CN105085193B - 一种新型倍半萜类化合物、其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种结构新颖的倍半萜类化合物，该化合物命名为5‑(3‑羟基丙基)‑2,2,6‑三甲基‑2,3‑二氢‑1H‑茚‑4‑醇，其分子式为C₁₅H₂₂O₂，具有下述结构。本发明还公开了上述化合物的用途，经活性测试表明，其对烟草花叶病毒具有很好的抑制作用，可作为抗烟草花叶病毒的先导化合物用于抗烟草花叶病毒药物制剂研发。

Description

一种新型倍半萜类化合物、其制备方法和用途

技术领域

本发明属于烟草化学技术领域，具体涉及一种从烟草中首次提取得到的倍半萜类化合物。同时，本发明还涉及该化合物的制备方法和在抗烟草花叶病毒中的应用。

背景技术

烟草是世界上化学成分最为复杂的植物，次生代谢产物非常丰富，经过几十年的研究，人们目前从烟草中鉴定出来的单体化学物质就超过3000多种，而且还有许多成分尚未鉴定出来。虽然吸烟有害健康已得到广泛认可，但烟草仍然对成千上万的消费者有着强大的吸引力，除尼古丁的成瘾性外，烟草中丰富的香味物质也发挥着重要作用。倍半萜(sesquiterpenes)是指分子中含15个碳原子的天然萜类化合物。倍半萜类化合物分布较广，在植物体内常以醇、酮、内酯等等形式存在于挥发油中，是挥发油中高沸点部分的主要组成部分。多具有较强的香气和生物活性，是医药、食品、化妆品工业的重要原料。为了研究这类化合物的构效关系，可进一步研究和开发更多的倍半萜类化合物，并从中寻找有效的先导化合物和活性基团。本发明从云南烤烟烟叶中分离得到了一种新的倍半萜类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道，值得一提的是该化合物具有显著的抗烟草花叶病病毒活性。

发明内容

本发明的第一方面在于提供一种新的倍半萜类化合物，该化合物从云南烤烟烟叶中分离得到，其分子式为C₁₅H₂₂O₂，经过分析化学鉴定，其具有下述结构：

按IUPAC系统命名法将其命名为：5-(3-羟基丙基)-2,2,6-三甲基-2,3-二氢-1H-茚-4-醇。

该化合物为浅黄色胶状物，本发明人将其英文名命名为5-(3-hydroxypropyl)-2,2,6-trimethyl-2,3-dihydro-1H-inden-4-ol。

本发明的第二方面提供了上述第一方面所述的倍半萜类化合物的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)制备烟草提取物浸膏：以烟草叶片为原料，将其粉碎或切成小段，并用第一溶剂浸泡并提取所述烟草3～5次，每次24h～72h，将提取液合并、过滤并浓缩后得到所述烟草提取物浸膏；其中所述第一溶剂是选自甲醇、乙醇或丙酮的有机溶剂与水的混合物，其中有机溶剂占该第一溶剂的60wt％～100wt％，且第一溶剂：烟草＝2～4:1，重量比；

(2)硅胶柱层析：将上述烟草提取物浸膏用选自纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮的第二溶剂溶解后与为烟草提取物浸膏的0.8～1.2重量倍的60～120目硅胶拌样，将拌样后的混合物再与为烟草提取物浸膏的2～4重量倍的160～300目硅胶混合后干法装柱，然后用体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，将其中体积为8:2的氯仿-丙酮溶液洗脱时得到的洗脱液称为第一洗脱液。

(3)超临界流体色谱分离纯化：将上述第一洗脱液通入超临界流体色谱进行分离纯化，该超临界流体色谱采用10mm×150mm，5μm的Silica 2-EP色谱柱，流动相二氧化碳/甲醇(90/10％，质量比)，流动相流速为25mL/min，紫外检测器检测波长为260nm，第一洗脱液液每次进样200～500μL，收集每次进样后色谱峰保留时间为12.10min时所对应的洗脱液，称为第二洗脱液，将该第二洗脱液脱除溶剂后即得所述倍半萜化合物。

在优选的实施方案中，本发明还包括以下进一步提纯的步骤：将在所述高压液相色谱分离之后得到的所述倍半萜化合物再次溶于甲醇溶液，并以甲醇溶液的为流动相，通过凝胶柱进行层析分离，提到进一步提纯的所述倍半萜化合物。

本发明的第三方面提供了第一方面所述的倍半萜类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的用途。

附图说明

图1为本发明倍半萜类化合物的核磁共振碳谱；

图2为本发明倍半萜类化合物的核磁共振氢谱；

图3为本发明倍半萜类化合物的主要HMBC相关图示。

具体实施方式

本发明所制备的倍半萜类化合物的结构通过以下方法测定出来的。本发明化合物为浅黄色胶状物；紫外光谱(溶剂为甲醇),λ_max(logε)210(4.17),252(3.56)nm；红外光谱(溴化钾压片)ν_max 3386,2926,1605,1538,1446,1142,1057,857cm^-1；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰m/z 233.1549[M-H]^-(计算值233.1542)。结合¹H和¹³C NMR谱给出一个分子式C₁₅H₂₂O₂，不饱和度为5。其红外光谱显示有羟基(3386cm^-1)和苯环(1605,1538,1446cm^-1)功能团；紫外光谱在252nm处有强吸收，也证实化合物中存在共轭结构。从¹H和¹³CNMR谱(数据归属见表-1)信号可以看出化合物中有一个1,2,3,4,5-五取代的苯环、一个3-羟基丙基、三个甲基、两个亚甲基、一个季碳；除去苯环的不饱和度4，化合物中还应有一个环。根据H-3和C-2、C-4、C-8、C-9、C-13,14，以及H-1和C-2、C-3、C-7、C-8、、C-13,14的HMBC相关(图-3)可证实C-1、C-2、C-3和C-13,14苯环间形成了一个偕二甲基的5元碳环，该化合物应为偕二甲基二氢茚结构。化合物的母核确定后，剩余的甲基、3-羟基丙基和羟基为母核上的取代基。根据H-10和C-4、C-5、C-6，H-11和C-5的HMBC相关可证实3-羟基丙基取代在母核的C-5位；根据H-15和C-5、C-6和C-7，以及H-7和C-15的HMBC相关，可证实该甲基取代在母核的C-6位；根据酚羟基氢和C-4、C-5和C-9的HMBC相关，可证实酚羟基取代在母核的C-7位。至此本化合物的结构得以确定。

表1.化合物的¹H NMR和¹³C NMR数据(CCl₃)

本发明化合物是首次被分离出来的，通过上述核磁共振和质谱测定方法确定为倍半萜类化合物，并表征了其具体结构。采用半叶法进行了本发明化合物的抗烟草花叶病毒活性测试，结果明本化合物的相对抑制率为41.2％，超过了阳性对照宁南霉素的相对抑制率31.5％，说明化合物有很好的抗烟草花叶病毒活性。活性检测结果揭示了本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单、活性较好，可作为抗烟草花叶病毒药物研发的先导性化合物用于抗烟草花叶病毒药物制剂研发。

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

本发明所用原料不受地区和品种限制，任何来源地的晾晒烟均可以实现本发明，下面以来源于云南中烟工业有限责任公司的烟草原料对本发明做进一步说明。除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

实施例1

烟草样品来源于云南玉溪，品种为玉溪K326。将烟草取样2.0kg粉碎以95％的甲醇提取5次，每次提取24h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏105g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用120g的100目粗硅胶拌样，0.4kg的160目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，薄层色谱(TLC)监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酮洗脱部分用沃特斯SFC 80Q超临界流体制备色谱分离，以二氧化碳/甲醇为流动相(90/10％，质量比)，Silica2-EP(10mm×150mm，5μm)制备柱为固定相，流动相流速为25mL/min，紫外检测器检测波长为260nm，每次进样200μL，收集每次进样后色谱峰保留时间为12.10min时所对应的洗脱液，多次累加后蒸干，即得本发明所述的倍半萜化合物粗品；该粗品再用纯甲醇溶解，以纯甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱层析纯化可得纯品。

实施例2

烟草样品来源于云南大理，品种为云烟200，将烟草取样3.5kg切碎，以95％的乙醇提取4次，每次提取48h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏250g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用250g的80目粗硅胶拌样，0.5kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酮洗脱部分用沃特斯SFC 80Q超临界流体制备色谱分离，以二氧化碳/甲醇为流动相(90/10％，质量比)，Silica 2-EP(10mm×150mm，5μm)制备柱为固定相，流动相流速为25mL/min，紫外检测器检测波长为260nm，每次进样200μL，收集每次进样后色谱峰保留时间为12.10min时所对应的洗脱液，多次累加后蒸干，即得本发明所述的倍半萜化合物粗品；该粗品再用纯甲醇溶解，以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析纯化可得更高纯度的该新化合物。

实施例3

烟草样品来源于云南昆明，品种为红花大金元，将烟草取样5kg粉碎，以75％的丙酮用超声提取3次，每次提取72h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏380g。浸膏用重量比1.6倍量的纯甲醇溶解后用400g的90目粗硅胶拌样，2.4kg的180目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酮洗脱部分用沃特斯SFC 80Q超临界流体制备色谱分离，以二氧化碳/甲醇为流动相(90/10％，质量比)，Silica2-EP(10mm×150mm，5μm)制备柱为固定相，流动相流速为25mL/min，紫外检测器检测波长为260nm，每次进样200μL，收集每次进样后色谱峰保留时间为12.10min时所对应的洗脱液，多次累加后蒸干，即得本发明所述的倍半萜化合物粗品；该粗品再用纯甲醇溶解，以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析纯化可得更高纯度的该新化合物。

实施例4

取实施例1制备的化合物，为浅黄色胶状物。

本发明所制备的倍半萜类化合物的结构通过以下方法测定出来的。本发明化合物为浅黄色胶状物；紫外光谱(溶剂为甲醇),λ_max(logε)210(4.17),252(3.56)nm；红外光谱(溴化钾压片)ν_max 3386,2926,1605,1538,1446,1142,1057,857cm^-1；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰m/z 233.1549[M-H]^-(计算值233.1542)。结合¹H和¹³C NMR谱给出一个分子式C₁₅H₂₂O₂，不饱和度为5。其红外光谱显示有羟基(3386cm^-1)和苯环(1605,1538,1446cm^-1)功能团；紫外光谱在252nm处有强吸收，也证实化合物中存在共轭结构。从¹H和¹³CNMR谱(数据归属见表-1)信号可以看出化合物中有一个1,2,3,4,5-五取代的苯环、一个3-羟基丙基、三个甲基、两个亚甲基、一个季碳；除去苯环的不饱和度4，本发明化合物中还应有一个环。根据H-3和C-2、C-4、C-8、C-9、C-13,14，以及H-1和C-2、C-3、C-7、C-8、、C-13,14的HMBC相关(图-3)可证实C-1、C-2、C-3和C-13,14苯环间形成了一个偕二甲基的5元碳环，本发明化合物应为偕二甲基二氢茚结构。化合物的母核确定后，剩余的甲基、3-羟基丙基和羟基为母核上的取代基。根据H-10和C-4、C-5、C-6，H-11和C-5的HMBC相关可证实3-羟基丙基取代在母核的C-5位；根据H-15和C-5、C-6和C-7，以及H-7和C-15的HMBC相关，可证实该甲基取代在母核的C-6位；根据酚羟基氢和C-4、C-5和C-9的HMBC相关，可证实酚羟基取代在母核的C-7位。至此本化合物的结构得以确定。

实施例5

取实施例2制备的化合物，为黄色胶状物。测定方法与实施例4相同，确认实施例2制备的化合物为所述的倍半萜类化合物——5-(3-羟基丙基)-2,2,6-三甲基-2,3-二氢-1H-茚-4-醇。

实施例6

取实施例3制备的化合物，为黄色胶状物。测定方法与实施例4相同，确认实施例3制备的化合物为所述的5-(3-羟基丙基)-2,2,6-三甲基-2,3-二氢-1H-茚-4-醇。

实施例7

取实施例1-3制备的任一倍半萜类化合物进行抗烟草花叶病毒活性试验，试验情况如下：

采用半叶法，在药剂的质量浓度均为50mg/L时对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5～6龄烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先将叶片均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10^-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，立即放在盛有药液的培养皿中处理20min，取出，擦去叶片上水珠和药液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保湿的玻璃缸中，并盖上玻璃盖，控温(23±2)℃，放在温室自然光照射，2～3d即可见枯斑.每个处理都设另一半叶为对照，另外设有1组为商品宁南霉素的处理作为对比，按下公式计算相对抑制率。

XI％＝(CK-T)/CK×100％

X：相对抑制率(％)，CK：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，T浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。

结果明本化合物的相对抑制率为41.2％，超过对照宁南霉素的相对抑制率31.5％，说明化合物有很好的抗烟草花叶病毒活性。

Claims (2)

1.一种具有下述结构式的倍半萜类化合物：

该化合物的命名为5-(3-羟基丙基)-2,2,6-三甲基-2,3-二氢-1H-茚-4-醇，其分子式为C₁₅H₂₂O₂。

2.根据权利要求1所述的倍半萜类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的用途。