CN115650854B - 整合素衍生物及其制备方法和在α-葡萄糖苷酶抑制药物等方面的应用 - Google Patents
整合素衍生物及其制备方法和在α-葡萄糖苷酶抑制药物等方面的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了整合素衍生物及其制备方法和在α‑葡萄糖苷酶抑制药物等方面的应用。本发明所述的化合物5'‑methoxy‑integracins A‑B、integracins A‑B是从巴戟天植物内生真菌Cytospora rhizophorae A761的发酵培养物中分离制备得到的。本发明从巴戟天植物内生真菌Cytospora rhizophorae A761中分离制备得到化合物5'‑methoxy‑integracins A‑B、integracins A‑B，该类化合物5'‑methoxy‑integracins A‑B、integracins A‑B具有比较显著的抗肿瘤、抗菌、α‑葡萄糖苷酶抑制活性，可以用于制备抗肿瘤、抗菌、α‑葡萄糖苷酶抑制药物，为研究与开发新的抗肿瘤、抗菌、α‑葡萄糖苷酶抑制药物提供了候选化合物，为开发利用植物内生真菌来源的天然活性物质提供了科学依据。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及化合物5'-methoxy-integracin B、integracin A、 integracin B制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用；化合物5'-methoxy-integracin A、integracin A、integracin B制备方法及其在制备α-葡萄糖苷酶抑制药物中的应用；化合物integracin B制备方法及其在制备抗菌(S.aureus、MRSA)药物中的应用。
背景技术
巴戟天(Gynochthodes officinalis)为茜草科巴戟天属植物，是多年生藤状灌木，全身药用，是临床上常用的降血压中药。另外巴戟天还能够治疗风湿痛、促进身体肾上腺皮质激素分泌、强筋健骨和温补肾阳和改善生殖系统、抗肿瘤、抗菌等功效。
植物内生真菌种类多，天然毒性低，解决了从珍稀植物资源中提取产品造成的资源短缺、生态破坏和物种灭绝的问题，大大缩短了栽培周期，其产生的生物活性物质在多方面发挥了作用。它在药物研发、环境废物降解、能源生产和农业病虫害控制等方面发挥着重要作用。在生物活性方面，显著而多样，如抗病毒、细胞毒、抗菌、酶抑制活性等。
近几年来，人们也尝试采用各种方法来寻找抗癌药物，但是化学合成的抗癌药多半也对人体正常细胞产生毒副作用，因此从天然动、植物中寻找毒性低、疗效高的抗癌活性成分仍是近年来国内、外科学工作者研究的热点之一。
近年来，随着人们生活水平的提高、饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏以及少动多坐的生活方式等诸多因素，全球糖尿病发病率增长迅速，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病，目前我国糖尿病患者人群居世界第二，对α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物的需求日益上升，因此，研发疗效好、副作用小、安全可靠的α-葡萄糖苷酶抑制剂药物迫在眉睫。
目前，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(以下简称“MRSA”)已和乙肝、艾滋病一起成为世界三大最难解决的感染性疾病。研发新型抗感染药物已成为医药领域迫在眉睫的共同使命, 目前最为广泛使用的万古霉素耐药性日益增强，医生被迫不断增加剂量，导致患者承受更大毒性，使用万古霉素的患者需要进行常规肾功能变化监测等诸多局限性，安全有效治疗 MRSA的临床需求尚未被满足，是一个具有潜在新药开发的领域。未来抗菌类药物最广阔的临床应用前景还是需要依靠天然低毒的天然产物及其衍生物，天然产物的抗菌药物未来可期。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供具有抗肿瘤活性的化合物5'-methoxy-integracinB、 integracin A、integracin B；提供具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物5'-methoxy-integracin A、integracin A、integracin B；提供具有抗Staphylococcus aureus、MRSA活性的化合物integracin B。
本发明的化合物5'-methoxy-integracins A-B、integracins A-B,其结构如式(I)所示：
本发明的第二个目的是提供一种化合物5'-methoxy-integracins A-B、integracins A-B的制备方法，该制备方法中所述的化合物5'-methoxy-integracins A-B、integracins A-B是从巴戟天植物内生真菌Cytospora rhizophorae A761的发酵培养物中分离制备得到的，具体包括以下步骤：
(1)制备巴戟天植物内生真菌Cytospora rhizophorae A761的固体发酵培养物，用甲醇萃取该固体发酵培养物，将甲醇萃取液经浓缩后得浸膏；
(2)浸膏经过硅胶柱层析，用正己烷-乙酸乙酯以体积比为100:1，50:1，30:1，20:1， 10:1，5:1，2:1，1:1，1:2，0:1和二氯甲烷-甲醇10:1，5:1，1:1v/v分别作为洗脱剂，梯度洗脱；收集正己烷-乙酸乙酯体积比5:1洗脱获得的且经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝2:1v/v展开得Rf＝0.3-0.5的组分Fr.D；收集正己烷-乙酸乙酯体积比2:1→1:1洗脱的且经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1v/v展开得Rf＝0.3-0.4的组分Fr.E；收集正己烷-乙酸乙酯体积比1:2洗脱的且经TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇＝20:1v/v展开得Rf＝0.3-0.6 的组分Fr.F；
将组分Fr.D在RP C18硅胶上进行柱层析，用甲醇：水(60％→100％v/v)梯度洗脱，得到11个亚组分(Fr.D-1-Fr.D-11)，收集甲醇：水100:0v/v洗脱的组分Fr.D-8，Fr.D-8 经过葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20在三氯甲烷：甲醇＝1:3v/v的洗脱体系下得到四个亚组分(Fr.D-8-1-Fr.D-8-4)，收集经葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20洗脱下来的中间部分Fr.D-8-3 经过TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇＝20:1v/v展开得Rf＝0.3-0.4，在254nm的紫外下有明显的紫外，经过香草醛显色主要成分为粉色的点，Fr.D-8-3再经正相柱色谱，用三氯甲烷：甲醇100:0→20:1v/v梯度洗脱，收集三氯甲烷：甲醇50:1v/v洗脱下来的部分，TLC 薄层层析以三氯甲烷：甲醇20:1展开得Rf＝0.3-0.4且在254nm的紫外下有很强的吸收，经过香草醛显色为粉色的化合物5'-methoxy-integracin A。
将组分Fr.E在RP C18硅胶上进行柱层析，用甲醇：水(50％→100％v/v)和甲醇：丙酮10:1→5:1v/v)梯度洗脱，得到6个亚组分(Fr.E-1-Fr.E-6)，收集甲醇：水100:0洗脱的组分Fr.E-5，Fr.E-5经Sephadex LH-20CC凝胶柱色谱以三氯甲烷-甲醇＝1:3v/v洗脱体系下得到经过TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇＝20:1v/v展开得Rf＝0.3-0.4，在254nm的紫外下有明显的紫外，经过香草醛显色主要成分为粉色的点integracin A，以及三个亚组分(Fr.E-5-1-Fr.E-5-3)，所述的Fr.E-5-1经过TLC薄层层析以正己烷-乙酸乙酯1:1v/v展开得Rf＝0.5-0.6，在254nm的紫外下有明显的紫外，Fr.E-5-1再经正相柱色谱，用正己烷- 乙酸乙酯10:1→2:1v/v梯度洗脱，得到三个亚组分，收集正己烷-乙酸乙酯3:1→2:1v/v洗脱下来TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯1:1展开得Rf＝0.5-0.7的部分Fr.E-5-1-1，Fr. E-5-1-1经过半制备HPLC(MeOH/H2O,100:0,v/v,3mL/min)进一步分离，得到含少量杂质的5'-methoxy-integracin B(17.5mg,tR＝7.0min)。含少量杂质的5'-methoxy-integracin B再经正相柱色谱(正己烷/乙酸乙酯，10:1→2:1,v/v)洗脱，收集正己烷：乙酸乙酯3:1v/v洗脱下来的部分经过TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1v/v展开得Rf＝0.5-0.7，在254nm的紫外下有明显的紫外，经过香草醛显色主要成分为粉色的点5'-methoxy-integracin B。
将组分Fr.F在RP C18硅胶上进行柱层析，用甲醇：水(50％→100％v/v)梯度洗脱，得到5个亚组分(Fr.F-1-Fr.F-5)，收集甲醇：水90:10→100:0v/v洗脱的组分Fr.F-4，Fr.F-4 经过葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20在三氯甲烷：甲醇＝1:3v/v的洗脱体系下得到6个亚组分(Fr.F-4-1-Fr.F-4-6)，收集经葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20洗脱下来的中间部分Fr.F-4-3 经过TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇＝20:1v/v展开得Rf＝0.2-0.4，在254nm的紫外下有明显的紫外，经过香草醛显色主要成分为粉色的点，Fr.F-4-3再经正相柱色谱，用正己烷：乙酸乙酯5:1→1:1v/v梯度洗脱，收集正己烷：乙酸乙酯1:1v/v洗脱下来的部分，TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇20:1展开得Rf＝0.2-0.4且在254nm的紫外下有很强的吸收，经过香草醛显色为粉色的化合物integracin B。
所述的步骤(1)制备巴戟天植物内生真菌Cytospora rhizophorae A761的固体发酵培养物具体步骤为：挑取内生真菌Cytospora rhizophorae A761的菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后将种子液按0.1mL/g 的接种量接种于大米培养基中，28℃条件下培养30天，制得A761的固体发酵培养物，所述的马铃薯葡萄糖液体培养基，每升是通过以下方法配制的：用300mL的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4 1.5g、维生素B1 10mg，加水补足至1000mL，灭菌制得；所述的大米培养基是通过以下方法配制的：按每250g大米与350mL的水溶液混合灭菌制得。
本发明的第三个目的是提供化合物5'-methoxy-integracin B、integracin A、integracin B，或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的抗肿瘤药物优选为抗肝癌、乳腺癌、神经胶质瘤或非小细胞肺癌药物，阿霉素为阳性对照；提供化合物5'-methoxy-integracin A、 integracin A、integracin B或其药用盐在制备α-葡萄糖苷酶抑制药物中的应用，以阿卡波糖为阳性对照，测定化合物5'-methoxy-integracin A、integracin A、integracin B对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，所有测定均采用PNNG法，重复3次；提供化合物integracin B或其药用盐在制备抗菌药物中的应用，采用万古霉素为阳性对照，对金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(JCSC 3063)进行体外抑菌活性评价指标，以刃天青为可见指标，进行MIC测定。
本发明1采用SRB法(Skehan P,Storeng R,Dominic S.New colorimetriccytotoxicity assay for anticancer-drug screening[J].J Natl Cance Inst,1990,82:1107–1112.)测试化合物 5'-methoxy-integracin B、integracin A、integracin B的抗肿瘤活性。通过实验发现，化合物5'-methoxy-integracin B、integracin A、integracinB对神经胶质瘤细胞SF-268、乳腺癌细胞 MCF-7、肝癌细胞HepG-2、和肺癌细胞A549的IC50值范围为8.3～32.6μM。阳性对照阿霉素对以上四种肿瘤细胞株的IC50值分别为0.6、1.1、0.9和1.4μM。此结果表明：本发明的化合物5'-methoxy-integracin B、integracin A、integracin B均具有比较显著的抗肿瘤活性。
本发明2通过实验发现，化合物5'-methoxy-integracin A、integracin A、integracin B对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的IC50值范围为3.5～4.8μM。阳性对照阿霉素IC50值为25.0μM。此结果表明：本发明的化合物5'-methoxy-integracin A、integracin A、integracin B均具有α- 葡萄糖苷酶的抑制活性。
本发明3通过实验发现，化合物integracin B对金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(JCSC 3063)的抑制活性的MIC值范围为6.25μg/mL。阳性对照万古霉素MIC值为1.25μg/mL。此结果表明：本发明的化合物integracin B具有显著的抗菌活性。
本发明的第四个目的是提供一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物包含化合物 5'-methoxy-integracin B、integracin A、integracin B中的至少一种，或其药用盐作为活性成分；提供一种α-葡萄糖苷酶抑制药物，该α-葡萄糖苷酶抑制药物包含化合物5'-methoxy-integracin A、integracin A、integracin B中的至少一种，或其药用盐作为活性成分；提供一种抗菌药物，该抗菌药物包含化合物integracin B，或其药用盐作为活性成分；。
本发明的第五个目的是提供巴戟天植物内生真菌Cytospora rhizophorae A761在制备化合物5'-methoxy-integracins A-B、integracins A-B中的应用。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
本发明从巴戟天植物内生真菌Cytospora rhizophorae A761中分离制备得到化合物 5'-methoxy-integracins A-B、integracins A-B，该类化合物5'-methoxy-integracins A-B、integracins A-B具有比较显著的抗肿瘤、抗菌、α-葡萄糖苷酶抑制活性，可以用于制备抗肿瘤、抗菌、α-葡萄糖苷酶抑制药物，为研究与开发新的抗肿瘤、抗菌、α-葡萄糖苷酶抑制药物提供了候选化合物，为开发利用植物内生真菌来源的天然活性物质提供了科学依据。
本发明的巴戟天植物内生真菌Cytospora rhizophorae A761公开于文献Liu,HX；Tan,HB；Liu,Y；Chen,YC；Li,SN；Sun,ZH；Li,HH；Qiu,SX；Zhang,WM，Three new highly-oxygenated metabolites from the endophytic fungus Cytospora rhizophorae A761，Ritoterapia,2017,117,1-5.该菌株本申请人持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。
附图说明
图1是化合物5'-methoxy-integracin A的1H NMR谱；
图2是化合物5'-methoxy-integracin A的13C NMR谱；
图3是化合物5'-methoxy-integracin A的1H-1H COSY谱；
图4是化合物5'-methoxy-integracin A的HSQC谱；
图5是化合物5'-methoxy-integracin A的HMBC谱；
图6是化合物5'-methoxy-integracin A的HR-ESIMS谱；
图7是化合物5'-methoxy-integracin A的CD谱；
图8是化合物5'-methoxy-integracin A的UV谱；
图9是化合物5'-methoxy-integracin A的IR谱。
图10是化合物5'-methoxy-integracin B的1H NMR谱；
图11是化合物5'-methoxy-integracin B的13C NMR谱；
图12是化合物5'-methoxy-integracin B的1H-1H COSY谱；
图13是化合物5'-methoxy-integracin B的HSQC谱；
图14是化合物5'-methoxy-integracin B的HMBC谱；
图15是化合物5'-methoxy-integracin B的HR-ESIMS谱；
图16是化合物5'-methoxy-integracin B的CD谱；
图17是化合物5'-methoxy-integracin B的UV谱；
图18是化合物5'-methoxy-integracin B的IR谱；
图19是化合物integracin A的1H NMR谱；
图20是化合物integracin A的13C NMR谱；
图21是化合物integracin B的1H NMR谱；
图22是化合物integracin B的13C NMR谱；
图23是化合物5'-methoxy-integracins A-B的1H-1H COSY和HMBC关键相关信号；
图24是化合物5'-methoxy-integracins A-B的实验和理论计算ECD数据。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、巴戟天植物内生真菌Cytospora rhizophorae A761的分离纯化和鉴定
本发明的巴戟天植物内生真菌Cytospora rhizophorae A761是2015年1月，从广东省肇庆市高要区采集的药用植物巴戟天中分离得到的，经ITS序列分析鉴定，经blast比对，同源分析，鉴定该菌株为Cytospora rhizophorae A761。公开于文献Liu,HX；Tan,HB；Liu,Y； Chen,YC；Li,SN；Sun,ZH；Li,HH；Qiu,SX；Zhang,WM，Three new highly-oxygenatedmetabolites from the endophytic fungus Cytospora rhizophorae A761，Fitoterapia,2017,117,1-5.
2、Cytospora rhizophorae A761的固体发酵
将活化的巴戟天植物内生真菌Cytospora rhizophorae A761菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基(每升培养基是通过以下方法配制的：用300mL的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4 1.5g、维生素B1 10mg，加水补足至1000mL，灭菌制得)中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后将种子液按0.1mL/g大米培养基的接种量接种于大米培养基(该培养基是通过以下方法配制的：将250g大米与350mL的水溶液混合，121℃高压灭菌20min，冷却，制得)中，28℃条件下培养30天，制得A761的固体发酵培养物。
3、化合物5'-methoxy-integracins A-B、integracins A-B的制备
(1)制备巴戟天植物内生真菌Cytospora rhizophorae A761的固体发酵培养物，用甲醇萃取该固体发酵培养物，将甲醇萃取液经浓缩后得浸膏；
(2)浸膏经过硅胶柱层析，用正己烷-乙酸乙酯以体积比为100:1，50:1，30:1，20:1， 10:1，5:1，2:1，1:1，1:2，0:1和二氯甲烷-甲醇10:1，5:1，1:1v/v分别作为洗脱剂，梯度洗脱；收集正己烷-乙酸乙酯体积比5:1洗脱获得的且经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝2:1v/v展开得Rf＝0.3-0.5的组分Fr.D；收集正己烷-乙酸乙酯体积比2:1→1:1洗脱的且经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1v/v展开得Rf＝0.3-0.4的组分Fr.E；收集正己烷-乙酸乙酯体积比1:2洗脱的且经TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇＝20:1v/v展开得Rf＝0.3-0.6 的组分Fr.F；
将组分Fr.D在RP C18硅胶上进行柱层析，用甲醇：水(60％→100％v/v)梯度洗脱，得到11个亚组分(Fr.D-1-Fr.D-11)，收集甲醇：水100:0v/v洗脱的组分Fr.D-8，Fr.D-8 经过葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20在三氯甲烷：甲醇＝1:3v/v的洗脱体系下得到四个亚组分(Fr.D-8-1-Fr.D-8-4)，收集经葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20洗脱下来的中间部分Fr.D-8-3 经过TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇＝20:1v/v展开得Rf＝0.3-0.4，在254nm的紫外下有明显的紫外，经过香草醛显色主要成分为粉色的点，Fr.D-8-3再经正相柱色谱，用三氯甲烷：甲醇100:0→20:1v/v梯度洗脱，收集三氯甲烷：甲醇50:1v/v洗脱下来的部分，TLC 薄层层析以三氯甲烷：甲醇20:1展开得Rf＝0.3-0.4且在254nm的紫外下有很强的吸收，经过香草醛显色为粉色的化合物5'-methoxy-integracin A。
将组分Fr.E在RP C18硅胶上进行柱层析，用甲醇：水(50％→100％v/v)和甲醇：丙酮10:1→5:1v/v)梯度洗脱，得到6个亚组分(Fr.E-1-Fr.E-6)，收集甲醇：水100:0洗脱的组分Fr.E-5，Fr.E-5经Sephadex LH-20CC凝胶柱色谱以三氯甲烷-甲醇＝1:3v/v洗脱体系下得到经过TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇＝20:1v/v展开得Rf＝0.3-0.4，在254nm的紫外下有明显的紫外，经过香草醛显色主要成分为粉色的点integracin A，以及三个亚组分(Fr.E-5-1-Fr.E-5-3)，Fr.E-5-1经过TLC薄层层析以正己烷-乙酸乙酯1:1v/v展开得Rf＝0.5-0.6，在254nm的紫外下有明显的紫外，Fr.E-5-1再经正相柱色谱，用正己烷-乙酸乙酯10:1→2:1v/v梯度洗脱，得到三个亚组分，收集正己烷-乙酸乙酯3:1→2:1v/v洗脱下来TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯1:1展开得Rf＝0.5-0.7的部分Fr.E-5-1-1，Fr.E-5-1-1经过半制备HPLC(MeOH/H2O,100:0,v/v,3mL/min)进一步分离，得到含少量杂质的 5'-methoxy-integracin B(17.5mg,tR＝7.0min)。含少量杂质的5'-methoxy-integracin B再经正相柱色谱(正己烷/乙酸乙酯，10:1→2:1,v/v)洗脱，收集正己烷：乙酸乙酯3:1v/v洗脱下来的部分经过TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1v/v展开得Rf＝0.5-0.7，在254nm的紫外下有明显的紫外，经过香草醛显色主要成分为粉色的点5'-methoxy-integracin B。
将组分Fr.F在RP C18硅胶上进行柱层析，用甲醇：水(50％→100％v/v)梯度洗脱，得到5个亚组分(Fr.F-1-Fr.F-5)，收集甲醇：水90:10→100:0v/v洗脱的组分Fr.F-4，Fr.F-4 经过葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20在三氯甲烷：甲醇＝1:3v/v的洗脱体系下得到6个亚组分(Fr.F-4-1-Fr.F-4-6)，收集经葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20洗脱下来的中间部分Fr.F-4-3 经过TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇＝20:1v/v展开得Rf＝0.2-0.4，在254nm的紫外下有明显的紫外，经过香草醛显色主要成分为粉色的点，Fr.F-4-3再经正相柱色谱，用正己烷：乙酸乙酯5:1→1:1v/v梯度洗脱，收集正己烷：乙酸乙酯1:1v/v洗脱下来的部分，TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇20:1展开得Rf＝0.2-0.4且在254nm的紫外下有很强的吸收，经过香草醛显色为粉色的化合物integracin B。
4、化合物5'-methoxy-integracins A-B、integracins A-B的结构鉴定
1H-NMR、13C-NMR、HMBC核磁共振谱图用Bruker Advance-500核磁共振光谱仪测定，以四甲基硅烷(TMS)为内标；ESI-MS数据用VG Autospec-3000型质谱仪测定；紫外光谱用岛津UV-2600分光光度计测定，其结构鉴定如下：
如图1-24所示，图1是化合物5'-methoxy-integracin A的1H NMR谱；图2是化合物5'-methoxy-integracin A的13C NMR谱；图3是化合物5'-methoxy-integracin A的1H-1HCOSY 谱；图4是化合物5'-methoxy-integracin A的HSQC谱；图5是化合物5'-methoxy-integracin A的HMBC谱；图6是化合物5'-methoxy-integracin A的HR-ESIMS谱；图7是化合物 5'-methoxy-integracin A的CD谱；图8是化合物5'-methoxy-integracin A的UV谱；图9是化合物5'-methoxy-integracin A的IR谱。图10是化合物5'-methoxy-integracin B的1HNMR 谱；图11是化合物5'-methoxy-integracin B的13C NMR谱；图12是化合物 5'-methoxy-integracin B的1H-1H COSY谱；图13是化合物5'-methoxy-integracin B的HSQC 谱；图14是化合物5'-methoxy-integracin B的HMBC谱；图15是化合物5'-methoxy-integracin B的HR-ESIMS谱；图16是化合物5'-methoxy-integracin B的CD谱；图17是化合物5'-methoxy-integracin B的UV谱；图18是化合物5'-methoxy-integracin B的IR谱；图19是化合物integracin A的1H NMR谱；图20是化合物integracin A的13C NMR谱；图21是化合物integracin B的1H NMR谱；图22是化合物integracin B的13C NMR谱；图23是化合物5'-methoxy-integracins A-B的1H-1H COSY和HMBC关键相关信号；图24是化合物 5'-methoxy-integracins A-B的实验和理论计算ECD数据。
化合物5'-methoxy-integracin A为棕色油状(其核磁数据如表1所示)；根据HRESIMS m/z 643.4201[M+H]+(计算值643.4210)，确定化合物的分子式为C38H58O8，不饱和度为10，1H-NMR谱显示存在三取代苯酚环的特征信号在δH 6.23(2H,d,J＝2.4Hz,H-1,5)和6.21(1 H d J＝2.4Hz,H-3)，四取代苯酚环的特征信号δH 6.36(1H,d,J＝2.5Hz,H-4')和6.31(1H, d,J＝2.5Hz,H-6')，两个含氧次甲基δH 5.27(1H,m,H-14)和4.92(1H,m,H-15')，两个甲基δH 0.92(3H,t,J＝7.5Hz,H-17)和0.95(3H,t,J＝7.5Hz,H-18')以及δH 1.31-2.93之间的一系列重叠亚甲基信号。13C NMR(表1)数据结合HSQC谱显示了38个碳信号，包括两个羧基官能团的信号在δC 171.5(C-1')和171.8(C-19')。
通过对化合物5'-methoxy-integracin A的1H-1H COSY和HMBC相关关系的分析，确定了化合物5'-methoxy-integracin A的平面结构。从H-3到C-1、C-5,H-1,5到C-3的HMBC相关关系揭示了一个对称的三取代苯环的存在。从H-1,5到C-7，以及1H-1H COSY片段 H-7/H-8/H-9的关键HMBC相关分析表明，该苯环与烷基链相连，上述信息表明，化合物 5'-methoxy-integracin A是烷基间苯二酚衍生物。类似地，另一个烷基间苯二酚片段B通过H-4'到C-2'和C-6'，H-6'到C-2'和C-4'，H-8'到C-2'和C-6'的HMBC相关性以及1H-1H COSY片段H-8'/H-9'/H-10'得到确认。从H3-21′到C-5′，从H-15′到C-19′的关键HMBC相关性验证了连接到片段B的额外的甲氧基和乙酰基官能团。
从H-14到C-1′的关键HMBC相关性明确地证实了片段A-B通过酯键连接，如图23所示，然后，化合物5'-methoxy-integracin A被完全指定为二聚烷基间苯二酚衍生物。将这一新化合物与共分离的已知二聚烷基间苯二酚integracin A进行比较，主要区别在于化合物 5'-methoxy-integracin A中C-5'处多了一个甲氧基。此外，根据化合物5'-methoxy-integracin A与化合物integracin A的相同的生源途径和核磁共振数据相近的化学考虑，确定化合物 5'-methoxy-integracin A与化合物integracin A的相对构型相同。通过ECD计算成功确定了化合物5'-methoxy-integracin A的最终绝对构型，结果如图24所示。这些结果有力地说明化合物1的绝对结构为14R,15'R。因此，化合物5'-methoxy-integracin A的结构被完全确定。
化合物5'-methoxy-integracin B为棕色油状(其核磁数据如表1所示)；根据HRESIMS m/z 601.4116[M+H]+(计算值601.4104)，确定化合物的分子式为C36H56O7，不饱和度为9；仔细分析化合物5'-methoxy-integracin B的核磁共振谱可以发现，化合物 5'-methoxy-integracin B具有与化合物5'-methoxy-integracin A几乎相同的一维和二维核磁共振信号。化合物5'-methoxy-integracin A和5'-methoxy-integracin B的区别在于5'-methoxy-integracin B中C-15'处缺少一个乙酰基。这一推论的结论被其核磁共振谱和分子式中乙酰基的缺失信号进一步证实。此外，5'-methoxy-integracin B的相对构型也被认为与化合物integracin B共享相同的二聚ARs骨架。通过ECD计算，明确了5'-methoxy-integracin B的绝对构型。如图24所示，计算得到的ECD曲线在218和240nm处表现出明显的Cotton 效应，与实验ECD光谱的结果完美匹配。因此，最终确定5'-methoxy-integracin B的绝对结构为14R,15'R。总的来说，最终完整结构被建立起来，并被命名为5'-methoxy-integracin B。
表1化合物5'-methoxy-integracins A和B的核磁数据(500MHz/125MHz,δin ppm,J in Hz)
aChemical shifts could be interchanged
经过上述方法分离的目标化合物5'-methoxy-integracins A-B、integracins A-B的结构式如式(I)所示：
实施例2
抗肿瘤活性测定：
采用SRB法测试化合物5'-methoxy-integracin B、integracin A、integracin B的抗肿瘤活性。
1、试验用试剂：将本发明制备的化合物5'-methoxy-integracin B、integracinA、integracin B用二甲基亚砜(DMSO)溶解得浓度为10mg/mL的母液，再用RPMI-1640培养基稀释至所需浓度。阳性对照为阿霉素。
本实验所用肿瘤细胞株为肝癌细胞HepG-2、乳腺癌细胞MCF-7、神经胶质瘤细胞SF-268和肺癌细胞A549。
2、实验方法：取对数生长期的HepG-2、MCF-7、SF-268和A549细胞，用胰酶消化，台盼蓝染色计数，台盼蓝排斥实验检测细胞活力大于95％后，用新鲜RPMI-1640培养基调整细胞浓度为3×104个/mL，挑取适宜的细胞接种于96孔板，每孔加入180μL的细胞悬液，同时设立3个空白孔作为对照调零，于37℃、5％CO2培养箱培养24h。待细胞贴壁后，每孔加入 20μL一定浓度的上述化合物5'-methoxy-integracin B、integracin A、integracin B的溶液，阴性对照加20μL RPMI-1640培养基，以阿霉素作为阳性对照，三个重复。置于37℃、5％CO2培养箱中培养72h后，加入50μL体积分数为50％的冷三氯醋酸水溶液固定细胞，4℃放置1 h后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由体积分数1％冰醋酸水溶液配制的磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)4mg/mL溶液100μL/孔，室温中染色30min，去上清，用1％冰醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入200μL/孔，浓度为10mmol/mL的Tris溶液，用酶标仪测定570nm处的吸光值(A)，用以下公式计算药物对细胞生长的抑制率：细胞生长抑制率(％)＝(1-A样品组/A对照组)×100％。
3、实验结果：本发明制备的化合物5'-methoxy-integracin B、integracin A、integracin B 对四株肿瘤细胞的细胞毒性如表2所示。此结果表明：本发明的化合物5'-methoxy-integracin B、integracin A、integracin B具有比较显著的抗肿瘤活性，因此，本发明为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，为开发利用植物内生真菌的天然活性物质提供了科学依据。
表2化合物5'-methoxy-integracin B、integracin A、integracin B对癌细胞的抑制效果
α-葡萄糖苷酶抑制活性测定：
以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物测定化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，用pH 7.0的0.1mol/L含0.2％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)将α-葡萄糖苷酶冻干粉配制成0.2μ/mL的酶液，-20℃冷冻保存；用pH 7.0的0.1mol/L的PBS溶液，将PNPG配制成10mmol/L的底物溶液；将5'-methoxy-integracin A、integracin A、integracin B用DMSO 配制成10mg/mL的储存液，用PBS稀释成所需浓度的工作液。取10μL样品溶液、20μL 0.2 μ/mL的α-葡萄糖苷酶溶液、50μL pH 7.0的0.1mol/L的PBS溶液，混匀，37℃孵育10min，然后加入20μL10mmol/L的PNPG溶液，37℃反应15min，再加入3％SDS终止反应，于 405nm处测定吸光度值(A)。以上反应在96孔板上完成，每个样品重复3次，阿卡波糖作为阳性对照，同时设置样品背景组、阴性对照组和空白对照组，采用以下公式计算药物对α- 葡萄糖苷酶的抑制率：抑制率(％)＝(1-A样品组-A样品背景)/(A阴性对照-A空白对照)×100％，最终结果如表3所示。
表3化合物5'-methoxy-integracin A、integracin A、integracin B对α-葡萄糖苷酶的抑制效果
aValues are expressed as the mean±SD.
抗菌活性测定：
我们对上述所有化合物进行了抗菌活性评价，主要针对金黄色葡萄球菌(CMCC26003)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(JCSC 3063)进行抗菌活性评估。根据CLSI标准化指南，通过Mueller-Hinton肉汤培养基(MHB)中的微生物2倍稀释法用刃天青显色法来显示测量化合物的最低抑菌浓度值(MIC)。
用DMSO试剂溶解化合物integracin B后配置成浓度为1mg/mL的待测溶液。用无菌水配置浓度为1mg/mL的万古霉素作为阳性对照组。从冰箱中取出需要测试的金黄色葡萄球菌以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的菌种活化，然后接种到液体培养基中，放置于设定好温度为28℃的摇床进一步培养。用紫外分光光度计测量菌液的OD值(当OD600＝0.07时，菌液的浓度为1.25×106CFU/mL时)即对数生长期方可进行抗菌实验。在96孔板第一排加入含有刃天青指示剂的肉汤培养基180μL，之后的2-7排加入含有刃天青指示剂的肉汤培养基100μL，在第一排中分别加入对照的1mg/mL的万古霉素以及1mg/mL的化合物 integracin B，然后对第一排进行二倍稀释至最后一孔时，吸取100μL弃去。最后将96孔板放入28℃恒温的培养箱中培养，观察并记录96孔板中菌液变色情况，实验结果如表4所示。
表4化合物integracin B对MRSA和S.aureus的抑制效果
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出诸多改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.如式（I）所示的任一化合物：
式（I）。
2.一种化合物5'-methoxy-integracins A-B、integracins A-B的制备方法，其特征在于，是从真菌Cytospora rhizophorae A761的发酵培养物中分离得到的，包括以下步骤：
（1）制备真菌Cytospora rhizophorae A761的固体发酵培养物，用甲醇萃取该固体发酵培养物，将甲醇萃取液经浓缩后得浸膏；
（2）浸膏经过硅胶柱层析，用正己烷-乙酸乙酯以体积比为100:1，50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:2，0:1和二氯甲烷-甲醇10:1，5:1，1:1 v/v分别作为洗脱剂，梯度洗脱；收集正己烷-乙酸乙酯体积比5:1洗脱获得的且经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯=2:1 v/v展开得Rf = 0.3-0.5的组分Fr. D；收集正己烷-乙酸乙酯体积比2:1→1:1洗脱的且经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯=1:1 v/v展开得Rf = 0.3-0.4的组分Fr. E；收集正己烷-乙酸乙酯体积比1:2洗脱的且经TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇=20:1 v/v展开得Rf = 0.3-0.6的组分Fr. F；
将组分Fr. D在RP C18硅胶上进行柱层析，用甲醇：水（60%→100% v/v）梯度洗脱，收集甲醇：水100: 0 v/v洗脱的组分Fr. D-8，Fr. D-8经过葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20在三氯甲烷：甲醇=1:3 v/v的洗脱体系下洗脱，收集经葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20洗脱下来的中间部分Fr. D-8-3，Fr. D-8-3是经过TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇=20:1 v/v展开得Rf = 0.3-0.4，在254nm的紫外下有明显的紫外，经过香草醛显色主要成分为粉色的点，Fr.D-8-3再经正相柱色谱，用三氯甲烷：甲醇100:0→20:1 v/v梯度洗脱，收集三氯甲烷：甲醇50:1 v/v洗脱下来的部分，TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇20:1展开得Rf = 0.3-0.4且在254nm的紫外下有很强的吸收，经过香草醛显色为粉色的化合物5'-methoxy-integracinA；
将组分Fr. E在RP C18硅胶上进行柱层析，用甲醇：水（50%→100% v/v）和甲醇：丙酮10:1→5:1 v/v）梯度洗脱，收集甲醇：水100: 0洗脱的组分Fr. E-5，Fr. E-5经Sephadex LH-20 CC凝胶柱色谱以三氯甲烷-甲醇=1:3 v/v洗脱体系下得到经过TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇=20:1 v/v展开得Rf = 0.3-0.4，在254nm的紫外下有明显的紫外，经过香草醛显色主要成分为粉色的点integracin A，以及亚组分Fr. E-5-1，所述的Fr. E-5-1经过TLC薄层层析以正己烷-乙酸乙酯1:1v/v展开得Rf = 0.5-0.6，在254nm的紫外下有明显的紫外，Fr.E-5-1再经正相柱色谱，用正己烷-乙酸乙酯10:1→2:1 v/v梯度洗脱，收集正己烷-乙酸乙酯3:1→2:1 v/v洗脱下来TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯1:1展开得Rf = 0.5-0.7的部分Fr. E-5-1-1，Fr. E-5-1-1经过半制备HPLC (MeOH/H2O, 100:0, v/v, 3 mL/min) 进一步分离，得到含少量杂质的5'-methoxy-integracin B，含少量杂质的5'-methoxy-integracin B再经正相柱色谱，以正己烷/乙酸乙酯，10:1→2:1,v/v梯度洗脱，收集正己烷：乙酸乙酯3:1 v/v洗脱下来的部分经过TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯=1:1 v/v展开得Rf = 0.5-0.7，在254nm的紫外下有明显的紫外，经过香草醛显色主要成分为粉色的点5'-methoxy-integracin B；
将组分Fr. F在RP C18硅胶上进行柱层析，用甲醇：水（50%→100% v/v）梯度洗脱，收集甲醇：水90:10→ 100:0 v/v洗脱的组分Fr.F-4，Fr.F-4经过葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20在三氯甲烷：甲醇=1:3 v/v的洗脱，收集经葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20洗脱下来的中间部分Fr. F-4-3经过TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇=20:1 v/v展开得Rf = 0.2-0.4，在254nm的紫外下有明显的紫外，经过香草醛显色主要成分为粉色的点，Fr. F-4-3再经正相柱色谱，用正己烷：乙酸乙酯5:1→1:1 v/v梯度洗脱，收集正己烷：乙酸乙酯1:1 v/v洗脱下来的部分，TLC薄层层析以三氯甲烷：甲醇20:1展开得Rf = 0.2-0.4且在254nm的紫外下有很强的吸收，经过香草醛显色为粉色的化合物integracin B；
所述的步骤（1）制备巴戟天植物内生真菌Cytospora rhizophorae A761的固体发酵培养物具体步骤为：挑取内生真菌C. rhizophorae A761的菌丝体接种于马铃薯葡萄糖固体培养基的平板上，在28 oC的培养箱里培养4-5天，之后从长满菌丝体的平板上挑取其接种于装有马铃薯葡萄糖液体培养基的锥形瓶中，在28 oC、120 r/min的条件下培养5天，制得种子液，然后将种子液按0.1 mL/g的接种量接种于大米培养基中，28 oC条件下培养30天，制得固体发酵培养物，所述的马铃薯葡萄糖液体培养基，每升是通过以下方法配制的：用300 mL的纯水煮200 g的马铃薯，煮沸20 min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 10 mg，加水补足至1000 mL，灭菌制得；所述的大米培养基是通过以下方法配制的：按每250 g大米与350 mL的水溶液混合灭菌制得；
所述的化合物5'-methoxy-integracins A-B、integracins A-B的结构式如下所示：
3.化合物5'-methoxy-integracin A、integracin A、integracin B或其药用盐在制备α-葡萄糖苷酶抑制药物中的应用；
所述的化合物5'-methoxy-integracin A、integracin A、integracin B的结构式如下所示：
4.化合物integracin B或其药用盐在制备抗Staphylococcus aureus、methicillin-resistant Staphylococcus aureus药物中的应用；
所述的化合物integracin B的结构式如下所示：
5.巴戟天植物内生真菌Cytospora rhizophorae A761在制备化合物5'-methoxy-integracin A、5'-methoxy-integracin B、integracin A、integracin B中的应用；
所述的化合物5'-methoxy-integracin A、5'-methoxy-integracin B、integracin A、integracin B的结构式如下所示：
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211267802.XA Active CN115650854B (zh) | 2022-10-17 | 2022-10-17 | 整合素衍生物及其制备方法和在α-葡萄糖苷酶抑制药物等方面的应用 |
Country Status (1)
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| CN (1) | CN115650854B (zh) |
-
2022
- 2022-10-17 CN CN202211267802.XA patent/CN115650854B/zh active Active
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| Publication number | Publication date |
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| CN115650854A (zh) | 2023-01-31 |
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