CN111559999B

CN111559999B - 一种内酯类化合物及其提取方法和应用

Info

Publication number: CN111559999B
Application number: CN202010148042.5A
Authority: CN
Inventors: 杨秀芳; 惠昱昱; 王宁宁; 马养民; 汪小钢; 姬海刚
Original assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Current assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Priority date: 2020-03-05
Filing date: 2020-03-05
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2040-03-05
Also published as: CN111559999A

Abstract

本发明公开了一种内酯类化合物及其提取方法和应用，将猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物用石油醚/乙酸乙酯/甲醇浸提，合并提取液并过滤，回收混合溶剂，减压浓缩，得到粗品浸膏；将粗品浸膏在硅胶色谱柱上，用不同体积梯度的石油醚/乙酸乙酯/甲醇洗脱剂进行洗脱，得到A‑D四个组分；将B组分浸膏在硅胶色谱柱上，用不同体积梯度的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，得到B1‑B6六个组分，B4组分继续在硅胶色谱柱上，用不同体积梯度的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，得到B4.1‑B4.13十三个组分，B4.10组分用羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱分离，得到内酯类化合物。本发明从猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物中分离得到内酯类化合物，且该化合物有良好的抑菌活性和抗肿瘤活性。

Description

一种内酯类化合物及其提取方法和应用

技术领域

本发明涉及内酯类化合物制备领域，具体涉及一种内酯类化合物及其提取方法和应用。

背景技术

猫儿屎(Decaisnea insignis(Griff.)Hook.f.&Thomson)又叫猫儿瓜(秦岭)、矮杞树等，系木通科(Lardiya balaeeae)猫儿屎属植物。丛生落叶直立灌木，广泛分布于我国西南部和中部地区。木通科植物猫儿屎是我国传统的民间中草药，味辛、甘、性平，根及果实甘、凉具有清肺止咳，祛风除湿，治疗风湿关节痛等功效。迄今为止，对猫儿屎的研究主要集中在它的植物化学成分，而对其内生真菌的研究相对较少。内生真菌指在其生长过程中至少有一个阶段生活在植物体内，但却不会对植物组织造成显著不良影响的真菌。据报道，内生真菌次生代谢产物种类主要有：生物碱、萜类、甾体、有机酸类等化合物，均具有一定的生物活性。然而未见猫儿屎内生真菌中有关内酯类化合物的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种内酯类化合物及其提取方法和应用，以克服上述现有技术存在的缺陷，本发明从猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物中分离得到结构新颖的内酯类化合物，且该内酯类化合物有较好的抑菌活性和对人体癌细胞表现出优良的抑制活性。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种内酯类化合物，所述内酯类化合物的化学结构式为：

一种内酯类化合物的提取方法，包括以下步骤：

(1)以猫儿屎内生真菌DS37固体发酵物为原料用石油醚、乙酸乙酯和甲醇浸提若干次，合并提取液并过滤，回收混合溶剂，滤液减压浓缩，得到粗品浸膏，所述猫儿屎内生真菌DS37固体发酵物与粗品浸膏的质量比为 92:15；

(2)将步骤(1)得到的粗品浸膏在硅胶色谱柱上，分别用体积梯度为 1:0:0,0:1:0,0:1:1,0:0:1的石油醚/乙酸乙酯/甲醇洗脱剂进行洗脱，得到A-D 四个组分，所述粗品浸膏与A-D四个组分之间的质量比为150:11:42:70:10；

(3)将步骤(2)得到的B组分在硅胶色谱柱上，分别用体积梯度为100:0, 100:20,100:50,100:100,100:200,0:100的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，得到B1-B6六个组分，B4组分继续在硅胶色谱柱上，用体积梯度为100:20, 100:50,100:80,100:100,100:120,100:150,100:180,100:190,100:195,100:200, 100:250,100:300,0:100的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，得到B4.1-B4.13 十三个组分，将B4.10组分用羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱分离得到内酯类化合物，所述B组分和B4组分之间的质量比为21:1，B4组分和B4.10组分之间的质量比为50:3，B4.10组分和内酯类化合物之间的质量比为1000:11。

进一步地，所述的石油醚、乙酸乙酯和甲醇均为工业用标准。

进一步地，步骤(1)中将猫儿屎内生真菌DS37固体发酵后的阴干产物用石油醚/乙酸乙酯/甲醇浸提8次。

上述内酯类化合物在制备抑菌药物上的应用。

进一步地，所述抑菌指对细菌或真菌的抑制作用。

进一步地，所述抑菌指对烟草赤星病菌的抑制作用。

上述内酯类化合物在制备抗肿瘤药物上的应用。

进一步地，所述抗肿瘤指对人肺癌细胞、人前列腺癌细胞、人乳腺癌细胞和人肝癌细胞的体外作用。

进一步地，所述抗肿瘤指对A549，MCF-7和HepG2细胞株的体外作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明的猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物—内酯类化合物是一种结构新颖的双香豆素化合物，其分子式为C₂₄H₂₂O₈，另外本发明通过对猫儿屎内生真菌DS37固体发酵后的阴干次生代谢产物进行提取，得到此内酯类化合物，通过对本发明内酯类化合物的抑菌活性测试，发现该化合物有较好的抗细菌和真菌活性，尤其对烟草赤星病菌有很好的抑菌活性，为猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物的抑菌活性成分，因此，可以用于农业防治和药剂防治技术。另外，通过对本发明内酯类化合物的体外抗肿瘤活性测试，发现该化合物有较好的抗肿瘤活性，尤其对A549、MCF-7和HepG2细胞株有很好的细胞毒活性，为猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物的抗肿瘤活性成分，因此，可以为抗肿瘤药物的开发提供一种可能。

附图说明

图1为本发明内酯类化合物的¹H-NMR谱；

图2为本发明内酯类化合物的¹³C-NMR谱；

图3为本发明内酯类化合物的DEPT(135°)谱；

图4为本发明内酯类化合物的COSY谱；

图5为本发明内酯类化合物的NOESY谱；

图6为本发明内酯类化合物的HSQC谱；

图7为本发明内酯类化合物的HMBC谱；

图8为本发明内酯类化合物的HR-ESI-M谱；

图9为本发明内酯类化合物的结构片段，即苯并吡喃酮结构片段；

图10为本发明内酯类化合物的结构图。

保藏说明

本发明对从猫儿屎植物茎部分离得到的一株内生真菌塔宾曲霉DS37进行了下述保藏：

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏单位地址：中国，武汉；保藏日期：2018年3月22日；保藏编号：CCTCC NO：M2018147，分类命名：塔宾曲霉DS37(Aspergillus tubingensis DS37)。

具体实施方式

下面对本发明的实施方式做进一步详细描述：

一种内酯类化合物，该化合物的化学结构式：

该化合物的提取方法如下：

(1)以猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物(9.2kg)为原料用石油醚/ 乙酸乙酯/甲醇浸提8次，合并提取液并过滤，回收混合溶剂，减压浓缩，得到粗品浸膏1500g；

(2)将步骤(1)得到的粗品浸膏在硅胶色谱柱上，分别用体积梯度为 1:0:0,0:1:0,0:1:1,0:0:1的石油醚/乙酸乙酯/甲醇洗脱剂进行洗脱，得到A (110g)，B(420g)，C(700g)，D(100g)四个组分；

(3)对步骤(2)的B组分(420g)浸膏，在硅胶色谱柱上，用不同梯度的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂(1:0,5:1,2:1,1:1,1:2,0:1,v/v)进行洗脱，得到 B1-B6六个组分，B4组分(20g)继续在硅胶色谱柱上，用不同梯度的石油醚/乙酸乙酯(100:20,100:50,100:80,100:100,100:120,100:150,100:180, 100:190,100:195,100:200,100:250,100:300,0:100，v/v)洗脱剂进行洗脱，得到B4.1-B4.13十三个组分，将B4.10组分(1.2g)用羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱分离，得到纯净的内酯类化合物(13.2mg)。

其中，硅胶柱色谱分离时按1:1拌样上柱，计算出柱体积，洗脱剂的用量为柱体积的5-7倍。

本发明制备的猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物—内酯类化合物是一种结构新颖的双香豆素类化合物，目前从猫儿屎植物的内生真菌中还未见分离到该类化合物的报道，也未见从其他植物及内生真菌中分离得到此化合物报道，更未见有人工合成此化合物的方法。本发明对猫儿屎内生真菌DS37 固体发酵后的阴干产物采用硅胶柱层析和羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱分离的方法分离鉴定了一个结构新颖的内酯类化合物，该化合物为首次报道。

本发明的新化合物猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物—内酯类化合物为无色片状晶体，HR-ESI-MS在m/z 461.1204处给出[M+Na]⁺峰，推算其分子式为C₂₄H₂₂O₈，¹H和¹³C核磁共振数据如表1所示。

表1内酯类化合物的¹H和¹³C核磁数据

通过对本发明化合物的抑菌活性测试，发现该化合物有较好的抗菌活性，尤其对烟草赤星病菌显示良好的抑菌活性，为猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物的抑菌活性成分，因此，可以用于农业防治和药剂防治技术。

通过对该内酯类化合物的体外抗肿瘤活性测试，发现该化合物有较好的抗肿瘤活性，尤其对A549，MCF-7和HepG2细胞株的活性，为猫儿屎内生真菌DS37次生代谢产物的抗肿瘤成分，因此，可以为抗肿瘤药物的开发提供一种可能。

如图1-8所示，由本发明内酯类化合物的¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、2D NMR(COSY、NOESY、HSQC、HMBC)谱，以及HR-ESI-M谱得知该化合物结构。具体地说：

¹H-NMR(400HZ，CDCl₃)谱中，δ_H6.72(s，1H)和δ_H5.51(s，1H)提示结构中存在两个苯环上的氢信号；δ_H3.93(s，3H)，δ_H3.80(s，3H)提示结构中存在有两个甲氧基的氢信号；δ_H2.71(s，3H)提示结构中存在有一个甲基的氢信号。

¹³C-NMR(100HZ，CDCl₃)谱和DEPT(135°)谱数据提示结构中存在一个羰基碳(δ_C162.63)，两个甲氧基碳，一个甲基碳，两个次甲基碳和六个季碳，共有12个碳信号。

HSQC谱给出结构中所有氢碳直接相连的信息，如表1所示。提示结构中δ_C 110.94、87.27、55.64和55.43、23.63的C原子分别与δ_H6.72(1H，s)、 5.51(1H，s)、3.93(3H，s)、3.80(3H，s)、2.71(3H，s)处的H相连；

HMBC谱，给出结构中所有氢碳直接相连的信息，如表1所示。H-4和 C-3，C-10；H-6和C-7，C-8；H-5(-CH₃)和C-6，C-10之间相关；提示结构中存在一个苯并吡喃酮结构片段。δ_H3.93(s，3H)和δ_H3.80(s，3H)处的信号归属于两个甲氧基，δ_H2.71(s，3H)的信号归属于甲基；这三个甲基分别连接于C-3和C-7，C-5；

NOESY谱，证实了H-5(-CH₃)和H-3(-OCH₃)，H-6、H-7(-OCH₃) 的相关性。HMBC谱证实了H-3(-OCH₃)，H-5(-CH₃)、H-7(-OCH₃)与 C-3，C-5、C-7的相关性。

利用相对分子量和¹³C-NMR数据，可以确定苯环上C-8的化学位移 (δ_C107.98)，提示该化合物为对称结构。最终确定了化合物的结构，该化合物为未见文献报道的新内酯类化合物，相关NMR数据归属如表1所示。

内酯类化合物的抗细菌活性实验：

1、实验材料

1.1、受试样品

内酯类化合物用DMSO溶解，配成500μg/mL的溶液。

1.2、菌株

两株革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌)、两株革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、乳酸链球菌)。

1.3、培养基

牛肉膏3.0g/L、NaCl 5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、pH 7.0-7.5。

1.4、其他材料

96孔板。

2、实验方法

96孔板每孔加入100μL上述培养基，100μL浓度为1×10⁶CFU/mL的细胞悬液，第一孔中加500μg/mL的样品溶液，利用二倍稀释法使样品浓度从第一孔到第十孔依次为500，250，125，62.5，31.2，15.6，7.81，3.91， 1.95和0.975μg/mL，第十一孔和第十二孔分别加入100μL上述培养基和 DMSO作为对照。选用硫酸链霉素作为革兰氏阴性菌的阳性对照，青霉素钠作为革兰氏阳性菌的阳性对照。上述每组进行3次平行实验，将96孔板置于37℃培养箱内孵育24小时。

3、实验结果

结果见表2，结果显示，内酯类化合物对绿脓杆菌表现出一定的抑制活性，其中MIC(最小抑菌浓度)为16μg/mL。

内酯类化合物的抗真菌活性实验：

1、实验材料

1.1、受试样品

内酯类化合物用DMSO溶解，配成500μg/mL的溶液。

1.2、菌株

五株植物病原真菌(禾谷镰孢、烟草赤星病菌、油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌)。

1.3、培养基

200g马铃薯浸汁，葡萄糖20g、水1000mL。

1.4、其他材料

96孔板。

2、实验方法

96孔板每孔加入100μL上述培养基，100μL浓度为1×10⁶CFU/mL的细胞悬液，第一孔中加500μg/mL的样品溶液，利用二倍稀释法使样品浓度从第一孔到第十孔依次为500，250，125，62.5，31.2，15.6，7.81，3.91， 1.95和0.975μg/mL，第十一孔和第十二孔分别加入100μL上述培养基和 DMSO作为对照。选用多菌灵作为植物病原真菌的阳性对照。上述每组进行 3次平行实验，将96孔板置于28℃培养箱内孵育48小时。

3、实验结果

结果见表2，结果显示，内酯类化合物对油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌，番茄灰霉病菌有较好的抑制活性，MIC(最小抑菌浓度)为32μg/mL，对烟草赤星病菌(真菌)表现出更好的抑制活性，MIC(最小抑菌浓度)为16 μg/mL。

表2内酯类化合物的抑菌活性

其中：A:大肠杆菌；B:绿脓杆菌；C：金黄色葡萄球菌；D：乳酸链球菌；E：禾谷镰孢；F：烟草赤星病菌；G：油菜菌核病菌；H：番茄灰霉病菌；I：辣椒疫霉病菌；-：未设置实验。

内酯类化合物的抗肿瘤活性实验：

1、实验材料

1.1、受试样品

内酯类化合物用DMSO溶解，配成20mM的溶液。

1.2、肿瘤细胞

人肺癌细胞(A549)、人前列腺癌细胞(PC-3)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)。

1.3、其他材料

高糖DMEM培养液，胎牛血清，透明底96孔细胞培养板，无菌离心管，无菌移液管，无菌加样槽，无菌枪头，MTT，多道移液器，酶标仪。

2、实验方法

取处于对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化细胞，调整细胞悬液浓度为 5x10⁴/mL，加入96孔细胞培养板的中间6排，100μL/孔，第1排和第8排加培养液，100μL/孔。培养板放于37℃，5％CO₂的培养箱中过夜。次日配置样品，阳性对照为阿霉素，用无菌生理盐水溶解至300μM；样品以DMSO溶解至20mM。阿霉素以培养液稀释至9μM，再依次做3倍稀释，6个浓度，即各浓度梯度分别为9,3,1,0.33,0.11,0μM。样品以培养液稀释至200μM，再依次做3倍稀释，6个浓度，即各浓度梯度分别为200,67,22,7.4,2.5,0μM。吸出培养液，每孔依次加入100μL不同浓度的样品。将培养板置于37℃， 5％CO₂培养箱中孵育48h后，吸去含样品的培养液，再加入MTT溶液 (0.5mg/mL)，100μL/孔。放入培养箱中继续培养4h，吸去含MTT的培养液，加入DMSO，100μL/孔，低速振荡10min后，用酶标仪在490nm波长处测定各孔的OD值。根据抑制率公式

评价化合物的体外抗肿瘤活性。

3、实验结果

结果见表3，结果显示，经对人肺癌细胞(A549)、人前列腺癌细胞(PC-3)、人乳腺癌细胞(MCF-7)和人肝癌细胞(HepG2)的细胞毒活性实验，得内酯类化合物对MCF-7和HepG2细胞株具有较好的细胞毒活性，IC₅₀值分别达到18.61μM和24.79μM，尤其是对A549 IC₅₀值达到8.30μM。

表3内酯类化合物的抗肿瘤活性

Claims

1.一种内酯类化合物的提取方法，其特征在于，所述内酯类化合物的化学结构式为：

所述提取方法包括以下步骤：

(1)以猫儿屎内生真菌DS37固体发酵物为原料用石油醚、乙酸乙酯和甲醇浸提若干次，合并提取液并过滤，回收混合溶剂，滤液减压浓缩，得到粗品浸膏，所述猫儿屎内生真菌DS37固体发酵物与粗品浸膏的质量比为92:15；

(2)将步骤(1)得到的粗品浸膏在硅胶色谱柱上，分别用体积梯度为1:0:0,0:1:0,0:1:1,0:0:1的石油醚/乙酸乙酯/甲醇洗脱剂进行洗脱，得到A-D四个组分，所述粗品浸膏与A-D四个组分之间的质量比为150:11:42:70:10；

(3)将步骤(2)得到的B组分在硅胶色谱柱上，分别用体积梯度为100:0,100:20,100:50,100:100,100:200,0:100的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，得到B1-B6六个组分，B4组分继续在硅胶色谱柱上，用体积梯度为100:20,100:50,100:80,100:100,100:120,100:150,100:180,100:190,100:195,100:200,100:250,100:300,0:100的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，得到B4.1-B4.13十三个组分，将B4.10组分用羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱分离得到内酯类化合物，所述B组分和B4组分之间的质量比为21:1，B4组分和B4.10组分之间的质量比为50:3，B4.10组分和内酯类化合物之间的质量比为1000:11。

2.根据权利要求1所述的一种内酯类化合物的提取方法，其特征在于，所述的石油醚、乙酸乙酯和甲醇均为工业用标准。

3.根据权利要求1所述的一种内酯类化合物的提取方法，其特征在于，步骤(1)中将猫儿屎内生真菌DS37固体发酵后的阴干产物用石油醚/乙酸乙酯/甲醇浸提8次。