CN115536616B - 一种珊瑚球菌来源的重排甾体化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种珊瑚球菌来源的重排甾体化合物,该化合物是式(Ⅰ)所示结构的corasterol化合物。所述重排甾体化合物是由珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284CGMCC NO.25442经过液体发酵后,从其发酵液的甲醇提取物中依次经过反相中低压柱色谱、正相硅胶柱色谱及高效液相色谱分离获得。本发明还公开了所述重排甾体化合物在制备抗肿瘤药物特别是在制备预防或治疗急性单核细胞白血病药物中的应用。实验证实制得的corasterol化合物选择性的对人单核细胞白血病THP‑1细胞具有细胞毒性和显著抑制作用,预示本发明所述corasterol化合物在肿瘤治疗特别是急性单核细胞白血病的预防和治疗中极具应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,涉及一种重排甾体化合物及其制备方法和应用,尤其涉及一种珊瑚球菌来源的重排甾体化合物(corasterol化合物)及其制备方法与应用。
背景技术
甾体一直是药物发现和开发的重要来源,重排甾体由于其特殊的结构特征及潜在的生物生理活性越来越受到研究者的关注。从结构上来讲,重排甾体是经典甾体的四环母核(A–D 环)骨架或C-17位侧链发生氧化重排或转化的非典型类甾体。重排甾体不仅具有多样化的骨架特征,往往还具有显著的生物活性,如抗肿瘤、抗炎、抗菌和免疫抑制等。调研发现,重排甾体的发现数量远不如经典甾体,且来源集中在大型真菌蘑菇及真菌等真核生物,例如来自于食用菌菇的重排甾体strophasterol A(J.Wu,S.Tokuyama,K.Nagai,etal.Angew.Chem.Int. Ed.2012,51,10820–10822)、来自于青霉菌的penicillitone(J.Xue,P.Wu,L.Xu,et al.Org.Lett.2014,16,1518–1521)以及来自于海洋真菌的dankasterone A等(T.Amagata,M.Doi,M. Tohgo,et al.Chem.Commun,1999,1321–1322),值得注意的是,目前尚未见细菌来源重排甾体的相关报道。
Corasterol化合物是一种珊瑚球菌来源的C环发生重排的具有6/6/6/5四环骨架的甾体天然产物。该四环骨架是由经典的甾体四环母核中的C环发生9位和11位氧化开环后重排形成了新的6/6/6/5环体系。本发明所述的corasterol是申请人首次在黏细菌中首次发现的C环重排甾体。更为引人注目的是,甾体中9,11位发生开环产物的报道仅存在于低等无脊椎动物海绵、珊瑚及真菌等真核生物中,而黏细菌中目前尚无相关研究报道。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种重排甾体新化合物(corasterol化合物);本发明的第二目的在于提供所述corasterol化合物的制备方法;本发明的第三目的在于提供所述corasterol 化合物在制备抗肿瘤药物特别是在制备预防或治疗急性单核细胞白血病药物中的应用。
本发明的第一目的是提供了一种新的重排甾体化合物,或者其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前药分子或代谢物。所述的重排甾体化合物是从珊瑚球菌发酵提取物中分离获得,所述重排甾体化合物是式(Ⅰ)所示结构的corasterol化合物:
本发明的第二目的是这样实现的,所述的corasterol化合物是以珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284 CGMCC No.25442发酵液为原料,依次经过大孔树脂的吸附、有机溶剂的提取浓缩、反相中低压色谱分离、正相色谱分离及高效液相色谱分离得到的。具体的,本发明所述corasterol化合物的制备方法是:
1.菌株发酵
(1)平面培养:将珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284CGMCC No.25442菌株接种至VY/2固体培养基中,放入恒温箱中培养得到活化菌株。
所述的恒温箱培养条件是:30℃,培养2–3天;所述的VY/2固体培养基的成分是:安琪酵母0.5g/100ml,七水硫酸镁0.1g/100ml,氯化钙0.07g/100ml,琼脂粉1.5–2g/100ml,pH值调至7.2。
(2)种子培养:将活化好的上述菌体接种到VY/2液体培养基,放入摇床震荡培养获得种子培养液。
所述的摇床震荡培养条件是:30℃,200rpm培养2–3天;所述VY/2液体培养基:安琪酵母0.5g/100ml,七水硫酸镁0.1g/100ml,氯化钙0.07g/100ml,pH值调至7.2。
(4)发酵:将制得的种子培养液转接到新鲜的VY/2液体培养基放入摇床进行扩大发酵。
所述的扩大发酵培养条件是:30℃,200rpm培养7天;所述VY/2液体培养基成分与(2) 中培养基成分相同。
2.发酵液处理
发酵结束后,用HP-20大孔树脂富集上清菌液中的次级代谢产物,并用甲醇反复洗脱,浓缩获得甲醇提取物。
3.化合物制备
将甲醇提取物经反相中低压液相色谱以5:95-100:0的甲醇/水溶液进行梯度洗脱,得到六个馏分(A–F)。组分F通过以环己烷-丙酮为流动相经硅胶柱色谱分离获得八个馏分F1–F8; F5通过以二氯甲烷-甲醇为流动相经硅胶柱色谱得到七个馏分F51–F57。最后以甲醇-水为流动相经高效液相色谱纯化F53,得到式(Ⅰ)所示结构的corasterol化合物。
所述环己烷-丙酮合适的配比优选6:1;所述二氯甲烷-甲醇合适的配比优选50:1;所述高效液相色谱流动相甲醇-水溶液合适的配比优选98:2。
本发明第三目的是这样实现的,提供所述重排甾体化合物(corasterol化合物)在制备抗肿瘤药物中的应用;其中所述抗肿瘤药物优选是指预防或治疗急性单核细胞白血病的药物。
本发明还提供一种含所述重排甾体化合物的抗肿瘤药物制剂,其特征在于:所述药物制剂含有治疗有效量的所述重排甾体化合物和药学上可接受的一种或多种载体物质和/或辅剂。
其中:所述抗肿瘤药物制剂优选是指预防或治疗急性单核细胞白血病的药物制剂。所述药物制剂的剂型优选是片剂、胶囊剂、安瓿剂、注射冻干剂。
实验证实:本发明所述重排甾体化合物(corasterol化合物)对9种癌细胞株(人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF7、人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞HepG2、人单核细胞白血病THP-1、人结肠癌细胞HCT 116、人前列腺癌细胞PC3、人食管癌细胞KYSE410及人骨肉瘤细胞MG-63)的细胞毒活性测试显示,corasterol化合物的抗肿瘤活性具有很强的选择抑制性,特别对人单核细胞白血病THP-1细胞具有显著的选择性抑制作用。此为抗肿瘤活性研究以及制备预防或治疗急性单核细胞白血病的药物奠定了基础。
本发明的有益效果是:
1.本发明提供了一种天然的结构新颖的重排甾体化合物,目前重排甾体的发现数量远不如经典甾体,本发明所提供的corasterol化合物丰富了重排甾体的结构多样性。
2.本发明所提供的corasterol化合物产自黏细菌,也是原核生物中首次发现的重排甾体。目前已报道的重排甾体主要来源于真核生物,如真菌及大型真菌蘑菇等,本发明首次从黏细菌中发现了重排甾体,为重排甾体的开发应用提供了重要的微生物新来源。
3.本发明中的重排甾体化合物制备方法具有培养条件温和、培养基配制简单易行、发酵时间短、易于大规模生产等优势,为大量制备重排甾体化合物以及利用其开发成预防或治疗人类癌症药物解决了原料问题。
4.本发明中所述的重排甾体化合物细胞毒活性实验表明,该化合物只对人单核细胞白血病THP-1具有较好的细胞增殖抑制活性,表明该化合物具有较强的选择性抑制肿瘤增殖活性,为开发特异性预防或治疗急性单核细胞白血病提供了新化合物或先导化合物,也为医用工业提供有应用价值的新药源分子。
附图说明
图1:菌株珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284在黏细菌目中的进化位置。
图2:Corasterol的关键HMBC和1H–1H COSY信号。
图3:Corasterol的关键NOESY信号。
图4:Corasterol的ECD计算光谱。
图5:Corasterol的1H核磁共振谱。
图6:Corasterol的13C核磁共振谱。
图7:Corasterol的HSQC二维核磁共振谱。
图8:Corasterol的HMBC二维核磁共振谱。
图9:Corasterol的1H–1H COSY二维核磁共振谱。
图10:Corasterol的NOESY二维核磁共振谱。
图11:Corasterol的高分辨质谱。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解,下面提供的实施例对本发明做了更详细的说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已,应该说明的是,下述说明仅仅是为了解释本发明,并非对本发明作任何形式上的限制,凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改,等同变化与修饰,均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中,所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均从商业途径得到。
本发明所述珊瑚球菌SDU284是以常规方法分离自吉林省松原市夜字泡湖湖底泥土样中。该菌株分离方法是:待WCX培养基凝固后,在培养基上均匀涂抹4个黄豆大小的大肠杆菌。将处理后的样品(吉林省松原市夜字泡湖湖底泥土样)均匀的涂抹在大肠杆菌菌垫上,于30℃恒温培养箱中培养。培养3天后,每天在体视显微镜下观察平板黏细菌的生长变化情况。及时小心挑取子实体顶部或刮取菌膜边缘,转接至新的有大肠杆菌菌垫的WCX培养基或者 VY/2培养基,进行进一步的纯化培养,从中得到一株橙黄色细菌,命名为珊瑚球菌SDU284。所述菌株由山东大学微生物国家重点实验室鉴定为珊瑚球菌(Corallococcusinteremptor) SDU284(图1),并于2022年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏中心编号为:CGMCC No.25442。
实施例1菌株的发酵及corasterol化合物的分离纯化
1.1珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284 CGMCC No.25442的发酵和粗提物的获得
将珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284接种于VY/2固体平板,30℃静置培养 2–3天后,用10μL接菌环刮取满环菌体。将菌体接种到100mL液体VY/2培养基,200rpm 振荡培养2–3天,达到对数生长期后,以体积比10%作为接种量转接至新鲜VY/2液体培养基中进行扩大发酵。保持30℃恒温,200rpm振荡培养7天后,过滤掉菌体,向每1L培养液中加入20g的吸附树脂HP-20,30℃,200rpm条件下过夜吸附,收集树脂,以制备corasterol 化合物。将收集的树脂装入玻璃层析柱中,用20L甲醇洗脱树脂,使用旋转蒸发仪40℃减压浓缩浸提液,获得含corasterol的粗提物(1.0g)。
上述的VY/2固体培养基的成分是:安琪酵母0.5g/100ml,七水硫酸镁0.1g/100ml,氯化钙0.07g/100ml,琼脂粉1.5–2g/100ml,pH值调至7.2。上述的VY/2液体培养基的成分是:安琪酵母0.5g/100ml,七水硫酸镁0.1g/100ml,氯化钙0.07g/100ml,pH值调至7.2。
发酵结束后,用HP-20树脂富集上清菌液中的次级代谢产物,并用甲醇反复洗脱,浓缩获得corasterol甲醇提取物。甲醇提取物经反相制备中压液相色谱以5:95–100:0的甲醇/水溶液进行梯度洗脱,得到六个馏分(A–F)。组分F通过以环己烷-丙酮为流动相经硅胶柱色谱分离获得八个馏分F1–F8;F5通过以二氯甲烷-甲醇为流动相经硅胶柱色谱得到七个馏分 F51–F57。最后以甲醇-水为流动相经高效液相色谱纯化F53,得到式(Ⅰ)所示结构的corasterol 化合物。
1.2 corasterol的具体分离纯化方法
将含有上述corasterol化合物的粗提物(1.0g)进一步采用反相中低压柱层析(仪器:歩琦Pure C-810,配备FlashPure EcoFlex C18色谱柱),以甲醇水体系做梯度洗脱(流速10ml/min; 10%–100%:0–180min;100%:30min),依据出峰情况检测结果,最终合并成六个馏分(A–F)。通过氢谱测试,在组分F中检测到上述corasterol化合物的特征甾体氢信号(如δH 3.5-3.8:甾体A环上的3位OH;δH 5.0-5.5:甾体侧链上烯双键特征信号)。
采用正相硅胶柱色谱(柱直径1.6cm,装填H254硅胶13g)分离组分F(106.5mg),用环己烷-丙酮(6:1)等度洗脱,根据TLC检测合并成八个馏分F1–F8,通过氢谱测试显示,组分F5中含有上述corasterol化合物。再次使用正相硅胶柱色谱(柱直径1.5cm,装填H254 硅胶7g)对组分F5(12.2mg),以二氯甲烷–甲醇体系(50:1)等度洗脱获得七个馏分F51–F57,通过氢谱测试显示,corasterol化合物在组分F53中。使用高效液相色谱对F53(2.3mg)进行纯化,得到重排甾体corasterol(1.6mg)(98%甲醇/水,tR=23.0min)。
液相色谱仪型号为安捷伦1260;采用飞诺美Luna-C18 5μm色谱柱(10×250mm),紫外检测波长为210nm,洗脱条件为流速1.8ml/min,98%甲醇/水。
1.3Corasterol化合物理化性质及波谱数据
进一步地,对上述富集到的corasterol化合物进行高分辨质谱、核磁、圆二色谱的检测。
仪器型号:核磁测试Bruker AvanceⅢ(600MHz);HRESIMS测试LTQ-Orbitrap XL;UV/ECD测试Chirascan;
本发明所述corasterol化合物的理化性质及波谱数据如下:
Corasterol:白色无定型粉末;ECD(MeOH):200(Δε+9.85),255(Δε-6.72)nm;for1H NMR and 13C NMR核磁数据,见表1;HRESIMS at m/z427.3200[M+H]+(calcd forC28H43O3, 427.3212)。
实施例2Corasterol的结构鉴定
2.1 Corasterol的平面结构鉴定
Corasterol为白色无定型粉末,TLC香草醛显色为紫色。高分辨质谱HRESI-MS[427.3200 [M+H]+(calcd for C28H43O3,427.3212)]提示该化合物的分子量为426,分子式为C28H42O3,不饱和度为8。Corasterol的1H、13C谱数据(表1)结合HSQC谱显示结构中存在六个甲基质子信号(δH 1.19、1.08、0.99、0.95、0.87和0.85;δC 18.9、21.8、20.5、18.2、20.3和20.1), 两个烯双键质子氢信号(δH 5.28和5.25;δC 133.9和136.3),八个次甲基氢信号:包括两个连氧次甲基信号(δH 3.70和3.08;δC 68.7和62.9),六个亚甲基,以及六个季碳:包括一个共轭酮羰基(δC 202.8)。2D NMR数据的初步分析(图2和图3)显示,corasterol拥有重排的6/6/6/5四环系统(环A–D)。在1H-1H COZY中,H-1/H-2/H-3/H-4的连续相关,结合H-1与C-10、H3-19与C-1、C-10的HMBC相关,以及H-4与C-5的HMBC相关表明结构中含有在C-3(δC68.7)处带有一个羟基的环A。环C和D的构建是通过 H-7/H-14/H-13和H-15/H-16的1H-1HCOSY相关以及HMBC中H-7与C-8相关、H-15与 C-11相关、H-16与C-12、C-17相关以及H3-18与C-11、C-12、C-13、C-17的相关构建而来。另外,H-4与C-5、C-10的HMBC相关、H-6与C-4、C-5、C-7、C-14的HMBC相关以及H3-19与C-1、C-9的HMBC相关将环A与环C/D通过C-5/C-10和C-7/C-8连接。此外,环A–D、两个双键和一个羰基占有8个不饱和度中的7个,表明存在与环B(C-5/C-6) 相连的环氧乙烷基团。最后,C-17位长烷烃侧链的存在是由1H–1H COSY中 H-17/H-20/H-22/H-23、H-24/H-25、H-20/H3-21、H-24/H3-28和H-25/H3-26(H3-27)的相关以及HMBC中H-23与C-20、C-28的相关,H-22与C-24相关、H-16与C-20相关确定的。由此,发明人确定了corasterol的平面结构,该化合物是一种具有罕见的6/6/6/5四环体系的重排甾体。
表1:Corasterol的核磁共振数据(碳谱150MHz;氢谱600MHz)
2.2Corasterol的立体构型确定
通过NOESY光谱分析确定了corasterol中四环核的相对构型。在NOESY谱中,H3-19/H-1β、H3-19/H-6、H3-19/H-7、H-3/H-1α、H-6/H-14β、H3-18/H-14α、H-7/H-13α、H-17/H-13α的相关性(图3),表明H-3和H3-18处于四环母核的α方向,而H-6、H-7、H-17和H3-19 在β方向。根据生物合成推测,侧链上的C-20和C-24的相对构型在D环发生重排后保留并与麦角甾醇一致。因为麦角甾醇也是从该珊瑚球菌中分离得来的。Corasterol的相对构型指定为3S*,5R*,6S*,7S*,10S*,12R*,17R*,20S*,24R*。采用ECD含时密度泛函理论(TD-DFT) 方法在B3LYP/6-31G(d,p)水平上进行的ECD计算确定了corasterol的绝对构型。计算了3S,5R,6S,7S,10S,12R,17R,20S,24R(a)和其对映异构体(b)的两种可能的绝对构型。结果表明, a的计算曲线与其实验ECD光谱匹配良好(图4)。综上,发明人确定了corasterol的绝对构型为3S,5R,6S,7S,10S,12R,17R,20S,24R。
实施例3Corasterol的细胞毒活性测试
对实施例2制备得到的corasterol化合物进行抗肿瘤活性检测实验,实验情况如下:
1.肿瘤细胞系
实验采用的9种肿瘤细胞株均由青岛艾科生物科技有限公司提供,包括人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF7、人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞HepG2、人单核细胞白血病THP-1、人结肠癌细胞HCT 116、人前列腺癌细胞PC3、人食管癌细胞KYSE410及人骨肉瘤细胞 MG-63。
2.细胞毒性(CCK-8法)检测原理:
采用的CCK-8法是按照文献(H.Tominaga,M.Ishiyama,F.Ohseto,et al.Anal.Commun.1999,36,47-50;X.Li,S.L.Zheng,X.Li,et al.Eur.J.Med.Chem.2012,54,42-48)方法进行。检测原理为CCK-8试剂中含有WST–8,它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。
3.实验方法:
(1)接种细胞:用含10%胎牛血清的培养液将9种肿瘤细胞分别配成单细胞悬液,依次给96孔板每孔分别接种细胞,贴壁细胞按90μL/孔5×104个/mL的量接种,悬浮细胞按90μL/ 孔9×104个/mL的量接种,在5%CO2,37℃的条件下预培养24h。
(2)加入待测corasterol化合物样品溶液:每孔加入10μL样品溶液,活性初筛每个样品设置1个浓度,设3个复孔;IC50测定8个浓度(含0浓度),每种浓度均设3个复孔;置于培养箱培养48h。实验设置空白组(Blank)、对照组(Control)和药物组(Drug)。
(3)显色:贴壁细胞吸出旧培养基和药物溶液(悬浮细胞直接加入10μL CCK-8溶液原液),每孔加入稀释十倍的100μL CCK-8溶液,在37℃,5%CO2继续培养1-4h(避光操作,实时观察)。
(4)检测:用酶标仪测定450nm处吸光度,记录原始数据结果。
(5)应用Excel软件进行原始数据标准化处理,初筛通过每孔OD值计算细胞增殖抑制率(公式=(ODControl-ODDrug)/(ODControl-ODBlank)×100%),统计抑制率。IC50通过GraphPadPrism 8(版本8.0.2,GraphPad Software Inc)计算,实验结果用±SD表示。
(6)阳性对照:盐酸阿霉素Doxorubicin(Dox)。
4.实验结果
Corasterol化合物对9种癌细胞株的细胞毒活性测试结果如表2所示,corasterol化合物对人单核细胞白血病THP-1细胞具有明显的选择性的抑制癌细胞增殖活性,其IC50值为 22.04μM;而对其他8株细胞株的IC50值均大于50μM。该实验结果表明corasterol化合物的抗肿瘤活性具有很强的选择抑制性,特别对人单核细胞白血病THP-1细胞具有显著的选择性抑制作用。
表2:corasterol化合物对9种癌细胞株的细胞毒活性测试
实施例4一种含corasterol化合物的片剂
制备方法:将corasterol与乳糖和玉米淀粉混合,用水均匀湿润,过筛并干燥,再过筛,加入硬脂酸镁,均匀后压片,每片重240mg,corasterol含量为10mg。
实施例5一种含corasterol化合物的胶囊剂
制备方法:将corasterol与乳糖、硬脂酸镁混合,过筛,均匀混合,把得到的混合物装入硬明胶胶囊,每个胶囊重200mg,corasterol成分含量为10mg。
实施例6一种含corasterol化合物的安瓿剂
制备方法:将corasterol 2mg和氯化钠10mg,溶解于适量的注射用水中,过滤所得溶液,在无菌条件下装入安瓿瓶中。
实施例7一种含corasterol化合物的注射用冻干剂
制备方法:将碳酸氢钠2mg、甘露醇252mg,加注射用水溶解,加活性炭吸附30min除热原,过滤除去活性炭,在滤液中加入10mg corasterol或其盐,超声处理使溶解,用1N盐酸调节pH为5.0–7.0,微孔滤膜过滤,加入注射用水,分装,冷冻干燥,上塞,轧盖,即得。
Claims (7)
1.一种珊瑚球菌来源的重排甾体化合物,其特征在于:所述重排甾体化合物是式(Ⅰ)所示结构的corasterol化合物:
2.一种权利要求1所述重排甾体化合物药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体。
3.权利要求1所述重排甾体化合物的制备方法,其特征在于:所述重排甾体化合物是以珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284 CGMCC No.25442发酵液为原料,经过大孔树脂的吸附、有机溶剂的提取浓缩、反相中低压色谱分离、正相色谱分离及高效液相色谱分离得到。
4.权利要求1所述重排甾体化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:所述抗肿瘤药物是指预防或治疗急性单核细胞白血病的药物。
6.一种含权利要求1所述重排甾体化合物的抗肿瘤药物制剂,其特征在于:所述药物制剂含有治疗有效量的权利要求1所述重排甾体化合物和药学上可接受的一种或多种载体物质和/或辅剂。
7.根据权利要求6所述的抗肿瘤药物制剂,其特征在于:所述抗肿瘤药物制剂是指预防或治疗急性单核细胞白血病的药物制剂。
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具有抑瘤活性的粘细菌珊瑚状珊瑚球菌Cc9736发酵产物的初步研究;李健等;中国抗生素杂志;第24卷(第4期);第308-309页 * |
珊瑚状珊瑚球菌Cc9736抗肿瘤活性组分的分离纯化;胡玮第;中国抗生素杂志;第25卷(第4期);第309-311页 * |
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