶解，使用半制备液相制备(5μm，250mm×10mm，WelchMaterial)，以体积比620：380的乙腈-水进行洗脱，控制流速8ml/min，HPLC(YMC ODS C18柱，5μm,250mm×4.6mm)检测收集液，得到样品Rakicidin G。经检测，产物结构正确。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (2)

1.一种天然Rakicidins类化合物Rakicidin G的制备方法，其特征在于，
所述化合物Rakicidin G具有如下式（Ⅰ）所示的结构：
Figure 257199DEST_PATH_IMAGE001
所述Rakicidin G是由保藏编号为CGMCC No．12132的小单孢菌菌株FIM02-523经发酵及分离获得，具体包括如下步骤：
（1）取保存的小单孢菌菌株FIM02-523进行发酵，收集发酵液固液分离获得菌丝体；将所得菌丝体用甲醇或乙醇浸泡，收集浸泡液；
（2）以D3502大孔树脂吸附柱进行层析，并分别以60%和65%的乙醇-水进行梯度洗脱，收集65%乙醇-水洗脱液；
所述D3502大孔树脂吸附柱的径高比为1：5-1：10，装柱体积2.5-4.0L，吸附流速为30-45ml/min；
（3）将收集的洗脱液以HZ816树脂吸附柱进行层析，并分别以62%、64%和66%的乙醇-水溶液进行梯度洗脱，收集含有Rakicidin G的66%的乙醇洗脱液；
所述HZ816树脂吸附柱径高比为1：5-1：8，装柱体积2.2-3L，吸附流速为25-35ml/min；
（4）以乙酸乙酯或二氯甲烷萃取所得洗脱液，浓缩获得粗品后用甲醇溶解，进行半制备液相色谱分离，并以体积比620：380的乙腈-水进行洗脱，分段收集，即得。
2.根据权利要求1所述的制备所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin G的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述半制备液相色谱为Welch Material，5μm，250mm×10mm，控制洗脱液流速8ml/min。
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