CN104650053A

CN104650053A - 一种结构新颖的黄酮类化合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN104650053A
Application number: CN201510101485.8A
Authority: CN
Inventors: 缪明明; 尚善斋; 陈永宽; 赵伟; 杨光宇; 汤建国; 段沅杏; 刘春波; 申钦鹏; 刘志华
Original assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Priority date: 2015-03-09
Filing date: 2015-03-09
Publication date: 2015-05-27
Anticipated expiration: 2035-03-09
Also published as: CN104650053B

Abstract

本发明公开了一种结构新颖的黄酮类化合物，其化学命名为6-羟基-8-((4-羟基-6-甲基-2-氧代-2氢-吡喃-3-基)甲基)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-4氢-色烯-4-酮，其分子式为C₂₄H₂₀O₈，本发明还公开了上述化合物的用途，经活性测试表明，其对烟草花叶病毒具有很好的抑制作用。本发明化合物结构新颖，为首个具有4-羟基-6-甲基-2-氧代-2氢-吡喃-3-基)甲基)结构片段的天然黄酮类化合物，且具有较好的抗烟草花叶病毒活性较好，可作为抗烟草花叶病毒的先导化合物用于抗烟草花叶病毒的农药制剂研发。

Description

一种结构新颖的黄酮类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种源于烟草的黄酮类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

烟草是世界上化学成分最为复杂的植物，次生代谢产物非常丰富，据1982年Dube和Green等报道，烟草中已鉴定出的化学成分就超过2549种，到2008年，Rodgman和perfetti的报道称，烟草、烟草代用品以及卷烟烟气中发现的化合物总数大约为8700种。目前，人们从烟草中鉴定出来的单体化学物质就超过3000多种，而且还有许多成分尚未鉴定出来。烟草除主要用于卷烟抽吸用途外，还可从中提取多种有利用价值的化学成分，从中发现有开发利用价值的先导性化合物。

黄酮(flavone)，是黄酮类化合物的总称，泛指两个具有酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物。研究表明，黄酮类化合物具有心血管系统活性、抗菌及抗病毒活性、抗肿瘤活性、抗氧化自由基活性、抗炎、镇痛、抗变态等多种药理活性。同时已有研究证实，其药理作用与化学结构密切相关，为了研究这类化合物的构效关系，可进一步研究和开发更多的黄酮类化合物，从中寻找有效的先导化合物和活性基团。本发明从烟草中分离得到了一种具有抗烟草花叶病毒活性的黄酮类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道，值得一提的是该化合物是首次分到的具有4-羟基-6-甲基-2-氧代-2氢-吡喃-3-基)甲基【英文名(4-hydroxy-6-methyl-2-oxo-2H-pyran-3-yl)methyl】结构片段的天然黄酮类化合物。

发明内容

本发明的第一方面在于提供一种结构新颖的黄酮类化合物，其分子式为C₂₄H₂₀O₈，经过分析化学鉴定，其具有下述结构：

根据有机化合物的IUPAC系统命名法，该化合物被命名为6-羟基-8-((4-羟基-6-甲基-2-氧代-2氢-吡喃-3-基)甲基)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-4氢-色烯-4-酮。

该化合物为橘黄色粉末，本发明人将其命名为“烟草黄酮己素”，并将其英文名称命名为：Tobaflavone F。

本发明的第二方面提供了上述第一方面所述的黄酮类化合物的制备方法，该方法包括如下步骤：

a.制备烟草提取物浸膏：以烟草叶片为原料，将其粉碎并用第一溶剂浸泡并提取所述烟草2～4次，每次12h～72h，将提取液合并、过滤并浓缩后得到所述烟草提取物浸膏；其中所述第一溶剂是选自乙醇、甲醇或丙酮的有机溶剂与水的混合物，其中有机溶剂占该第一溶剂的60wt％～100wt％，且第一溶剂：烟草＝1.5～4:1，重量比；

b.硅胶柱层析：将上述烟草提取物浸膏用选自纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮的第二溶剂溶解后与为烟草提取物浸膏的1～1.6重量倍的60～120目硅胶拌样，将拌样后的混合物再与为烟草提取物浸膏的2～5重量倍的160～300目硅胶混合后干法装柱，然后用体积比依次为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5的一系列氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，收集其中用体积比为9:1的氯仿-甲醇溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第一洗脱液；将上述第一洗脱液用硅胶层析柱继续分离，用体积比依次为15:1、10:1、5:1:、2:1的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，将其中体积为10:1的氯仿-丙酮溶液洗脱时得到的洗脱液称为第二洗脱液。将上述第二洗脱液用硅胶柱层析继续分离，用体积比依次为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的石油醚-乙酸乙酯溶液进行梯度洗脱，将其中体积比为7:3的石油醚-乙酸乙酯洗脱时得到的洗脱液称为第三洗脱液；

c.高压液相色谱分离：将上述第三洗脱液通入高压液相色谱进行分离纯化，该高压液相色谱采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流动相为60wt％的甲醇水溶液，流动相流速为12mL/min，紫外检测器检测波长为374nm，第三洗脱液液每次进样60～150μL，收集每次进样后色谱峰保留时间为31min时所对应的洗脱液，称为第四洗脱液，将该第四洗脱液脱除溶剂后即得所述黄酮类化合物。

前述高压液相色谱是指使用时压力在5-15Mpa的反相制备色谱。

在优选的实施方案中，本发明还包括以下进一步提纯的步骤：将在所述高压液相色谱分离之后得到的所述黄酮类化合物再次溶于甲醇溶液，并以甲醇溶液的为流动相，通过凝胶柱进行层析分离，提到进一步提纯的所述黄酮类化合物。

本发明的第三方面提供了第一方面所述的黄酮类化合物在制备抗烟草花叶病药物中的用途。

附图说明

图1为本发明的新型黄酮类化合物的核磁共振碳谱。

图2为本发明的新型黄酮类化合物的核磁共振氢谱。

图3为现有技术已知的化合物6-羟基-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(6-hydroxy-7-methoxy-2-(4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one)的结构。

图4为本发明的新型黄酮类化合物的主要¹H-¹H COSY和HMBC相关图示。

图5为本发明的新型黄酮类化合物的结构式。

具体实施方式

本发明所制备的新型黄酮类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：本发明化合物为橘黄色粉末；紫外光谱(溶剂为甲醇),λ_max(logε)210(4.36),266(3.82),374(3.68)nm；红外光谱(溴化钾压片)ν_max3452,2924,2615,1668,1612,1516,1437,1316,1247,1182,1083,1022,868,722cm^-1；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰m/z 459.1062[M+Na]⁺(计算值459.1056)。结合¹H和¹³CNMR谱给出分子式C₂₄H₂₀O₈，不饱和度为15。紫外、红外和核磁数据(表1)表明，该化合物可能是一个黄酮类化合物。¹H NMR和¹³C NMR谱(表1)显示显示20个碳原子和18个质子信号，包括：一个1,4-二取代的苯环信号[δ_C123.0(s,C-1'),130.6(d,C-2',6'),116.4(d,C-3',5'),161.5(s,C-4')；δ_H7.72(d,J＝8.6Hz,H-2',6'),6.83(d,J＝8.6Hz,H-3',5')]，一个1,2,3,4,5-五取代的苯环信号[δ_C115.8(d,C-5),140.3(d,C-6),158.3(s,C-7),119.6(s,C-8),150.1(s,C-9),117.2(s,C-10)；δ_H7.10(s,H-5)]，两个甲氧基信号[δ_C61.2(q,-OMe-7),δ_H3.85(s,-OMe-7)；δ_C56.1(q,-OMe-7),δ_H3.80(s,-OMe-4′)]，一个非氧化甲基[δ_C20.2(q,C-7″),δ_H2.20(s,H-7″)，一个亚甲基信号[δ_C16.6(t,C-1″)；δ_H3.21(d,J＝14.8Hz,H_a-1″),3.25(d,J＝14.8Hz,H_b-1″)]。详细分析其核磁数据，发现其与化合物6-羟基-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮具有很大的相似性，其主要区别在于所述黄酮类化合物相比增加了一个(4-羟基-6-甲基-2-氧代-2氢-吡喃-3-基)甲基【即(4-hydroxy-6-methyl-2-oxo-2H-pyran-3-yl)methyl】结构片断(C-1″～C-7″；H-1″,H-5″,H-7″,和4″-OH)(结构推到见图4中HMBC相关)。从H-1″到C-7、C-8和C-9的HMBC相关表明该(4-羟基-6-甲基-2-氧代-2氢-吡喃-3-基)甲基)结构片断与C-8相连。其它二维相关进一步证明六元内酯环以外其它部分的结构(图4)。至此，本化合物的结构得以确定。发明人将其命名为烟草黄酮己素，英文名称为Tobaflavone F。注：上述根据NMR谱图进行结构解析过程中，使用的碳原子编号规则是天然产物化学中的另一套编号规则，该编号规则虽然与IUPAC系统命名法中的碳原子编号规则有所不同，但在谱图解析中却更方便，因此，本文中所有谱图和谱图解析中采用了此编号规则。无论采用何种编号规则，都不影响本发明的化合物的结构解析和确定。

表1.化合物的¹H NMR和¹³C NMR数据(CDCl₃)

本发明化合物是首次被分离出来的，通过上述核磁共振和质谱测定方法确定了为黄酮类化合物，并表征了其具体结构。经对抗烟草花叶病毒的实验，其相对抑制率达到39.6％，具有很好的抗烟草花叶病毒活性，以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗烟草花叶病毒药物研发的先导性化合物用于抗烟草花叶病毒的农药制剂研发。

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

本发明所用原料不受地区和品种限制，任何来源的烟草均可以实现本发明，下面以来源于云南中烟工业有限责任公司的烟草原料对本发明做进一步说明。除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

实施例1

烟草样品来源于云南玉溪，品种为K326。将烟草取样3.0kg粉碎以70％的丙酮/水提取3次，每次提取24h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏150g。浸膏用重量180g的纯甲醇溶解后用200g的80目粗硅胶拌样，1.0kg的160目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇梯度洗脱，将其中体积配比为9:1的氯仿-甲醇洗脱部分进一步用体积比依次为15:1、10:1、5:1、2:1的一系列氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，将上述10:1洗脱梯度洗脱液继续用硅胶柱层析继续分离，洗脱液为石油醚-乙酸乙酯(洗脱梯度：9:1、8:2、7:3、6:4、5:5)，其中7:3洗脱梯度洗脱继续用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以60％的甲醇水溶液为流动相，Zorbax SB-C₁₈(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流动相流速为12ml/min，紫外检测器检测波长为374nm，每次进样75μL，收集停留时间为31.0min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本发明所述的黄酮类化合物。

实施例2

烟草样品来源于云南昆明，品种为红花大金元，将烟草取样3.0kg切碎，以95％的乙醇提取3次，每次提取48h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏140g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用150g的80目粗硅胶拌样，0.9kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇梯度洗脱，将其中体积配比为9:1的氯仿-甲醇洗脱部分进一步用为15:1-2:1的一系列氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱(例如15:1、10:1、5:1:、2:1)，将上述10:1洗脱梯度洗脱液继续用硅胶柱层析继续分离，洗脱液为石油醚-乙酸乙酯(洗脱梯度：9:1、8:2、7:3、6:4、5:5)，其中7:3洗脱梯度洗脱继续用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以60％的甲醇水溶液为流动相，Zorbax SB-C₁₈(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流动相流速为12ml/min，紫外检测器检测波长为374nm，每次进样100μL，收集停留时间为31.0min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本发明所述的黄酮类化合物。为了进一步提纯，还可以将所得产物用甲醇溶液溶解，再以甲醇溶液为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得更高纯度的该新化合物。

实施例3

取实施例1制备的化合物，为橘黄色粉末。

本发明所制备的新型黄酮类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：本发明化合物为橘黄色粉末；紫外光谱(溶剂为甲醇),λ_max(logε):210(4.36),266(3.82),374(3.68)nm；红外光谱(溴化钾压片)v_max:3452,2924,2615,1668,1612,1516,1437,1316,1247,1182,1083,1022,868,722cm^-1；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰m/z 459.1062[M+Na]⁺(计算值459.1056)。结合¹H和¹³CNMR谱给出分子式C₂₄H₂₀O₈，不饱和度为15。紫外、红外和核磁数据(表1)表明，该化合物可能是一个黄酮类化合物。¹H NMR和¹³C NMR谱(表1)显示显示20个碳原子和18个质子信号，包括：一个1,4-二取代的苯环信号[δ_C123.0(s,C-1'),130.6(d,C-2',6'),116.4(d,C-3',5'),161.5(s,C-4')；δ_H7.72(d,J＝8.6Hz,H-2',6'),6.83(d,J＝8.6Hz,H-3',5')]，一个1,2,3,4,5-五取代的苯环信号[δ_C115.8(d,C-5),140.3(d,C-6),158.3(s,C-7),119.6(s,C-8),150.1(s,C-9),117.2(s,C-10)；δ_H7.10(s,H-5)]，两个甲氧基信号[δ_C61.2(q,-OMe-7),δ_H3.85(s,-OMe-7)；δ_C56.1(q,-OMe-7),δ_H3.80(s,-OMe-4′)]，一个非氧化甲基[δ_C20.2(q,C-7″),δ_H2.20(s,H-7″)，一个亚甲基信号[δ_C16.6(t,C-1″)；δ_H3.21(d,J＝14.8Hz,H_a-1″),3.25(d,J＝14.8Hz,H_b-1″)]。详细分析其核磁数据，发现其与化合物6-羟基-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮具有很大的相似性，其主要区别在于所述黄酮类化合物相比增加了一个(4-羟基-6-甲基-2-氧代-2氢-吡喃-3-基)甲基结构片断(C-1″～C-7″；H-1″,H-5″,H-7″,和4″-OH)(结构推到见图4中HMBC相关)。从H-1″到C-7、C-8和C-9的HMBC相关表明该(4-羟基-6-甲基-2-氧代-2氢-吡喃-3-基)甲基结构片断与C-8相连。其它二维相关进一步证明六元内酯环以外其它部分的结构(图4)。至此，本化合物的结构得以确定。命名为烟草黄酮己素，英文名称为Tobaflavone F。

实施例4

取实施例2制备的化合物，为橘黄色粉末。测定方法与实施例3相同，确认实施例2制备的化合物为所述的黄酮类化合物——烟草黄酮己素。

实施例5

取实施例1～2制备的任一黄酮类化合物进行抗烟草花叶病毒活性试验，试验情况如下：

采用半叶法，在本发明的化合物的质量浓度均为50mg/L下对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5～6龄烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先在叶片上均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10^-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，将该测试用的叶片分为两个半叶，其中一个半叶放在盛有药液的培养皿中处理20min，取出，擦去该半叶上水珠和药液，作为考察药液的抗病毒活性的实验样品，而另一半叶则未浸入药液中，而是仅浸入清水中，作为对照样品。将分别作为实验样品和对照样品的上述两个半叶复原，排放在铺有卫生纸保湿的玻璃缸中，并盖上玻璃盖，控温(23±2)℃，放在温室自然光照射，2～3d即在各半叶上看见枯斑，记录在各半叶上的枯斑的数目，按下公式计算相对抑制率。

X％＝(CK-T)/CK×100％

X：相对抑制率(％)，CK：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，T浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。

结果表明，本化合物的相对抑制率为39.6％，具有较好的抗烟草花叶病毒活性，以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗烟草花叶病毒药物研发的先导性化合物用于抗烟草花叶病毒的农药制剂研发。

Claims

1.一种黄酮类化合物，其化学命名为6-羟基-8-((4-羟基-6-甲基-2-氧代-2氢-吡喃-3-基)甲基)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-4氢-色烯-4-酮，其分子式为C₂₄H₂₀O₈，且具有下述结构：

。

2.一种权利要求1所述的黄酮类化合物的制备方法，其包括以下步骤:先制备烟草提取物浸膏，再用硅胶柱层析法处理所述烟草提取物浸膏以得到洗脱液，然后使该洗脱液经过高压液相色谱分离，以得到所述黄酮类化合物。

3.一种权利要求1所述的黄酮类化合物的制备方法，其包括以下步骤:

b.硅胶柱层析：将上述烟草提取物浸膏用选自纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮的第二溶剂溶解后与为烟草提取物浸膏的1～1.6重量倍的60～120目硅胶拌样，将拌样后的混合物再与为烟草提取物浸膏的2～5重量倍的160～300目硅胶混合后干法装柱，然后用体积比依次为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5的一系列氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，收集其中用体积比为9:1的氯仿-甲醇溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第一洗脱液；将上述第一洗脱液用硅胶层析柱继续分离，用体积比依次为15:1、10:1、5:1:、2:1的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，将其中体积为10:1的氯仿-丙酮溶液洗脱时得到的洗脱液称为第二洗脱液。将上述第二洗脱液用硅胶柱层析继续分离，用体积比依次为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5 的石油醚-乙酸乙酯溶液进行梯度洗脱，将其中体积比为7:3的石油醚-乙酸乙酯洗脱时得到的洗脱液称为第三洗脱液。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述高压液相色谱是指使用时压力在5-15Mpa的反相制备色谱。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其还包括以下进一步提纯的步骤：将在所述高压液相色谱分离之后得到的所述黄酮类化合物再次溶于甲醇溶液，并以甲醇溶液的为流动相，通过凝胶柱进行层析分离，提到进一步提纯的所述黄酮类化合物。

6.根据权利要求1所述的黄酮素类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的用途。