CN104292202A - 一种黄酮类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黄酮类化合物及其制备方法和应用，所述黄酮类化合物是从豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗(Desmodiumoxyphyllum)的全草中分离得到，命名为山蚂蝗素B，英文名为oxyphyllumflavoneB，其分子式为C22H18O6，具有下述结构：所述黄酮类化合物的制备方法，是以豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗的全草为原料，经浸膏提取、有机溶剂提取、MCI脱色、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤。所述应用为该黄酮类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。经对抗烟草花叶病毒的实验，本发明化合物对烟草花叶病毒的抑制率达56.5%，比阳性对照品南宁霉素的抑制率(29.6%)高，具有很好的抗烟草花叶病毒活性。本发明化合物结构简单活性好，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导性化合物，有良好的应用前景。

Description

一种黄酮类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物有效成分提取分离技术领域，具体涉及一种黄酮类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
豆科山蚂蝗属（学名Desmodium Desv.），约350种，多分布于亚热带和热带地区。我国有27种5变种，大部分布于西南经中南部至东南部，仅1种产陕、甘西南部。研究表明，该属植物富含黄酮类化合物，这类成分结构新颖多样，且具有广泛的药理活性，如抗肿瘤，抗病毒，抗菌等活性。山蚂蝗（Desmodium oxyphyllum ）是一种高30厘米至1.5米的半灌木。在民间广泛用于疏风清热，解毒消肿。主治温病发热、风湿骨痛、咳嗽、咯血和疮毒痈肿。本发明从尖叶山蚂蝗（Desmodium oxyphyllum ）中分离得到一个新的黄酮类化合物，该化合物具有显著的抗烟草花叶病毒活性。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种黄酮类化合物；第二目的在于提供所述黄酮类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述黄酮类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述黄酮类化合物是从豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗 (Desmodium oxyphyllum) 的全草中分离得到，命名为山蚂蝗素B，英文名为oxyphyllumflavone B，其分子式为C22H18O6，具有下述结构： 
本发明的第二目的是这样实现的，所述的黄酮类化合物的制备方法是以干燥的豆科植物山蚂蝗属尖叶山蚂蝗 (Desmodium oxyphyllum) 的全草为原料，经浸膏提取、有机溶剂提取、MCI脱色、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤而得到的，具体为：
A、浸膏提取：将豆科植物山蚂蝗属尖叶山蚂蝗 (Desmodium oxyphyllum) 的全草粉碎到20~40目，用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~60分钟，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；
C、MCI脱色：浸膏b用重量比3~5倍量的甲醇水溶解，上MCI柱，用80%-90%甲醇水洗脱，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏c；
D、硅胶柱一次层析：浸膏c用浸膏重量比6~10倍量的160~200目硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、硅胶柱二次层析：D步骤洗脱液的9:1部分进一步用重量比6~10倍量的160~200目硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的石油醚-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
F、高压液相色谱分离：E步骤洗脱液的8:2部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的黄酮类化合物。
以上述方法制备的黄酮类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：
本发明所述的黄酮类化合物为黄色胶状物，紫外光谱（溶剂为甲醇），λ max (logε）：372 (3.80), 285 (3.92), 210 (4.45) nm；红外光谱（溴化钾压片）νmax：3438, 1740, 1655, 1605, 1568, 1457, 1376, 1166, 1043, 878, 765 cm-1；高分辨质谱（HRESIMS）显示本发明化合物准分子离子峰m/z 401.1007 [M+Na]+（计算值为401.1001），结合13C 和1H NMR谱（图1和图2，碳谱氢谱数据归属见表1）给出其分子式为C22H18O6。从1H NMR（C5D5N，500 MHz）和13C NMR（CDCl3，125 MHz）中显示21个碳信号和16个氢信号。这些信号中有一个典型的黄酮骨架信号，即δ C 161.4 s, 107.0 d, 179.4 s, 142.7 s, 116.3 d, 162.1 s, 101.0 d, 158.4 s, 114.6 s, 120.6 s, 139.6 s, 130.9 s, 104.4 d, 160.8 s, 99.1 d以及氢谱中的δ H 6.48 s, 1H, 6.60 s, 1H, 7.52 s, and 7.03 s。这提示该化合物是一个黄酮类化合物。HMBC谱中观测到H-7′ (δ H 6.08 s)与C-1′ (δ C 120.6 s), C-2′ (δ C 139.6 s), C-3′ (δ C 130.9 s), C-8′ (δ C 155.1 s) 以及C-10′ (δ C 20.4 q)的相关, 同时，还观测到H-4′ (δ H 7.52 s)与C-9′ (δ C 162.9 s), C-2′ (δ C 139.6 s),和C-3′ (δ C 130.9 s)的相关，提示了丙基和酯基分别连接在C-2′和C-3′ 上，并且形成一个六元 6-methyl-α-pyrone环。其它片段也通过HMBC得到证实。其中，甲基信号δ H 2.28 s 与 C-5 (δ C 142.7 s), C-6 (δ C 116.3 d), 和C-10 (δ C 114.6 s) 相关，提示甲基联接在C-5上；而两个甲氧基信号δ H 3.90和3.94分别与C-7 (δ C 162.1 s)和C-5′ (δ C 160.8 s) 相关则提示甲氧基连接在C-7和C-5′。因此，该黄酮类化合物结构得以确定，并命名为山蚂蝗素B，英文名oxyphyllumflavone B。
表1 化合物的1H和13C NMR数据（溶剂为CDCl3）(125 and 500 MHz)
本发明的第三目的是这样实现的，即将所述黄酮类化合物应用于抗烟草花叶病毒药物的制备。
本发明黄酮类化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定为黄酮类化合物，并表征了其具体结构。经对抗烟草花叶病毒的实验，本发明化合物对烟草花叶病毒的抑制率达56.5%，比阳性对照品南宁霉素的抑制率(29.6%)高，具有很好的抗烟草花叶病毒活性。本发明化合物结构简单活性好，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导性化合物，有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明黄酮类化合物的核磁共振碳谱（13C NMR）；
图2为本发明黄酮类化合物的核磁共振氢谱（1H NMR）；
图3为本发明黄酮类化合物的主要HMBC相关图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明所述的黄酮类化合物是从豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗 (Desmodium oxyphyllum) 的全草中分离得到，命名为山蚂蝗素B，英文名为oxyphyllumflavone B，其分子式为C22H18O6，具有下述结构：
本发明所述的黄酮类化合物的制备方法，是以干燥的豆科植物山蚂蝗属尖叶山蚂蝗 (Desmodium oxyphyllum) 的全草为原料，经浸膏提取、有机溶剂提取、MCI脱色、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤而得到的，具体为：
A、浸膏提取：将豆科植物山蚂蝗属尖叶山蚂蝗 (Desmodium oxyphyllum) 的全草粉碎到20~40目，用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~60分钟，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；
C、MCI脱色：浸膏b用重量比3~5倍量的甲醇水溶解，上MCI柱，用80%-90%甲醇水洗脱，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏c；
D、硅胶柱一次层析：浸膏c用浸膏重量比6~10倍量的160~200目硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、硅胶柱二次层析：D步骤洗脱液的9:1部分进一步用重量比6~10倍量的160~200目硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的石油醚-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
F、高压液相色谱分离：E步骤洗脱液的8:2部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的黄酮类化合物。
所述A步骤中的有机溶剂为70~100%的丙酮、乙醇、甲醇中的任意一种。
所述B步骤中的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯中的任意一种。
所述C步骤中的甲醇水体积配比为8:2、8.5:1.5和9:1。
所述D步骤中浸膏c在经硅胶柱层析前，用重量比1.5~3倍量的甲醇或者丙酮溶解，用浸膏重量比0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样。
所述D步骤中氯仿-甲醇溶液体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5。
所述E步骤中石油醚-丙酮溶液体积配比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5。
所述F步骤中高效液相色谱分离纯化是以30~60%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2 mm × 250 mm，5μm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样45~60μL，收集20~35min的色谱峰，多次累加后蒸干。
本发明所述黄酮类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
本发明所述的山蚂蝗属植物不受地区和品种限制，均可以实现本发明。
实施例1
取干燥豆科植物山蚂蝗属山蚂蝗的全草1.5 kg，粗粉碎至40目，用70%的丙酮超声提取4次，每次60 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成120 g浸膏a；在浸膏a中加入240 g水，用与水等体积的氯仿萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成50 g浸膏b；浸膏b用MCI装柱，在浸膏b中加入100 g的80%甲醇水溶解，然后上柱，用90%甲醇水1至4升洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到30 g浸膏c；浸膏c用200目硅胶160 g装柱，在浸膏c中加入60 g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶60g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为20:1, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5的氯仿-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分，其中，体积比9:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液得第二部分样品2.5g，再重复硅胶柱层析，用体积比分别为9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到7个部分，其中第2部分，即8:2部分约860 mg, 再以50%的甲醇为流动相，流速10 ml/min，21.2×250mm，5μm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样48μL，收集26.4 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物山蚂蝗素B。
实施例2
取干燥豆科植物山蚂蝗属山蚂蝗的全草3 kg，粗粉碎至40目，用70%的丙酮超声提取4次，每次60 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成240 g浸膏a；在浸膏a中加入360 g水，用与水等体积的氯仿萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成100g浸膏b；浸膏b用MCI装柱，在浸膏b中加入150g的80%甲醇水溶解，然后上柱，用90%甲醇水2至6升洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到60 g浸膏c；浸膏c用200目硅胶320g装柱，在浸膏c中加入120g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶120g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为20:1, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5的氯仿-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分，其中，体积比9:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液得第二部分样品5g，再重复硅胶柱层析，用体积比分别为9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到7个部分，其中第2部分，即8:2部分约1.6g, 再以50%的甲醇为流动相，流速10 ml/min，21.2×250mm，5μm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样48 μL，收集26.4 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物山蚂蝗素B。
实施例3
取干燥豆科植物山蚂蝗属尖叶山蚂蝗的全草1.5kg，粗粉碎至40目，用80%的甲醇超声提取4次，每次50min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成150g浸膏a；在浸膏a中加入300g水，用与水等体积的氯仿萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成60g浸膏b；浸膏b用MCI装柱，在浸膏b中加入100g的80%甲醇水溶解，然后上柱，用90%甲醇水1至4升洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到35g浸膏c；浸膏c用200目硅胶160g装柱，在浸膏c中加入70g的甲醇溶解，然后加入100目硅胶60g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为20:1, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5的氯仿-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分，其中，体积比9:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液得第二部分样品3.2g，再重复硅胶柱层析，用体积比分别为9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到7个部分，其中第2部分，即8:2部分约860 mg, 再以50%的甲醇为流动相，流速10 ml/min，21.2×250mm，5μm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样48μL，收集26.4 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物山蚂蝗素B。
实施例4
取实施例1制备的化合物山蚂蝗素B，为黄色胶状物。
测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定出来的。
（1）紫外光谱（溶剂为甲醇），λ max (logε）：372 (3.80), 285 (3.92), 210 (4.45) nm； 
（2）红外光谱（溴化钾压片）νmax：3438, 1740, 1655, 1605, 1568, 1457, 1376, 1166, 1043, 878, 765 cm-1； 
（3）高分子质谱（HRESIMS）显示本发明化合物准分子离子峰m/z 401.1007 [M+Na]+（计算值为401.1001）。
结合13C 和1H NMR谱（见图1、图2，数据归属见表1）给出其分子式为C22H18O6。DEPT NMR谱(图1) 和1H NMR谱(图2) 中显示21个碳信号和16个氢信号。这些信号中有一个典型的黄酮骨架信号，即δ C 161.4 s, 107.0 d, 179.4 s, 142.7 s, 116.3 d, 162.1 s, 101.0 d, 158.4 s, 114.6 s, 120.6 s, 139.6 s, 130.9 s, 104.4 d, 160.8 s, 99.1 d以及氢谱中的δ H 6.48 s, 1H, 6.60 s, 1H, 7.52 s, and 7.03 s。这提示该化合物是一个黄酮类化合物。HMBC谱中观测到H-7′ (δ H 6.08 s)与C-1′ (δ C 120.6 s), C-2′ (δ C 139.6 s), C-3′ (δ C 130.9 s), C-8′ (δ C 155.1 s) 以及C-10′ (δ C 20.4 q)的相关, 同时，还观测到H-4′ (δ H 7.52 s)与C-9′ (δ C 162.9 s), C-2′ (δ C 139.6 s),和C-3′ (δ C 130.9 s)的相关，提示了丙基和酯基分别连接在C-2′和C-3′ 上，并且形成一个六元 6-methyl-α-pyrone环。其它片段也通过HMBC得到证实。其中，甲基信号δ H 2.28 s 与 C-5 (δ C 142.7 s), C-6 (δ C 116.3 d), 和C-10 (δ C 114.6 s) 相关，提示甲基联接在C-5上；而两个甲氧基信号δ H 3.90和3.94分别与C-7 (δ C 162.1 s)和C-5′ (δ C 160.8 s)相关则提示甲氧基连接在C-7和C-5′。因此，该黄酮类化合物结构得以确定，并命名为山蚂蝗素B。
实施例5
取实施例2制备的化合物，为黄色胶状物，测定方法与实施例4相同，确认实施例2制备的化合物为所述的黄酮类化合物山蚂蝗素B。
实施例6
取实施例3制备的化合物，为黄色胶状物，测定方法与实施例4相同，确认实施例3制备的化合物为所述的黄酮类化合物山蚂蝗素B。
实施例7
取实施例1~3制备的任一黄酮类化合物进行抗烟草花叶病毒活性试验，试验情况如下：
采用半叶法，在药剂的质量浓度均为50 mg/L时对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5～6龄烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先将叶片均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，立即放在盛有药液的培养皿中处理20 min，取出，擦去叶片上水珠和药液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保湿的玻璃缸中，并盖上玻璃盖，控温(23 ± 2)℃，放在温室自然光照射，2～3 d即可见枯斑．每个处理都设另一半叶为对照，另外设有1组为商品宁南霉素的处理作为对比，按下公式计算相对抑制率。
XI％=(CK-T)／CK×100％
X：相对抑制率(％)，CK：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，T浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。
结果表明本化合物的相对抑制率为56.5%，超过对照宁南霉素的相对抑制率29.6%，说明化合物有很好的抗烟草花叶病毒活性。

Claims (10)

1.一种黄酮类化合物，其特征在于所述化合物是从干燥的豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗 (Desmodium oxyphyllum) 的全草中分离得到，命名为山蚂蝗素B，英文名为oxyphyllumflavone B，其分子式为C22H18O6，具有下述结构：
。
2.一种权利要求1所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于以干燥的豆科植物山蚂蝗属尖叶山蚂蝗 (Desmodium oxyphyllum) 的全草为原料，经浸膏提取、有机溶剂提取、MCI脱色、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤而得到的，具体为：
A、浸膏提取：将豆科植物山蚂蝗属尖叶山蚂蝗 (Desmodium oxyphyllum) 的全草粉碎到20~40目，用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~60分钟，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；
C、MCI脱色：浸膏b用重量比3~5倍量的甲醇水溶解，上MCI柱，用80%-90%甲醇-水洗脱，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏c；
D、硅胶柱一次层析：浸膏c用浸膏重量比6~10倍量的160~200目硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、硅胶柱二次层析：D步骤洗脱液的9:1部分进一步用重量比6~10倍量的160~200目硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的石油醚-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
F、高压液相色谱分离：E步骤洗脱液的8:2部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的黄酮类化合物。
3.根据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述A步骤中的有机溶剂为70~100%的丙酮、乙醇、甲醇中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述B步骤中的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯中的任意一种。
5.根据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述C步骤中的甲醇-水体积配比为8:2、8.5:1.5和9:1。
6.根据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述D步骤中浸膏c在经硅胶柱层析前，用重量比1.5~3倍量的甲醇或者丙酮溶解，用浸膏重量比0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样。
7.据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述D步骤中氯仿-甲醇溶液体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5。
8.据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述E步骤中石油醚-丙酮溶液体积配比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5。
9.根据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述F步骤中高效液相色谱分离纯化是以30~60%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2 mm × 250 mm，5μm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样45~60μL，收集20~35min的色谱峰，多次累加后蒸干。
10.一种权利要求1所述黄酮类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
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