CN104262303A - 一种丁内酯类木脂素类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丁内酯类木脂素及其制备方法和应用，丁内酯类木脂素是以青霉属分枝青霉组( P.ramigena ， YNCA0361)菌株经发酵、提取、层析、纯化后得到，其分子式为C23H22O8，具有下述结构式：命名为青霉内酯A，英文名为versicolactoneA；青霉属分枝青霉组( P.ramigena ， YNCA0361)菌株，菌株保藏编号为CGMCCNo.4824，保藏日期为2011年5月2日。制备方法是以青霉属分枝青霉组( P.ramigena ， YNCA0361)菌株的固体发酵物为原料，经有机溶剂提取、硅胶柱层析、MCI脱色、反相柱层析、高压液相色谱分离等步骤而得到。所述应用为该丁内酯类木脂素在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。本发明化合物结构新颖，活性好，可作为抗烟草花叶病毒的先导化合物，有较好的应用前景。

Description

一种丁内酯类木脂素类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于微生物发酵的次生代谢产物分离纯化技术领域，具体涉及一种新颖的具有2-羰基-丙基片段的丁内酯类木脂素类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
微生物代谢产物的种类很多，在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等，是菌体生长繁殖所必需的。这些产物叫做初级代谢产物；在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，叫做次生代谢产物。次生代谢产物多为小分子化合物，但其化学结构类型多种多样，不同结构的次生代谢产物广泛具有抗炎症、抗菌、抗病毒、抗癌、扩张心血管、强心、平喘等多种生理活性，因而从微生物次生代谢中发现具有药用价值的先导性化合物得到了广泛的关注，并且药物生产已成为发酵工业的重要支柱。
丁内酯类木脂素是一类具有四个碳原子和一个氧原子组成的五元内酯为特征的木脂素类化合物，通常该类化合物都有一个或者两个异戊烯基取代基。该类化合物由于其较强的生物活性，如抗菌、抗肿瘤、抗炎和抗病毒等，而引起了人们的关注，是一类重要的药用成分。本发明从青霉属分枝青霉组固体发酵产物中分离得到一种具有显著抗烟草花叶病毒活性的丁内酯类木脂素；该化合物至今尚未见到相关报道。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种丁内酯类木脂素类化合物；第二目的在于提供所述的丁内酯类木脂素类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述的木脂素在制备抗烟草花叶病毒中的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述丁内酯类木脂素化合物是以青霉属分枝青霉组(P.ramigena，YNCA0361)菌株经发酵、提取、层析、纯化后得到，具有2-羰基-丙基片段，分子式为C23H22O8，，具有下述结构：
命名为青霉内酯A，英文名为versicolactone A； 
所述青霉属分枝青霉组(P.ramigena，YNCA0361)菌株，菌株保藏编号为CGMCC No. 4824，保藏日期为2011年5月2日。
本发明的第二目的是这样实现的，所是以青霉属分枝青霉组(P.ramigena，YNCA0361)菌株的固体发酵物为原料，经有机溶剂提取、硅胶柱层析、MCI柱脱色、反相柱层析、高压液相色谱分离步骤而得到，具体为：
A、固体发酵：将菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中于20℃~30℃下培养7天，接种到含10~100毫升马铃薯葡萄糖培养基的50~500毫升的三角瓶中，于 28℃下在转速180 rpm下震荡培养5~10天，含菌营养基，将其接种进行大规模固体发酵得到发酵产物；
B、发酵物浸膏提取：将发酵产物中加入固液体积比1.5~3倍的有机溶剂冷浸提取2~4次，每次30~60min，合并提取液，过滤，减压浓缩至1/4~1/2体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩得到浸膏；
C、硅胶柱层析：浸膏用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，用浸膏重量比0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为浸膏重量6~8倍量；用体积比为1:0~6:4的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
D、MCI脱色：将C步骤所得的各部分分别用重量比1.5~3倍量的体积浓度85~100%甲醇水溶液溶解，上柱前用水或者体积浓度10%的甲醇平衡好的MCI柱，然后上柱，用体积浓度为85~100%的甲醇水溶液进行洗脱脱色，分别收集以体积比为1:0~6:4的混合有机溶剂梯度洗脱对应的梯度洗脱液、浓缩；
E、反相柱层析： 将经C步骤以体积比为1:0~6:4的混合有机溶剂梯度洗脱后经D步骤MCI脱色的20:1部分上反相柱层析，反相柱用反相材料C-18装柱；用体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
F、高效液相色谱分离：将E步骤以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的丁内酯类木脂素，青霉内酯A。
以上述方法制备的丁内酯类木脂素类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：
本发明所述的丁内酯类木脂素类化合物为淡黄色或者白色晶体，通过一维和二维核磁共振谱、高分辨质谱、以及紫外和红外等谱学数据，最终确定青霉内酯A的结构。
1) 紫外光谱（溶剂为甲醇），λmax (log ε): 210 (4.38), 244 (3.56), 305 (3.72) nm；
2) 红外光谱（溴化钾压片）， ν max 3460, 3018, 2977, 2934, 1735, 1727, 1605, 1528, 1485, 1434, 1388, 1223, 1178, 1124, 1039, 876, 758 cm-1；
3) 高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）显示本发明化合物准分子离子峰m/z 461.1581 [M+Na]+ (calcd 461.1576 for C25H26NaO7)，结合13C 和1H NMR谱(图1和图2，碳谱氢谱数据归属见表1) 给出其分子式为C23H22O8，分子量为426。1H NMR（C5D5N，400 MHz）和13C NMR（C5D5N，100 MHz）数据，见表1。ESIMS (positive ion mode) m/z 461 [M + Na]+; HRESIMS (positive ion mode) m/z 461.1581 [M+Na]+ (calcd 461.1576 for C25H26NaO7)。
从1H NMR谱(图2) 显示一个1,4-二取代的苯环信号 (δ H 7.63, 2H, d, J = 8.6 Hz; 6.85, 2H, d, J = 8.6 Hz), 一个 1,3,4-三取代的苯环体系 (δ H 6.33, 1H, d, J = 1.8 Hz; 6.61, 1H, J = 8.2 和1.8 Hz; 6.51, 1H, d, J = 8.2 Hz), 两个甲氧基信号(δ H 3.71, 3H, s; 3.78, 3H, s)。13C NMR谱(图1) 显示3个甲基（两个含氧）、2个亚甲基、7个次甲基和11个季碳信号。3个羰基和14个不饱和双键碳占了10个不饱和度，这些信息提示了青霉内酯A 有三个环（其中包括了2个芳香环和一个内酯环），碳谱中可以看到特征性的信号 (δ C 168.9, 140.8, 127.4, 85.9, 38.9, and 170.3) ，提示了青霉内酯A是一个丁内酯类木脂素。通过与已知的丁内酯类木脂素化合物butyrolactone I 对比发现，它们具有完全一致的骨架，不同之处仅在于butyrolactone I 中C-3'' 的异戊烯基被2-羰基-丙基取代。这些推测通过HMBC谱得到了证实。在HMBC谱中，我们观测到了H3-9'' (δ H 1.68) 与C-7'' (δ C 48.4) 和C-8'' (δ C 206.4)，H2-7'' (δ H 4.11)与C-9'' (δ C 29.8)、C-2'' (δ C 132.3) 和C-4'' (δ C 152.5)相关。同时，甲氧基 (δ H 3.78)与C-4′ (δ C 160.9)相关。因此，该丁内酯类木脂素类化合物的平面结构得以确定，再根据ROSEY谱确定了该化合物的相对构型，并命名为青霉内酯A，英文名为versicolactone A。
表1  青霉内酯A的1H和13C NMR数据（溶剂为CD3OD）(125 and 500 MHz)
No. 13C 1H
1 168.9 s  
2 140.8 s  
3 127.4 s  
4 85.9 s  
5 38.9 t 3.38, 3.43 d (14.6)
6 170.3 s  
1′ 122.8 s  
2′,6′ 130.1 d 7.63 d (8.6)
3′,5′ 116.5 d 6.85 d (8.6)
4′ 160.9 s  
1′′ 124.5 s  
2′′ 132.3 d 6.33 d (1.8)
3′′ 125.0 s  
4′′ 152.5 s  
5′′ 114.9 d 6.51 d (8.2)
6′′ 128.9 d 6.61 d (1.8, 8.2)
7′′ 48.4 t 4.11 s
8′′ 206.4 s  
9′′ 29.8 q 1.68 s
10′′    
11′′    
-OMe-6 53.3 q 3.71 s
-OMe-4′ 56.0 q 3.78 s
本发明的第三目的是这样实现的，即将所述的丁内酯类木脂素类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
本发明木脂素类化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定为具有2-羰基-丙基片段的丁内酯类木脂素，并表征了其具体。经对抗烟草花叶病毒的实验，其相对抑制率在20μm下达到46.4%，超过阳性对照品南宁霉素的相对抑制率(30.8%)，具有很好的抗烟草花叶病毒活性。本发明化合物结构新颖活性好，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导化合物，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为化合物青霉内酯A的核磁共振碳谱（13C NMR）；
图2为化合物青霉内酯A的核磁共振氢谱（1H NMR）；
图3为化合物杂青霉内酯A的1H―1H COSY和HMBC相关。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于以本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明所述的丁内酯类木脂素类化合物，是以青霉属分枝青霉组(P.ramigena，YNCA0361)菌株经发酵、提取、层析、纯化后得到，具有2-羰基-丙基片段，分子式为C23H22O8，具有下述结构：
命名为青霉内酯A，英文名为versicolactone A； 
所述青霉属分枝青霉组(P.ramigena，YNCA0361)菌株，菌株保藏编号为CGMCC No. 4824，保藏日期为2011年5月2日。
本发明所述的丁内酯类木脂素类化合物的制备方法，是以青霉属分枝青霉组(P.ramigena，YNCA0361)菌株的固体发酵物为原料，经有机溶剂提取、硅胶柱层析、MCI柱脱色、反相柱层析、高压液相色谱分离步骤而得到，具体为：
A、固体发酵：将菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中于20℃~30℃下培养7天，接种到含10~100毫升马铃薯葡萄糖培养基的50~500毫升的三角瓶中，于 28℃下在转速180 rpm下震荡培养5~10天，含菌营养基，将其接种进行大规模固体发酵得到发酵产物；
B、发酵物浸膏提取：将发酵产物中加入固液体积比1.5~3倍的有机溶剂冷浸提取2~4次，每次30~60 min，合并提取液，过滤，减压浓缩至1/4~1/2体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩得到浸膏；
C、硅胶柱层析：浸膏用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，用浸膏重量比0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为浸膏重量6~8倍量；用体积比为1:0~6:4的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
D、MCI脱色：将C步骤所得的各部分分别用重量比1.5~3倍量的体积浓度85~100%甲醇水溶液溶解，上柱前用水或者体积浓度低于10%的甲醇平衡好的MCI柱，然后上柱，用体积浓度为85~100%的甲醇水溶液进行洗脱脱色，分别收集以体积比为1:0~6:4的混合有机溶剂梯度洗脱对应的梯度洗脱液、浓缩；
E、反相柱层析： 将经C步骤以体积比为1:0~6:4的混合有机溶剂梯度洗脱后经D步骤MCI脱色的20:1部分上反相柱层析，反相柱用反相材料C-18装柱；用体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
F、高效液相色谱分离：将E步骤以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的丁内酯类木脂素青霉内酯A。
A步骤中所述的大规模固体发酵是将所得的含菌营养基接种100~1000个100~500毫升的冯巴赫瓶中，每个瓶含有10~200克大米和10~200毫升蒸馏水，每个瓶中接种1.0~5.0毫升，于25℃下培养20~45天。
B步骤中所述的有机溶剂为70~100%的丙酮、乙醇、乙酸乙酯或甲醇。 
C步骤中所述的混合有机溶剂为正己烷-丙酮、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯。 
所述的混合有机溶剂的体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2和0:1。
D步骤中所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、石油醚或苯。
E步骤中所述的甲醇水溶液的浓度为20%、30%、40%、50%、60%、70%和100%。
F步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以50~70%的甲醇为流动相，流速10~14 ml/min，21.2×250 mm，5 μm 的ZORBAX-C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为201，254 和280 nm，每次进样45~60 μL，收集15~35 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的丁内酯类木脂素类化合物。
本发明的应用为所述的丁内酯类木脂素类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
另外，本发明的菌种不局限于青霉属分枝青霉组(P.ramigena，YNCA0361)菌株，下面以青霉菌为例对本发明进行进一步说明。
本发明所述的丁内酯类木脂素类化合物，可以以百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)中分离得到的青霉属内生真菌 (Aspergillus versicolor)的固体发酵物为原料分离得到，具有2-羰基-丙基片段，分子式为C23H22O8，具有下述结构：
其制备方法是以百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)中分离得到的青霉属内生真菌 (Aspergillus versicolor)的固体发酵物为原料，经有机溶剂提取、硅胶柱层析、MCI柱脱色、反相柱层析、高压液相色谱分离步骤而得到，具体为：
A、内生真菌(Aspergillus versicolor) 的分离：将75%酒精消毒过的百合科重楼属滇重楼 (Paris polyphylla var. yunnanensis) 茎秆和叶片放入无菌的研钵中，加入少量水并放有少量的石英砂进行彻底研磨, 直至茎叶成为碎片，将碎片溶液转入无菌的塑料管内, 1000~3000 rpm 离心2~10分钟 ,吸取1~100微升上清液, 涂布在BL平板上，倒置于培养箱中，28摄氏度黑暗培养2~10天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌种，从而获得单一内生真菌菌落，经ITS测序 (Genbank Accession number KJ801852) 确定为青霉属真菌 (Aspergillus versicolor)；
B、青霉属真菌 (Aspergillus versicolor)菌种培养：A步骤所叙的青霉菌在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28摄氏度培养7天。将青霉菌接种在50~500毫升的三角瓶中，每个三角瓶含10~100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于28摄氏度下震荡培养5~10天(180 rpm)。
C、大规模青霉菌 (Aspergillus versicolor)发酵：A步骤所叙的青霉菌大规模发酵在100~1000个100~500毫升的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有10~200克大米和10~200毫升蒸馏水。每个瓶中接种1.0~5.0毫升步骤B说叙的含菌营养基，25摄氏度培养20~45天。 
D、浸膏提取：将C步骤说叙的大规模青霉菌 (Aspergillus versicolor)发酵物，用有机溶剂冷浸提取4次，每次30~60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
E、硅胶柱层析：将浸膏a用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，然后用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为浸膏a重量6~8倍量；用体积比为1:0~6:4的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分。
F、MCI脱色：E步骤所得的各部分分别用甲醇水溶解，然后用水或者浓度低于10%的甲醇平衡好的MCI柱，用约85~100%甲醇水洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩；
G、反相柱层析：将以20:1配比的有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-18装柱；用体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
H、高效液相色谱分离：将以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的木脂素类化合物青霉青霉内酯A；
其中，D步骤所述的有机溶剂为70~100%的丙酮、乙醇或甲醇。 
E步骤所述的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚或苯。
E步骤所述的混合有机溶剂为正己烷-丙酮、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯。
E步骤所述的混合有机溶剂的体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1。
G步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以50~70%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2×250 mm，5μm 的ZORBAX-C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为201，254 和280 nm，每次进样45~60μL，收集15~35min的色谱峰，多次累加后蒸干。即得所述的即得所述的木脂素类化合物青霉内酯A。
所述的百合科重楼属滇重楼 (Paris polyphylla var. yunnanensis) 不受地区和品种限制，也均可以实现。
实施例1
将青霉属分枝青霉组(P.ramigena，YNCA0361)菌株在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28摄氏度培养7天，接种在250毫升的三角瓶中，每个三角瓶含100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于28摄氏度下震荡培养 5天(180 rpm)。大规模发酵在200个500毫升的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有100克大米和120毫升蒸馏水。每个瓶中接种5.0毫升含菌营养基，25摄氏度培养45天。用体积浓度70%的丙酮冷浸提取4次，每次60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩得到215g浸膏a；浸膏a用200目硅胶1000g装柱，用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分，体积比9:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液c为23.2g；用MCI脱色，再用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20%、30%、40%、50%、60%、70%和100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50%、60%和70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以68%的甲醇为流动相，流速12mL/min，21.2×250mm，紫外检测器检测波长为201，254 和280nm，每次进样50μL，收集17min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的木脂素类化合物青霉内酯A 9.2mg。
实施例2
将青霉属分枝青霉组(P.ramigena，YNCA0361)菌株在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28摄氏度培养7天。接种在100毫升的三角瓶中，每个三角瓶含50毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于28摄氏度下震荡培养 5天(180 rpm)。大规模发酵在100个250毫升的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有50克大米和60毫升蒸馏水。每个瓶中接种5.0毫升含菌营养基，25摄氏度培养45天。 
用体积浓度99%的乙醇冷浸提取4次，每次30min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩得到125g浸膏a；浸膏a用200目硅胶500g装柱，用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分，体积比9:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液c为10g；用MCI脱色，再用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20%、30%、40%、50%、60%、70%和100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50%、60%和70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以60%的甲醇为流动相，流速12mL/min，21.2×250mm，紫外检测器检测波长为201，254 和280nm，每次进样30μL，收集25min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的木脂素类化合物青霉内酯A 4.5mg。
实施例3
将青霉属分枝青霉组(P.ramigena，YNCA0361)菌株在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28摄氏度培养7天。将青霉菌接种在250毫升的三角瓶中，每个三角瓶含100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于28摄氏度下震荡培养 5天(180 rpm)。大规模发酵在500个250毫升的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有50克大米和60毫升蒸馏水。每个瓶中接种5.0毫升含菌营养基，25摄氏度培养45天。用体积浓度90%的甲醇冷浸提取4次，每次50min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩得到400g浸膏a；浸膏a用200目硅胶2000g装柱，用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分，体积比9:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液c为40.5g；用MCI脱色，再用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为为20%、30%、40%、50%、60%、70%和100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50%、60%和70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以68%的甲醇为流动相，流速12mL/min，21.2×250mm，紫外检测器检测波长为201，254 和280nm，每次进样50μL，收集17min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的木脂素类化合物青霉内酯A 21.5mg。
实施例4
取实施例1制备的丁内酯类木脂素青霉内酯A，为淡黄色晶体；通过一维和二维核磁共振谱、高分辨质谱、以及紫外和红外等谱学数据，最终确定了结构。
(1) 紫外光谱 (溶剂为甲醇)，λ max (logε): 210 (4.38), 244 (3.56), 305 (3.72) nm； 
(2) 红外光谱 (溴化钾压片)，ν max 3460, 3018, 2977, 2934, 1735, 1727, 1605, 1528, 1485, 1434, 1388, 1223, 1178, 1124, 1039, 876, 758 cm-1;  
表1青霉内酯A的1H和13C NMR数据（溶剂为CD3OD）(125 and 500 MHz)
No. 13C 1H
1 168.9 s  
2 140.8 s  
3 127.4 s  
4 85.9 s  
5 38.9 t 3.38, 3.43 d (14.6)
6 170.3 s  
1′ 122.8 s  
2′,6′ 130.1 d 7.63 d (8.6)
3′,5′ 116.5 d 6.85 d (8.6)
4′ 160.9 s  
1′′ 124.5 s  
2′′ 132.3 d 6.33 d (1.8)
3′′ 125.0 s  
4′′ 152.5 s  
5′′ 114.9 d 6.51 d (8.2)
6′′ 128.9 d 6.61 d (1.8, 8.2)
7′′ 48.4 t 4.11 s
8′′ 206.4 s  
9′′ 29.8 q 1.68 s
10′′    
11′′    
-OMe-6 53.3 q 3.71 s
-OMe-4′ 56.0 q 3.78 s
(3) HRESIMS显示实施例1制备的丁内酯类木脂素青霉内酯A，准分子离子峰m/z 461.1581 [M+Na]+ (calcd 461.1576 for C25H26NaO7)，结合13C 和1H NMR谱（图1和图2，碳谱氢谱数据归属见表1）给出其分子式为C23H22O8，分子量为426。1H NMR（C5D5N，400 MHz）和13C NMR（C5D5N，100 MHz）数据，见表1。ESIMS (positive ion mode) m/z 461 [M + Na]+; HRESIMS (positive ion mode) m/z 461.1581 [M+Na]+ (calcd 461.1576 for C25H26NaO7).
实施例1制备的丁内酯类木脂素青霉内酯A的1H NMR谱(图2) 显示一个1,4-二取代的苯环信号 (δ H 7.63, 2H, d, J = 8.6 Hz; 6.85, 2H, d, J = 8.6 Hz), 一个 1,3,4-三取代的苯环体系 (δ H 6.33, 1H, d, J = 1.8 Hz; 6.61, 1H, J = 8.2 和1.8 Hz; 6.51, 1H, d, J = 8.2 Hz), 两个 甲氧基信号(δ H 3.71, 3H, s; 3.78, 3H, s)。13C NMR谱(图1) 显示3个甲基（两个含氧）、2个亚甲基、7个次甲基和11个季碳信号。3个羰基和14个不饱和双键碳占了10个不饱和度，这些信息提示了青霉内酯A 有三个环（其中包括了2个芳香环和一个内酯环），碳谱中可以看到特征性的信号 (δ C 168.9, 140.8, 127.4, 85.9, 38.9, and 170.3) ，提示了实施例1制备的丁内酯类木脂素，青霉内酯A是一个丁内酯类木脂素。通过与已知的丁内酯类木脂素化合物butyrolactone I 对比发现，它们具有完全一致的骨架，不同之处仅在于butyrolactone I 中C-3'' 的异戊烯基被2-羰基-丙基取代。这些推测通过HMBC谱得到了证实。在HMBC谱中，我们观测到了H3-9'' (δ H 1.68) 与C-7'' (δ C 48.4) 和C-8'' (δ C 206.4)，H2-7'' (δ H 4.11)与C-9'' (δ C 29.8)、C-2'' (δ C 132.3) 和C-4'' (δ C 152.5)相关。同时，甲氧基 (δ H 3.78)与C-4′ (δ C 160.9)相关。基于以上推理，实施例1制备的丁内酯类木脂素青霉内酯A的平面结构得以确定。再根据ROSEY谱确定了实施例1制备的丁内酯类木脂素青霉内酯A的相对构型。
实施例5
取实施例2、3制备的丁内酯类木脂素青霉内酯A，均为淡黄色或白色晶体，测定方法与实施例4相同，均确定实施例2、3制备的化合物为丁内酯类木脂素类化合物，再根据ROSEY谱确定了化合物丁内酯类木脂素青霉内酯A的平面结构。
实施例6
分别取实施例1~3所制备的丁内酯类木脂素类化合物进行抗烟草花叶病毒活性试验，试验情况如下：
采用半叶法，在药剂的质量浓度均为50 mg/L时对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5～6龄烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先将叶片均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，立即放在盛有药液的培养皿中处理20 min，取出，擦去叶片上水珠和药液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保湿的玻璃缸中，并盖上玻璃盖，控温(23 ± 2)℃，放在温室自然光照射，2～3 d即可见枯斑．每个处理都设另一半叶为对照，另外设有1组为商品宁南霉素的处理作为对比，按下公式计算相对抑制率。
XI％=(CK-T)／CK×100％
X：相对抑制率(％)，CK：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，T浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。
经对抗烟草花叶病毒的实验，其相对抑制率在20μm下达到46.4%，超过阳性对照品南宁霉素的相对抑制率(30.8%)，说明青霉内酯A具有很好的抗烟草花叶病毒活性。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的潜力。本发明化合物结构新颖活性好，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导化合物，具有较好的应用前景。

Claims (10)

1.一种丁内酯类木脂素类化合物，其特征在于所述丁内酯类木脂素化合物是以青霉属分枝青霉组(P.ramigena，YNCA0361)菌株经发酵、提取、层析、纯化后得到，具有2-羰基-丙基片段，分子式为C23H22O8，具有下述结构：
命名为青霉内酯A，英文名为versicolactone A； 
所述青霉属分枝青霉组(P.ramigena，YNCA0361)菌株，菌株保藏编号为CGMCC No. 4824，保藏日期为2011年5月2日。
2.一种权利要求1所述的丁内酯类木脂素类化合物的制备方法，其特征在于是以青霉属分枝青霉组 (P.ramigena，YNCA0361) 菌株的固体发酵物为原料，经有机溶剂提取、硅胶柱层析、MCI柱脱色、反相柱层析、高压液相色谱分离步骤而得到，具体为：
A、固体发酵：将菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中于20~30℃下培养7天，接种到含10~100毫升马铃薯葡萄糖培养基的50~500毫升的三角瓶中，于 28℃下在转速180 rpm下震荡培养5~10天，含菌营养基，将其接种进行大规模固体发酵得到发酵产物；
B、发酵物浸膏提取：将发酵产物中加入固液体积比1.5 ~ 3倍的有机溶剂冷浸提取2~4次，每次30 ~ 60 min，合并提取液，过滤，减压浓缩至1/4~1/2体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩得到浸膏；
C、硅胶柱层析：浸膏用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，用浸膏重量比0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为浸膏重量6~8倍量；用体积比为1:0~6:4的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
D、MCI脱色：将C步骤所得的各部分分别用重量比1.5~3倍量的体积浓度85~100%甲醇水溶液溶解，上柱前用水或者体积浓度浓度低于10%的甲醇平衡好的MCI柱，用体积浓度为85~100%的甲醇水溶液进行洗脱脱色，分别收集以体积比为1:0~6:4的混合有机溶剂梯度洗脱对应的梯度洗脱液、浓缩；
E、反相柱层析： 将经C步骤以体积比为1:0~6:4的混合有机溶剂梯度洗脱后经D步骤MCI脱色的20:1部分上反相柱层析，反相柱用反相材料C-18装柱；用体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
F、高效液相色谱分离：将E步骤以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的丁内酯类木脂素，青霉内酯A。
3.根据权利要求2所述的丁内酯类木脂素类化合物的制备方法，其特征在于A步骤中所述的大规模固体发酵是将所得的含菌营养基接种100~1000个100~500毫升的冯巴赫瓶中，每个瓶含有10~200克大米和10~200毫升蒸馏水，每个瓶中接种1.0~5.0毫升，于25℃下培养20~45天。
4.根据权利要求2所述的丁内酯类木脂素类化合物的制备方法，其特征在于B步骤中所述的有机溶剂为70~100%的丙酮、乙醇、乙酸乙酯或甲醇。
5.根据权利要求2所述的丁内酯类木脂素类化合物的制备方法，其特征在于C步骤中所述的混合有机溶剂为正己烷-丙酮、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯。
6.根据权利要求2或5所述的丁内酯类木脂素类化合物的制备方法，其特征在于所述的混合有机溶剂的体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2和0:1。
7.根据权利要求2所述的丁内酯类木脂素类化合物的制备方法，其特征在于D步骤中所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、石油醚或苯。
8.根据权利要求2所述的丁内酯类木脂素类化合物的制备方法，其特征在于E步骤中所述的甲醇水溶液的浓度为20%、30%、40%、50%、60%、70%和100%。
9.根据权利要求2所述的丁内酯类木脂素类化合物的制备方法，其特征在于F步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以50~70%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2×250 mm，5μm 的ZORBAX-C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为201，254 和280nm，每次进样45~60μL，收集15~35min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的丁内酯类木脂素类化合物。
10.一种权利要求1所述的丁内酯类木脂素类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
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