CN109295122A - 一种窿缘桉内生真菌Chaetomium sp次生代谢产物的制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的制备方法及用途,该方法包含:(1)将窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.在PDA固体培养基活化、继代培养,再在PDB液体培养基中摇培;(2)将步骤(1)中获得的液体种子在大米培养基中发酵培养,获得固体发酵物;(3)固体发酵物采用甲醇冷浸提取,过滤,滤液浓缩得到粗提物,将粗提物水混悬后用石油醚和乙酸乙酯萃取,分别得到石油醚和乙酸乙酯层粗提物;(4)通过减压柱层析、葡聚糖凝胶柱层析、半制备型高效液相色谱获得化合物A‑F。本发明的方法对窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.的次生代谢产物进行分离,并且次生代谢产物具有抑菌和抗肿瘤作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种窿缘桉内生真菌次生代谢产物,具体涉及一种窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的制备方法及用途。
背景技术
窿缘桉(Eucalyptus exserta F.Muell)又名小叶桉、风吹柳,是较早从澳大利亚引入我国的桉树树种之一,在广东、海南和广西等地广泛栽种。窿缘桉除作为重要经济用材林之外,其叶片在民间可作为中草药,具有降压消炎的作用,其树皮的甲醇提取物具有杀虫作用。
随着桉树大面积种植,病害发生的范围和程度也随之增加。灰腐病、青枯病、焦枯病、溃疡病以及根腐病的发生对桉树的栽培产生了巨大损失。如目前危害最为严重的青枯病,会导致桉树叶片失水萎蔫,病部变褐坏死,根系变黑腐烂,严重时导致整株枯萎死亡,对于林业生产造成严重的经济损失。目前,对于桉树病害防治的主要方法是使用化学农药,然而化学农药的持续大量使用对环境中非靶标有益生物产生巨大危害,严重破坏了生态系统环境的结构和功能,同时带来了严重的环境污染,导致土壤特别是耕地地力的基础生产能力下降;部分易残留,毒性高的传统药剂也成为影响人畜健康及微生物群落的重要因素。
植物内生真菌(Endophytic fungi)是指那些在其生活史中的部分时期或全部时期生活于健康植物的组织或器官内部的真菌。植物内生真菌种类繁多,是微生物中一个庞大的类群。内生真菌与宿主植物一般为互利共生的关系,植物内生真菌能产生多种次生代谢产物来促进植物生长发育、提高宿主植物抗性,是处理各个产业中日益严重的微生物多重耐药性的问题绿色途径,而且这些天然来源的生物活性物质副作用小,成本效益高。因此,有望利用生防菌、菌根以及基因工程技术进行桉树病害的生物防治技术,但目前尚未取得深入的研究结果。
2016年冯皓从窿缘桉中分离出了8株内生真菌(冯皓,桉树内生真菌及其次生代谢产物生物活性研究,2016年),Eef-B1、Eef-B2、Eef-B4、Eef-B5、Eef-B8、Eef-B9、 Eef-B14、Eef-B17分离自窿缘桉枝条,2株内生真菌Eef-S1和Eef-S10分离自窿缘桉种子,经鉴定Eef-S10菌落为Chaetomium sp.(毛壳菌属)内生真菌。
目前,对桉树内生真菌研究较少,且在窿缘桉中首次发现Chaetomium sp.真菌,尚未有对窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.的次生代谢产物的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的制备方法及用途,该方法解决了目前尚未有对窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物研究的问题,对Chaetomium sp.的次生代谢产物进行分离,并且次生代谢产物具有抑菌作用。
为了达到上述目的,本发明提供了一种窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的制备方法,该方法包含:
(1)将窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.接种到PDA固体培养基平板上活化、继代培养,再将其菌丝接种至PDB液体培养基中,摇培;
(2)将步骤(1)中获得的液体种子接入已灭菌的大米培养基中,后转至28℃恒温发酵培养,获得固体发酵物;
(3)所述的固体发酵物采用甲醇冷浸提取,过滤,滤液浓缩得到粗提物,将所述的粗提物水混悬后用石油醚和乙酸乙酯萃取,分别得到石油醚和乙酸乙酯层粗提物;
(4)通过减压柱层析、葡聚糖凝胶柱层析、半制备型高效液相色谱获得化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、化合物E和化合物F,分别具有如下式(Ⅰ)、(Ⅱ)、 (Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)结构:
优选地,在步骤(1)中,所述活化培养5~7d,所述继代培养4~5d。
优选地,在步骤(1)中,所述摇培条件为28℃,150rpm,摇培6~7d。
优选地,在步骤(2)中,所述发酵时间为60d。
优选地,在步骤(4)中,所述柱层析依次采用石油醚、体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇混合液作为洗脱液进行洗脱,收集流出液,再依次采用纯石油醚、石油醚和二氯甲烷混合液、纯二氯甲烷、二氯甲烷和甲醇混合液作为洗脱液进行梯度洗脱,收集流出液,经葡聚糖凝胶柱层析、半制备型高效液相色谱获得化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、化合物E和化合物F。
优选地,所述葡聚糖凝胶柱层析采用Sephadex LH-20。
优选地,所述葡聚糖凝胶柱层析采用体积比为1:1的氯仿和甲醇作为洗脱液。
优选地,所述化合物A是通过反复重结晶获得的。
所述化合物B通过将减压柱层析梯度洗脱得到的流出液经Sephadex LH-20凝胶柱层析,再经反复重结晶获得。
所述化合物C通过将减压柱层析梯度洗脱得到的流出液经Sephadex LH-20凝胶柱层析,再经半制备型高效液相色谱获得的,该半制备型高效液相色谱的条件为甲醇:水=75:25,流速:5mL/min,λ=210nm。
所述化合物D通过将减压柱层析梯度洗脱得到的流出液经Sephadex LH-20凝胶柱层析,再经反复重结晶获得。
所述化合物E是通过将柱层析梯度洗脱得到的流出液经Sephadex LH-20凝胶柱层析,再经半制备型高效液相色谱获得的,该半制备型高效液相色谱的条件为甲醇:水= 65:35,流速:5mL/min,λ=210nm。
所述化合物F是通过将柱层析梯度洗脱得到的流出液经Sephadex LH-20凝胶柱层析,再经半制备型高效液相色谱获得的,该半制备型高效液相色谱的条件为甲醇:水= 65:35,流速:5mL/min,λ=210nm。
本发明还提供了一种窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的用途,该次生代谢产物为化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、化合物E和化合物F,分别具有如下式(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)结构:
所述化合物A、化合物C和G对金黄色葡萄球菌具有抑制作用,且化合物A对耐药性的金黄色葡萄球菌具有很强的抑制作用。
所述化合物F根癌农杆菌、黄瓜角斑病菌、桉树青枯病菌和番茄疮痂病菌均具有抑菌作用。
所述化合物E对黄瓜角斑病菌和番茄疮痂病菌表现出抑制活性。
所述化合物A、化合物B和化合物D具有抗肿瘤活性。
所述化合物C具有抗氧化作用。
优选地,所述化合物F作为桉树青枯病的抑菌剂。
本发明的窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的制备方法及用途,解决了目前尚未有对窿缘桉中Chaetomium sp.次生代谢产物研究的问题,具有以下优点:
本发明的方法对窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.发酵,分离获得了化合物A-F。其中,化合物A对耐药性革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌表现出最强的抑制活性,IC50值为6.21μg/mL,对标准菌株也表现出较好的抑制活性;化合物C和G对耐药性革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌表现出一定的抑制活性,IC50值分别为76.35μg/mL和63.15 μg/mL,其对金黄色葡萄球菌标准菌株也表现出一定的抑制活性,IC50值分别为79.44 μg/mL和70.14μg/mL;化合物A、化合物C和化合物D均为缩酚酸环醚类化合物,在结构有一定的相似性,对革兰氏阴性菌的IC50值均大于100μg/mL,说明活性与化合物的结构有关;化合物F对4种革兰氏阴性细菌生长的IC50值为35.87~55.50μg/mL,其中对桉树青枯病菌的抑制活性最好,IC50值为35.87μg/mL,而且阳性对照对桉树青枯病菌的IC50值为33.07μg/mL,两者的结果非常接近;化合物E仅对黄瓜角斑病菌和番茄疮痂病菌表现出抑制活性,IC50值分别为67.25μg/mL和93.59μg/mL;化合物A对 HepG2的抑制活性最强,IC50值为6.83μg/mL,其次是化合物B,IC50值为19.64μg/mL,其他化合物对HepG2的抑制活性的IC50值大于50μg/mL。此外,化合物B对Hela细胞株系也表现出最强的抑制活性,IC50值为13.97μg/mL,其次是化合物D,IC50值为 21.35μg/mL,其他化合物对Hela的抑制活性的IC50值大于50μg/mL。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实验材料:
GF 254薄层层析硅胶和正相柱层析硅胶(60-80目、100-200目和200-300目);
噻唑兰:英文缩写MTT,3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,购自美国Sigma公司;
DPPH:1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,购自美国Sigma 公司;
BHT:Butylated hydroxytoluene,2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚,购自美国Sigma公司;
硫酸链霉素:Streptomycin sulfate,美国Sigma公司;
马铃薯葡萄糖琼脂培养基:Potato dextrose agarmedium,PDA,主要用于内生真菌 Chaetomium sp.的活化、继代和保存,其配方为马铃薯200g、琼脂20g、葡萄糖20g,定容至1000mL,121℃下湿热灭菌15-20min;
马铃薯葡萄糖液体培养基:Potato dextrose broth medium,PDB,主要用于内生真菌 Eef-S10的活化培养,其配方为马铃薯200g、葡萄糖20g,定容至1000mL,121℃下湿热灭菌15-20min;
LB琼脂培养基:Luria-Bertani agarmedium,用于供试细菌的活化、继代和保存,其配方为氯化钠5g,酵母浸膏5g,蛋白胨10g,琼脂20g,加去离子水定容至1000mL, 121℃条件下湿热灭菌15-20min;
LB液体培养基:Luria-Bertani broth medium,用于供试细菌的摇培和抗细菌活性测定,其配方为氯化钠5g,酵母浸膏5g,蛋白胨10g,加去离子水定容至1000mL, 121℃条件下湿热灭菌15-20min;
大米培养基:用于内生真菌Chaetomium sp.的大规模发酵培养,其配方为大米30g和去离子水30mL,121℃条件下湿热灭菌30min。
实验例1内生真菌Chaetomium sp.发酵
首先从4℃冻存管中挑取少许内生真菌Chaetomium sp.(内生真菌Chaetomiumsp. 采用2016年冯皓论文“桉树内生真菌及其次生代谢产物生物活性研究”中的方法获得)菌丝接种到PDA固体培养基平板上活化培养5~7d,继代培养4~5d后,再将其菌丝接种在500mL装有200mL PDB液体培养基的三角瓶中,置于25℃,150rpm条件下摇培6~7天。将获得的液体种子接入已灭菌的大米培养基中,后转至28℃恒温培养箱发酵60天,共发酵了6Kg大米培养基。
实验例2次生代谢产物的制备
(1)乙酸乙酯层粗提物的制备
将内生真菌Chaetomium sp.固体发酵物从发酵瓶里取出置于提取桶中,用铲子将菌块捣散,倒入适量甲醇冷浸提取,反复提取3次,每次3天。用纱布过滤得到滤液,将发酵液真空抽滤,减压浓缩至干后得到粗提物。将粗提物水混悬后,采用石油醚和乙酸乙酯萃取,再次减压浓缩,分别得到石油醚层粗提物(15.15g)和乙酸乙酯层粗提物 (51.40g)。
(2)乙酸乙酯层粗提物的减压柱层析
将乙酸乙酯层粗提取物用丙酮溶解,称取硅胶(60-100目)51.4g,与样品按1:1 拌样,拌样后置通风处晾干,称取450g硅胶(200-300目)一次性装柱,将拌好的样品均匀的添加到硅胶柱上,并保持界面水平。
柱子装好之后,先用5L石油醚洗脱剂洗脱,收集流出液,减压蒸干后得到A段粗提物(6.05g),再用5L(二氯甲烷:甲醇=10:1,v/v)洗脱剂洗脱,收集流出液,减压蒸干后得到B段粗提物(25.19g)。
(3)乙酸乙酯层B段的分离
将B段乙酸乙酯层粗提物25.19g用丙酮溶解,用25.0g的硅胶(60-100目)拌样,待溶剂挥发至干后,称取450.0g(200-300目)的硅胶一次性装柱(8cm×30cm),将拌好的样品均匀的添加到硅胶柱上,并保持界面水平。
柱子装好后,每次分别用1150mL洗脱剂(纯石油醚)、(石油醚:二氯甲烷=2: 1)、(石油醚:二氯甲烷=1:1)、(石油醚:二氯甲烷=1:2)、(石油醚:二氯甲烷=1:4)、 (纯二氯甲烷)、(二氯甲烷:甲醇=50:1)、(二氯甲烷:甲醇=20:1)、(二氯甲烷:甲醇=10:1)、(二氯甲烷:甲醇=5:1)和(纯甲醇)洗脱,分别收集流出液,共 11个流分,分别编号为B1-B11。
(5)化合物E和化合物F的分离和鉴定
B4段馏分重1.4g经Sephadex LH-20(氯仿:甲醇=1:1,v/v)凝胶柱层析,共分得7个组分,编号为B4-1至B4-7。B4-7(30mg)经semi-HPLC(甲醇:水=65:35,流速:5mL/min,λ=210nm,进样体积:0.1mL)制备,得到化合物E(4.5mg)和化合物F(5.5mg)。
化合物E为淡黄色晶体(甲醇),分子式为C10H12O4,Ω=5,化合物E的1H NMR 和13CNMR数据为:1H NMR(600MHz,CDCl3),δ12.07(s,1H),6.21(s,1H),5.15(s,1H), 3.92(s,3H),2.46(s,3H),2.10(s,3H)。13C NMR(151MHz,CDCl3),δ172.95,163.49, 158.33,140.51,110.87,108.82,105.58,52.20,24.48,8.02。
化合物F为白色晶体(甲醇),分子式为C11H14O4,Ω=5,化合物F的1H NMR和13C NMR数据为:1H NMR(600MHz,CDCl3),δ12.15(s,1H),6.20(s,1H),5.19(s,1H), 4.39(q,J=7.1Hz,2H),2.47(s,3H),2.10(s,3H),1.41(t,J=7.1Hz,3H)。13C NMR(151 MHz,CDCl3),δ172.52,163.52,158.35,140.52,110.87,108.90,105.62,61.56,24.57,14.60, 8.02。
(6)化合物A和化合物B的分离和鉴定
B6段重9.5g,通过TLC分析发现其主要物质有三个,其中含有一个量大且甲醇不溶的化合物,通过重结晶的方法将其分为两部分B6-1和B6-2。
B6-1(600mg)经Sephadex LH-20(氯仿:甲醇=1:1,v/v)凝胶柱层析,共分得6个组分,编号为B6-1-1至B6-1-6。B6-1-5(50mg)通过反复的重结晶得到化合物B(5 mg)。B6-2通过反复重结晶得到化合物A(3750mg)。
化合物A,白色固体,HR-ESI-MS m/z 369.1344[M+H]+(calcd for C21H20O6,369.1260),1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δH 10.49(s,1H),6.80(s,1H),6.79(s,1H),4.95 (t,J=7.0Hz,1H),3.22(d,J=6.9Hz,2H),2.40(s,3H),2.18(s,3H),1.70(s,3H),1.60(s, 3H);13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δC 191.50,164.01,162.73,152.55,151.63,148.53, 135.21,131.32,129.44,125.53,122.37,117.57,112.03,105.04,25.84,25.30,21.79,18.19,12.80。
化合物B,无色针状晶体,HR-ESI-MS m/z 369.1335[M+H]+(计算值C21H20O6,369.1260),1H NMR(600MHz,Acetone-d6)δH 12.23(s,1H),10.78(s,1H),8.83(s,1H), 6.79(s,1H),6.68(s,1H),5.03(t,1H),3.37(d,J=6.9Hz,2H),2.50(s,3H),2.38(s,3H), 1.76(s,3H),1.64(s,3H).13C NMR(151MHz,Acetone-d6)δC 194.60,166.48,165.97, 162.74,154.54,153.64,143.27,142.95,132.12,130.87,125.93,122.93,117.85,114.13,111.82,105.74,25.87,22.19,17.98,13.41。
(7)化合物C的分离和鉴定
B7馏分(1.1g)经过Sephadex LH-20(氯仿:甲醇=1:1,v/v)凝胶柱层析,共分得9个组分,编号为B7-1至B7-9。
B7-6(73mg)通过semi-HPLC(甲醇:水=75:25,流速:5mL/min,λ=210nm,进样体积:0.1mL)制备,得到化合物C(24mg)。
化合物C白色不定型固体,易溶于丙酮,通过HR-ESI-MS得到分子式为C23H26O6 (m/z421.1622[M+Na]+,calcd.421.1729),Ω=11,化合物C的1H NMR和13C NMR 数据为:1HNMR(600MHz,Acetone-d6),δ6.87(s,1H),6.69(s,1H),5.02(m,J=6.9,3.7 Hz,1H),4.78(s,2H),3.61(q,J=7.0Hz,2H),3.34(d,J=6.9Hz,2H),2.37(s,3H),2.24(s, 3H),1.75(s,3H),1.63(s,3H),1.20(t,J=7.0Hz,3H)。13C NMR(151MHz,Acetone-d6),δ164.03,162.45,161.17,152.58,149.91,144.62,137.01,131.82,129.91,125.74,123.10, 116.33,114.42,114.01,106.38,66.29,62.37,25.89,25.79,21.05,17.96,15.55,12.67。
(8)化合物D的分离和鉴定
B9馏分(0.58g)经过Sephadex LH-20(氯仿:甲醇=1:1,v/v)凝胶柱层析,共分得8个组分,编号为B9-1至B9-8。其中B9-5通过进一步重结晶得到化合物D(3mg)。
化合物D,白色固体,HR-ESI-MS m/z 371.1495[M+H]+(计算值C21H22O6,371.1416),1H NMR(600MHz,Acetone-d6)δH 6.80(s,1H),6.64(s,1H),5.03–5.00(m, 1H),4.99(s,2H),3.33(d,J=6.9Hz,2H),2.36(s,3H),2.23(s,3H),1.75(s,3H),1.63(s, 3H).13C NMR(151MHz,Acetone-d6)δC 164.08,161.37,161.35,152.70,149.96,144.02,137.05,131.85,129.99,125.82,123.15,116.59,116.45,113.95,106.21,56.12,25.78,20.92, 17.97,12.67。
实验例3次生代谢产物的抗菌活性
(1)供试细菌
所选择的供试细菌分别为:金黄色葡萄球菌(S.aureus ATCC29213和耐药性菌株S.aureus N50)(G+)、大肠杆菌(Escherichia coli)(G-)、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens ATCC 11158)(G-)、黄瓜角斑病菌(Pseudomonas lachrymansATCC 11921)(G-)、桉树青枯病菌(Ralstonia solanacearum)(G-)和番茄疮痂病菌(Xanthomonasvesicatoria ATCC 11633)(G-)。
(2)溶液配制
磷酸缓冲液(PBS)的配置:用NaH2PO4和Na2HPO4配置pH=7.2的0.2mol/L的 PBS缓冲液。
噻唑蓝(MTT)溶液的配制:将上述的PBS缓冲液配置成浓度为5mg/mL的MTT 溶液。
样品溶液的配置:精密称取上述分离的各次生代谢产物2.0mg溶于0.3mL的丙酮中,再加入0.7mL的蒸馏水,配成浓度为2000μg/mL的母液,然后用30%的丙酮依次稀释成浓度为1500、1000、750、500、375、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、 3.90625和1.953125μg/mL的样品溶液,备用。
阳性对照溶液的配置:阳性对照为硫酸链霉素,精密称取2.0mg的硫酸链霉素,加入0.7mL的蒸馏水,完全溶解后再加入0.3mL的丙酮,混匀,配成浓度为2000μg/mL 的母液,而后用30%的丙酮依次稀释成浓度为1000、750、500、250、125、62.5、31.25、 15.625μg/mL的阳性对照溶液。
(3)活性测定
(3.1)供试细菌的活化和培养
由于上述供试细菌长期保存在-20℃下,因此在活性测定前,先用LB平板活化培养(28℃,暗)48h,然后挑取单菌落,在LB液体培养基中摇培(28℃,暗,150rpm) 9~12h,将菌液浓度稀释到106CFU/mL(OD620=1.0),备用。
(3.2)半抑制浓度(IC50)的测定
在洁净无菌的96微孔板中加入90μL浓度为106CFU/mL的供试菌液,然后加入不同浓度的测试样品溶液10μL。阳性对照为不同浓度的硫酸链霉素溶液。同时,设空白对照(H2O)和溶剂对照(30%丙酮)。
用封口膜将96微孔板四周封口,于28℃、黑暗条件下振荡(15rpm)培养24h,然后向每孔中加入10μL MTT溶液(5mg/mL),继续培养4h后,1500g离心20min,去上清,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL,振荡(15rpm)30min。为了测定半抑制浓度(IC50),多孔板离心后,每孔取100μL,于510nm下测定吸光值。按下面公式计算待测样品对供试细菌的抑制率(%):
所得数据采用Microsoft excel软件进行分析,供试样品浓度取对数(X),抑制率换算成机率值(Y),求得抑制活性回归方程(Y=aX+b)和半抑制浓度(IC50)。
如下表1,为本发明的次生代谢产物的抑菌活性测定结果表,结果表明化合物A对耐药性革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌表现出最强的抑制活性,IC50值为6.21μg/mL,对标准菌株也表现出较好的抑制活性。化合物C和G对金黄色葡萄球菌标准菌株也表现出一定的抑制活性,IC50值分别为79.44μg/mL和70.14μg/mL。化合物A、化合物C 和化合物D均为缩酚酸环醚类化合物,在结构有一定的相似性,其他化合物对革兰氏阴性菌的IC50值均大于100μg/mL,说明活性与化合物的结构有关。化合物F对4种革兰氏阴性细菌生长的IC50值为35.87~55.50μg/mL,其中对桉树青枯病菌的抑制活性最好,IC50值为35.87μg/mL,而且阳性对照的IC50值为33.07μg/mL,两者的结果非常接近。化合物E仅对黄瓜角斑病菌和番茄疮痂病菌表现出抑制活性,IC50值分别为67.25 μg/mL和93.59μg/mL。
表1本发明的次生代谢产物的抑菌活性测定结果表
注:“-”表示IC50大于100μg/mL。
实验例3次生代谢产物的抗肿瘤活性
采用微孔板-分光光度计法测定单体化合物对两种人体肿瘤细胞(HepG2和Hela)的抑制活性。
将对数生长期细胞接种于96孔细胞培养板(Nest)中(约50%-60%汇合度),待6-8h 后细胞贴壁。用含有5%FBS(Gibco)的DMEM(Hyclone)细胞培养基将化合物以2倍梯度稀释,共制备8个梯度浓度备用(80μg/mL,40μg/mL,20μg/mL,10μg/mL,5μg/mL, 2.5μg/mL,1.25μg/mL,0.625μg/mL)。小心吸弃各孔内原生长培养基后,将制备好的各浓度化合物分别加入对应孔中,每孔200μL,每个化合物每个浓度设置4组复孔。对照孔加入相应浓度DMSO。在37℃,5%CO2培养条件下,化合物与细胞共同继续共培养48h。每孔加入CCK8(东仁化学科技(上海)有限公司CK04)试剂15μL,在37℃, 5%CO2培养条件下继续培养4h后,于多功能微孔板检测仪(PE EnVision 2104-0010)上选取450nm检测各孔OD值,记录并保存数据。以GraphPad Prism 5拟合各化合物在各细胞株的生长抑制曲线并计算其IC50值。
如下表2,本发明的次生代谢产物对两种肿瘤细胞的抑制活性,其中化合物A对HepG2的抑制活性最强,IC50值为6.83μg/mL,其次是化合物B,IC50值为19.64μg/mL,其他化合物对HepG2的抑制活性的IC50值大于50μg/mL。此外,化合物B对Hela细胞株系也表现出最强的抑制活性,IC50值为13.97μg/mL,其次是化合物D,IC50值为 21.35μg/mL,其他化合物对Hela的抑制活性的IC50值大于50μg/mL。
表2本发明的次生代谢产物的抗肿瘤活性测定结果表
注:“-”表示IC50>50μg/mL。
实验例4次生代谢产物的抗氧化活性
采用DPPH清除力测定单体化合物的抗氧化活性,用分光光度法进行定量分析。
(1)溶液的配制
精密称取DPPH 20.0mg溶于100mL无水乙醇中,振荡摇匀,使其终浓度为0.2 mg/mL。阳性对照为BHT,精密称取1.0mg BHT溶于1000μL无水乙醇中,配成1000 μg/mL的母液,然后用无水乙醇依次稀释成初始浓度为250、125、62.5、31.25、15.625、 7.8125、3.90625、1.953μg/mL的阳性对照溶液。
精密称取1.0mg上述分离的化合物溶于1000μL无水乙醇中,配成浓度为1000 μg/mL的母液,然后用无水乙醇依次稀释成初始浓度为1000、500、250、62.5、31.25、 15.625、7.8123μg/mL。
(2)活性测定
首先向96微孔板中加入80μL浓度为0.2mg/mL的DPPH无水乙醇溶液,而后再加入20μL系列浓度的待测样品溶液或阳性对照溶液,震荡摇匀。在37℃下水浴30min, 517nm下测定吸光值。BHT作为阳性对照,以20μL无水乙醇溶液代替样品溶液作为空白对照。
用Microsoft excel软件对试验结果进行数据处理,将供试样品浓度的对数做X,DPPH清除率的生物统计机率值做Y,求得线性回归方程(Y=aX+b),令Y=5,求得有效中浓度IC50值。
如下表3,本发明的次生代谢产物对DPPH的清除力表,从下表可以看出,化合物 C表现出了抗氧化活性,对DPPH清除力的IC50值为71.92μg/mL。其它化合物在浓度为200μg/mL时,其对DPPH的半清除能力仍未达到50%。
表3为本发明的次生代谢产物对DPPH的清除力表
综上所述,本发明的方法对窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.的次生代谢产物进行分离,并且次生代谢产物具有抑菌作用。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍,但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后,对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此,本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (10)
1.一种窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的制备方法,其特征在于,该方法包含:
(1)将窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.接种到PDA固体培养基平板上活化、继代培养,再将其菌丝接种至PDB液体培养基中,摇培;
(2)将步骤(1)中获得的液体种子接入已灭菌的大米培养基中,后转至28℃恒温发酵培养,获得固体发酵物;
(3)所述的固体发酵物采用甲醇冷浸提取,过滤,滤液浓缩得到粗提物,将所述的粗提物水混悬后用石油醚和乙酸乙酯萃取,分别得到石油醚和乙酸乙酯层粗提物;
(4)通过减压柱层析、葡聚糖凝胶柱层析、半制备型高效液相色谱获得化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、化合物E和化合物F,分别具有如下式(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)结构:
2.根据权利要求1所述的窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中,所述活化培养5~7d,所述继代培养4~5d。
3.根据权利要求1所述的窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中,所述摇培条件为28℃,150rpm,摇培6~7d。
4.根据权利要求1所述的窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的制备方法,其特征在于,在步骤(2)中,所述发酵时间为60d。
5.根据权利要求1所述的窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的制备方法,其特征在于,在步骤(4)中,所述柱层析依次采用石油醚、体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇混合液作为洗脱液进行洗脱,收集流出液,再依次采用纯石油醚、石油醚和二氯甲烷混合液、纯二氯甲烷、二氯甲烷和甲醇混合液作为洗脱液进行梯度洗脱,收集流出液,经葡聚糖凝胶柱层析、半制备型高效液相色谱获得化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、化合物E和化合物F。
6.根据权利要求5所述的窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的制备方法,其特征在于,所述葡聚糖凝胶柱层析采用Sephadex LH-20。
7.根据权利要求6所述的窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的制备方法,其特征在于,所述葡聚糖凝胶柱层析采用体积比为1:1的氯仿和甲醇作为洗脱液。
8.根据权利要求7所述的窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的制备方法,其特征在于,所述化合物A是通过反复重结晶获得的;
所述化合物B通过将减压柱层析梯度洗脱得到的流出液经Sephadex LH-20凝胶柱层析,再经反复重结晶获得;
所述化合物C通过将减压柱层析梯度洗脱得到的流出液经Sephadex LH-20凝胶柱层析,再经半制备型高效液相色谱获得的,该半制备型高效液相色谱的条件为甲醇:水=75:25,流速:5mL/min,λ=210nm;
所述化合物D通过将减压柱层析梯度洗脱得到的流出液经Sephadex LH-20凝胶柱层析,再经反复重结晶获得;
所述化合物E是通过将柱层析梯度洗脱得到的流出液经Sephadex LH-20凝胶柱层析,再经半制备型高效液相色谱获得的,该半制备型高效液相色谱的条件为甲醇:水=65:35,流速:5mL/min,λ=210nm;
所述化合物F是通过将柱层析梯度洗脱得到的流出液经Sephadex LH-20凝胶柱层析,再经半制备型高效液相色谱获得的,该半制备型高效液相色谱的条件为甲醇:水=65:35,流速:5mL/min,λ=210nm。
9.一种窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的用途,其特征在于,该次生代谢产物为化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、化合物E和化合物F,分别具有如下式(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)结构:
所述化合物A、化合物C和G对金黄色葡萄球菌具有抑制作用,且化合物A对耐药性的金黄色葡萄球菌具有很强的抑制作用;
所述化合物F根癌农杆菌、黄瓜角斑病菌、桉树青枯病菌和番茄疮痂病菌均具有抑菌作用;
所述化合物E对黄瓜角斑病菌和番茄疮痂病菌表现出抑制活性;
所述化合物A、化合物B和化合物D具有抗肿瘤活性;
所述化合物C具有抗氧化作用。
10.根据权利要求9所述的窿缘桉内生真菌Chaetomium sp.次生代谢产物的用途,其特征在于,所述化合物F作为桉树青枯病的抑菌剂。
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