CN109971674B - 一种发酵高产Rakicidin G的海洋小单孢菌株及其应用 - Google Patents

一种发酵高产Rakicidin G的海洋小单孢菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵高产Rakicidin G的海洋小单孢菌株及其应用。本发明通过对现有产Rakicidins化合物的海洋小单孢菌株FIM‑R150103进行诱变育种，得到一株高产Rakicidin G的突变菌株海洋小单孢菌株FIM181009，该菌株能够有效提高发酵液中Rakicidin G的效价，在20‑1000L发酵罐的发酵实验中，海洋小单孢菌FIM‑R181009发酵产生Rakicidin G的效价高达400mg/L左右，不仅极大的提高了目标产物Rakicidin G的发酵产量，而且有效降低了其他Rakicidins副产物的产率，有利于后续Rakicidin G的提取纯化工作，可以满足工业化需求。

Description

一种发酵高产Rakicidin G的海洋小单孢菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵产Rakicidin B1 的海洋小单孢菌株及其应用。
背景技术
Rakicidins类化合物为海洋小单孢菌的发酵产物，是目前已知的从海洋微生物的代谢产物中分离出的具有临床应用价值的抗肿瘤活性物质，是一类重要的化合物。
目前已报道从小单孢菌和链霉菌中发现了一系列具有抗肿瘤活性或抑菌活性的Rakicidins化合物包括：如1995年，Kimberly D.Mcbrien等人在 Micromonosporasp.R385-2中发现了Rakicidin A和B；2000年，Hu Jin-Feng 等人从Streptomycessp.GT61042中发现了Rakicidin C；2010年，Yasuhiro Igarashi等从Streptomycessp.MWW064中发现了Rakicidin D；2014年， Naoya Oku等人在Micromonospora sp.TP-A0860中发现了Rakicidin E；2016 年发明人课题组分离一种新的Rakicidins化合物--Rakicidin B1；2017年， Shigeru Kitani等人在Streptomyces sp.GKU220中发现了Rakicidin F。
除此之外，发明人课题组于2017年首次发现并分离得到新结构化合 Rakicidin G(记载于中国专利CN108530379A)和Rakicidin H(记载于中国专利CN108586380A)。研究进一步测定了Rakicidin G化合物对人结肠癌细胞HCT-8、人鼻咽癌细胞CNE-2Z和人胰腺癌细胞PANC-1具有较好的体外抑制活性。可见，Rakicidin G化合物具有极好的临床应用前景。
Figure BDA0001989525290000021
但是，现有研究中关于Rakicidin G化合物的发酵生产工艺研究及报道均较少。虽然Kimberly D.Mcbrien等报道了有利于Rakicidins类化合物的发酵及分离纯化工艺，但其仅限于摇瓶工艺阶段，并未发展到适合的工业化生产，而且其整体的发酵周期较长，并且其发酵液中的主要组分多为 Rakicidin A，Rakicidin B的含量比较低，不适用于RakicidinG化合物的发酵生产。中国专利CN108530379A虽然公开了一种Rakicidin G化合物的发酵制备方法，该方法中，采用野生菌株FIM-02523进行Rakicidins类化合物的发酵产生，虽然能够通过分离纯化获得少量Rakicidin G样品用于结构鉴定，但化合物Rakicidin G的产量和纯化收率极低，难于实现工业化生产。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种发酵高产Rakicidin G 的海洋小单孢菌株，以解决现有技术中Rakicidin G化合物的发酵产量较低的问题；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种利用上述菌株发酵生产Rakicidin G化合物的方法。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种海洋小单孢菌株，其分类命名为Micromonospora sp.FIM-R181009，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.17013。
本发明所述海洋小单孢菌株Micromonospora sp.FIM-R181009是由本实验室保存的海洋小单孢菌株Micromonospora sp.FIM-R150103(保藏编号为CGMCC NO.14822)经诱变获得。
本发明还公开了所述的海洋小单孢菌株在发酵生产Rakicidins化合物中的应用。
所述Rakicidins化合物为Rakicidin G，所述化合物Rakicidin G具有如下所示的结构：
Figure BDA0001989525290000031
本发明还公开了一种发酵生产Rakicidin G的方法，包括将所述的海洋小单孢菌株接种于适宜发酵培养基中进行发酵培养的步骤。
所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：玉米淀粉3.0-7.0％，葡萄糖 0.5-1.5％，玉米蛋白0.8-2.0％，安琪酵母浸粉0.5-2.0％，硝酸钾0.2-0.6％， MgSO4·7H2O0.04-0.06％，NaCl 0.2-0.8％，CaCO3 0.3-0.7％，自来水配制，调pH值为7.0～7.5。
优选的，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：玉米淀粉5.0％，葡萄糖1.0％，玉米蛋白1.5％，安琪酵母浸粉1.5％，硝酸钾0.3％， MgSO4·7H2O 0.05％，NaCl0.4％，CaCO3 0.5％，自来水配制，调pH值为7.2。
优选的，所述发酵培养步骤的条件为：以5.0-15.0％的接种量接种所述菌株，控制转速200-500rpm，通气0.8-1.5vvm，控制发酵过程DO值大于 30％，于28-32℃进行发酵培养。
优选的，所述发酵培养步骤的条件为：将种子罐培养好的种子以10％的接种量接种到发酵罐中，发酵前期控制转速200rpm，通气0.8vvm，随着菌丝的增长先逐步提高转速至500rpm；根据发酵罐DO参数的变化，再逐步提高通气至1.5vvm，发酵过程始终控制DO值大于30％。
更优的，所述发酵过程中，还包括向发酵液中补加氨基酸、有机酸、有机酸盐和/或有机醇进行补料的步骤。
具体的，所述氨基酸包括2-氨基丁酸和/或2-氨基己酸；
所述有机酸包括戊酸、庚酸、任酸和/或十一酸；
所述有机酸盐包括戊酸、庚酸、任酸或十一酸的铵盐、钠盐和/或钾盐；
所述有机醇包括正丙醇、正戊醇和/或正庚醇。
最优的，所述发酵过程中，优选在发酵进行到16-72h之间通过补料添加发酵液总体积1.0％的2-氨基丁酸。
所述方法还包括将所述菌株接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：玉米淀粉1.5-2.5％，葡萄糖 0.8-1.5％，玉米蛋白0.8-1.5％，安琪酵母浸粉粉1.5-3.0％，2-氨基丁酸0.1- 0.8％，MgSO4·7H2O 0.04-0.06％，KH2PO4 0.04-0.06％，CaCO3 0.2-0.4％，自来水配制，调pH值为7.0-7.5，灭菌后于28-32℃进行种子液培养。
优选的，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：玉米淀粉2.0％，葡萄糖1.0％，玉米蛋白1.1％，安琪酵母浸粉2.2％，2-氨基丁酸0.3％， MgSO4·7H2O 0.05％，KH2PO4 0.05％，CaCO3 0.3％，自来水配制，调pH值为7.2，灭菌后于30℃进行种子液培养。
所述种子液培养步骤包括摇瓶种子液培养和种子罐培养步骤。
所述方法还包括将所述菌株接种于高氏天冬素固体斜面培养基进行活化培养的步骤，所述固体斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉 1-3％，L-天冬素0.04-0.06％，KNO3 0.08-0.12％，K2HPO4·3H2O 0.04-0.06％， NaCl 0.04-0.06％，MgSO4·7H2O0.04-0.06％，CaCO3 0.08-0.12％，琼脂1-2％，调pH值7.2-7.5。
优选的，所述固体斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉 2％，L-天冬素0.05％，KNO3 0.1％，K2HPO4·3H2O 0.05％，NaCl 0.05％， MgSO4·7H2O 0.05％，CaCO30.1％，琼脂1.5％，调pH值7.2。
本发明通过对现有产Rakicidins化合物的海洋小单孢菌株FIM- R150103进行诱变育种，得到一株高产Rakicidin G的突变菌株海洋小单孢菌株FIM-R181009，该菌株能够有效提高发酵液中Rakicidin G的效价，在 20-1000L发酵罐的发酵实验中，海洋小单孢菌FIM-R181009发酵产生 Rakicidin G的效价高达400mg/L左右，且发酵液中其他组分大大降低，不仅极大的提高了目标产物RakicidinG的发酵产量，而且有效降低了其他 Rakicidins副产物的产率，有利于后续Rakicidin G的提取纯化工作，可以满足工业化需求。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为本发明突变株FIM-R181009的电镜扫描图；
图2为原始菌株FIM-R150103发酵液HPLC谱图；其中，RT9.35为 Rakicidin G产物，RT11.52为Rakicidin A，RT12.85为Rakicidin H，RT15.27 为Rakicidin B1，RT16.21为Rakicidin B；
图3为本发明所述突变株FIM-R181009发酵液HPLC谱图；其中， RT9.41为Rakicidin G产物；
图4为本发明突变株FIM-R181009罐上发酵曲线图。
具体实施方式
实施例1
实施例1菌株的诱变育种
本实施例说明海洋小单孢菌FIM-R181009的诱变育种方法包括如下步骤：
(1)孢子悬液制备：将培养成熟的出发菌株FIM-R150103(保藏编号CGMCCNO.14822)新鲜斜面加入适量无菌生理盐水，用接种铲轻轻刮下，倒入带有玻璃珠的无菌摇瓶振荡打散，后过滤菌丝，留下孢子悬液备用；
(2)亚硝基胍(NTG)诱变：称取200mg NGT于100ml三角瓶中，加入2ml丙酮，再加入18mlTris-氨甲烷马来酸缓冲液，使其完全溶解并混合均匀，得到浓度为10mg/ml的NTG溶液20ml；取NTG母液与制备好的菌悬液混合，使NTG终浓度分别为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml，于32℃摇床振荡培养30min；诱变后的孢子液马上离心去除NTG，再用无菌生理盐水反复离心洗涤孢子3遍后制成适当浓度的菌悬液；将菌悬液稀释至适当倍数，再分别取0.1mL涂于高氏天冬素平板上，将涂匀的平板，置于32℃恒温培养箱中培养12d，培养好的平皿用于计算致死率和菌种筛选；
(3)常压室温等离子体(ARTP)诱变：设置ARTP诱变育种仪的工作功率120W，气源为氩气，气流量10L/min，等离子体发射源与样品之间的照射距离为2mm，照射时间设为0、60、120、180、240、360s；取制备好的孢子悬液10ul均匀涂抹于无菌金属载片上，再将其放入ARTP仪中的样品载台；按程序进行等离子体照射，样品处理完毕后用无菌镊子将载片放至装有1ml生理盐水的EP管中，将EP管在振荡器上震荡1min，把附着在菌物载片上的微生物洗脱到液体中，形成新的菌悬液；对新的菌悬液进行适当稀释，取0.1ml稀释液涂布平板，置于32℃恒温培养箱中培养12d，培养好的平皿用于计算致死率和菌种筛选；
(4)NTG-ARTP复合诱变及Rakicidin G高产突变菌株的筛选：按照上述方法进行NTG和ARTP诱变获得较佳的诱变条件，按致死率达到70％为标准设定诱变条件；设定NTG诱变条件为：菌悬液中NTG终浓度为 1mg/ml、化学诱变处理时间为30min；ARTP诱变条件为：ARTP仪工作功率120W，气源为氩气，气流量10L/min，等离子体发射源与样品之间的照射距离为2mm，照射时间设为90s，将NTG诱变获得的菌悬液直接用于 ARTP诱变。对复合诱变后获得的菌悬液涂布分离于高氏1号培养基置于 32℃恒温培养箱中培养12d，培养好的平皿用于计算致死率和菌种筛选，同时对获得的单菌落进行摇瓶发酵HPLC验证。通过多轮复合诱变以及大量的摇瓶选育获得一株高产Rakicidin G的突变株，其编号为FIM-R181009，命名为Micromonospora sp.FIM-R181009，突变株FIM R181009的电镜扫描图见图1。
将诱变后获得的高产菌株FIM-R181009斜面连续传代6代，Rakicidin G发酵效价及组分比例未发现明显变化。将该菌存于20℃保种柜每隔2个月取原菌株传代一次发酵验证，结果该菌在12个月内Rakicidin G发酵效价及组分比例未发现明显变化。以上均表明突变菌株FIM-R181009具有高产且遗传稳定性状，适合工业化生产。将所得菌株海洋小单孢菌株Micromonospora sp.FIM-R181009保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.17013，保藏日期为2018年12 月19日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2出发菌株与突变菌株摇瓶发酵对比
分别取新鲜培养的海洋小单孢菌FIM150103及突变株FIM-R181009斜面孢子刮取后制成菌悬液接种到摇瓶种子培养中，在32℃、250rpm培养48 小时，后按8.0％接种量接种到摇瓶发酵培养基中，30℃、250rpm培养120 小时后放瓶，HPLC测定发酵产物(HPLC检测参照中国专利 CN108530379A)。
配制种子培养基配方(质量分数)：玉米淀粉2.0％，葡萄糖1.0％，玉米蛋白1.1％，安琪酵母浸粉2.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，KH2PO4 0.05％， CaCO3 0.3％，自来水配制，调pH值为7.2，灭菌后于30℃进行种子液培养。
配制发酵培养基配方(质量分数)：玉米淀粉5.0％，葡萄糖1.0％，玉米蛋白1.5％，安琪酵母浸粉1.5％，2-氨基丁酸0.3％，硝酸钾0.3％， MgSO4·7H2O 0.05％，NaCl 0.4％，CaCO3 0.5％，自来水配制，调pH值为 7.2。
发酵结束后，通过HPLC检测发酵液中Rakicidin G的含量，检测所得出发菌株FIM150103及突变株FIM-R181009发酵液的HPLC图分别见图2 和3，计算发酵液中产物组成及含量，发酵结果见表1所示。
表1出发菌FIM-R150103及突变株FIM-R181009发酵液中Rakicidins各组分含量
Figure BDA0001989525290000081
菌株FIM-R150103发酵液中，Rakicidin G含量为35.49mg/L；而诱变菌株FIM-R181009发酵液中，Rakicidin G含量达到304.56mg/L；而且 Rakicidin G从原来的小比例组分变成主要组分。可见，本发明突变菌株可有效提高发酵液中Rakicidin G的含量，同时降低其他Rakicidin组分的不利影响。
实施例3突变株FIM-R181009在20L发酵罐上发酵
按照实施例2中配方配制种子培养基及发酵培养基。
种子为摇瓶种子，500ml摇瓶每瓶装液量100ml，32℃、240rpm培养 48小时；之后按照8.0％的接种量接种于20L发酵罐(实际装液量13L)中进行发酵，30℃培养，控制罐压0.03-0.05Mpa，起始转速为200rpm，48小时后根据发酵参数DO变化逐步调至360rpm，通气量为1：1vvm，至发酵结束约96-120小时。
发酵过程通过HPLC检测突变株发酵液中Rakicidins类化合物的含量，发酵结果见下表2，最终发酵效价为：Rakicidin G含量为317.29mg/L。
表2突变株FIM-R181009发酵液中Rakicidins各组分含量
Figure BDA0001989525290000082
实施例4
本实施例的发酵过程同实施例3，其区别仅在于，在发酵开始16小时后流加补料1.0％的2-氨基-戊酸溶液：即在发酵16小时至72小时之间连续匀速流加总量为发酵液体积1.0％质量的2-氨基-戊酸溶液。
发酵过程通过HPLC检测发酵液中Rakicidins类化合物的含量，检测结果见下表3，最终发酵效价为：Rakicidin G含量为401.70mg/L。
表3突变株FIM-R181009发酵液中Rakicidins各组分含量
Figure BDA0001989525290000091
实施例5
本实施例的发酵过程同实施例3，其区别仅在于，在100L发酵罐中装液量为70L、接种量为10％，在发酵开始16小时后流加补料1.0％的2-氨基 -戊酸溶液：即在发酵16小时至72小时之间连续匀速流加总量为发酵液体积1.0％质量的2-氨基-戊酸溶液。
发酵过程通过HPLC检测发酵液中Rakicidins类化合物的含量，最终发酵效价为：Rakicidin G含量为396.08mg/L。
实施例6
本实施例的发酵过程同实施例3，其区别仅在于，在1000L发酵罐中装液量为720L，在发酵开始16小时后流加补料1.0％的2-氨基-戊酸溶液：即在发酵16小时至72小时之间连续匀速流加总量为发酵液体积1.0％质量的 2-氨基-戊酸溶液。
发酵过程通过HPLC检测发酵液中Rakicidins类化合物的含量，最终发酵效价为：Rakicidin G含量为411.58mg，其发酵过程曲线见图4所示。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种海洋小单孢菌株，其分类命名为Micromonosporasp. FIM-R181009，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.17013。
2.权利要求1所述的海洋小单孢菌株在发酵生产Rakicidins化合物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Rakicidins化合物为Rakicidin G。
4.一种发酵生产Rakicidin G的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的海洋小单孢菌株接种于适宜的发酵培养基中进行发酵培养的步骤。
5.根据权利要求4所述的发酵生产Rakicidin G的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：玉米淀粉3.0-7.0%，葡萄糖0.5-1.5%，玉米蛋白0.8-2.0%，安琪酵母浸粉0.5-2.0%，硝酸钾0.2-0.6%，MgSO4·7H2O 0.04-0.06%，NaCl 0.2-0.8%，CaCO30.3-0.7%，自来水配制，调pH值为7.2。
6.根据权利要求5所述的发酵生产Rakicidin G的方法，其特征在于，发酵培养步骤的条件为：以5.0-15.0%的接种量接种所述菌株，控制转速200-500rpm，通气0.8-1.5vvm，控制发酵过程DO值大于30%，于28-32℃进行发酵培养。
7.根据权利要求4-6任一项所述的发酵生产Rakicidin G的方法，其特征在于，发酵过程中，还包括向发酵液中补加2-氨基-戊酸的步骤。
8.根据权利要求7所述的发酵生产Rakicidin G的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述菌株接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：玉米淀粉1.5-2.5%，葡萄糖0.8-1.5%，玉米蛋白0.8-1.5%，安琪酵母浸粉1.5-3.0%， MgSO4·7H2O 0.04-0.06%，KH2PO4 0.04-0.06%，CaCO3 0.2-0.4%，自来水配制，调pH值为 7.0-7.5，灭菌后于28-32℃进行种子液培养。
9.根据权利要求8所述的发酵生产Rakicidin G的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述菌株接种于高氏天冬素固体斜面培养基进行活化培养的步骤，所述固体斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉 1-3%，L-天冬素0.04-0.06%，KNO3 0.08-0.12%，K2HPO4·3H2O 0.04-0.06%，NaCl 0.04-0.06%，MgSO4·7H2O 0.04-0.06%，CaCO3 0.08-0.12%，琼脂1-2%，调pH值7.2-7.5。
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海洋小单孢菌产生的缩肽类化合物rakicidins抗肿瘤活性研究;林风等;《中国抗生素杂志》;20161231;第41卷(第7期);第516-523页 *

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