CN104262317B - 一种二聚单萜类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
一种二聚单萜类化合物及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种二聚单萜类化合物及其制备方法与应用，所述的二聚单萜类化合物是从傣药毛叶三条筋中分离得到，其分子式为C20H22O4，具有下述结构：。所述的制备方法是以傣药毛叶三条筋为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤得到。本发明的应用为所述的二聚单萜类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。本发明化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定了为二聚单萜类化合物，并表征了其具体结构。本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性好，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导性化合物。
Description
技术领域
本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种二聚单萜类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
傣药毛叶三条筋Undera Caudata，为樟科(肠班aceae) 山胡椒属 (hndera) 植物，别名香面叶，黄脉山胡椒、朴香根、芽三英(傣名)，为云南西双版纳州傣族人民常用的植物药，生于海拔700 - 2300 m的山坡、灌木、疏林中，资源丰富，收载于《中药大辞典》。具有止血生肌，除风通血止痛，接骨续筋等功效。单萜(monoterpenoids) 是萜类化合物之一种。通常指由二分子异戊二烯聚合而成的萜类化合物及其含氧的和饱和程度不等的衍生物。单萜按分子的基本碳骨架分为：无环单萜、单环单萜、双环单萜及三环单萜四大类。除三环单萜天然成分数目较少外，其他三类均有许多天然成分存在，主要存在于各种挥发油中。单萜类化合物广泛存在于高等植物中的分泌组织里，多数是挥发油中沸点较低部分的主要组成部分，其含氧衍生物沸点较高，多数具有较强的香气和生理活性，是医药、仪器和化妆品工业的重要原料。本发明从傣药毛叶三条筋中分离得到了一种具有抗烟草花叶病毒活性的二聚单萜类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种二聚单萜类化合物；第二目的在于提供所述二聚单萜类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述二聚单萜类化合物的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的二聚单萜类化合物是从傣药毛叶三条筋中分离得到，其分子式为C20H22O4，具有下述结构：
。
本发明的第二目的是这样实现的，是以傣药毛叶三条筋为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤，具体为：
A、浸膏提取：取毛叶三条筋，经粉碎或切成小段，加入重量比2~4倍的质量百分比70~100%有机溶剂浸泡提取3~5次，每次24~72h，合并提取液，过滤浓缩成浸膏；
B、硅胶柱层析：浸膏用重量比2~5倍量的160~300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析，以体积比1:0~0:1的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；
C、高压液相色谱分离：B步骤洗脱液的9:1部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的二聚单萜类化合物。
以上述方法制备的二聚单萜类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：
本发明化合物为白色固体；紫外光谱 (溶剂为甲醇),λmax (logε) 210 (3.28)、238 (2.15)、308 (1.87) nm；红外光谱 (溴化钾压片) νmax 3428、2968、2865, 1762、1735、1675、1610、1528、1467、1418、1253、1327、1138, 924, 871 cm-1；高分辨质谱 (HRESIMS) 给出准分子离子峰m/z 349.1412 [M+Na]+ (计算值349.1416)。结合1H和13C NMR谱给出一个分子式C20H22NaO4，不饱和度为10。从1H和13CNMR谱 (数据归属见表-1) 信号可以看出该化合物中具有3个羰基、4组双键、2个次甲基、2个亚甲基、1个氧化的季碳、4个甲基；根据化合物的不饱和度，该化合物应该有3个环；进一步通过HSQC相关和HMBC相关 (图-3) 可确定化合物中碳、氢之间的联接，并确定化合物的结构。
表-1.化合物的1H NMR 和13C NMR 数据 (CDCl3)
本发明的第三目的是这样实现的，所述的二聚单萜类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
本发明化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定了为二聚单萜类化合物，并表征了其具体结构。经对抗烟草花叶病毒的实验，其相对抑制率达到38.5%，具有很好的抗烟草花叶病毒活性，超过阳性对照品南宁霉素的相对抑制率（30.6%）。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性好，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导性化合物。
附图说明
图1为化合物的核磁共振碳谱；
图2为化合物的核磁共振氢谱；
图3为化合物的主要1H-1H COSY 和HMBC相关。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
本发明所述的二聚单萜类化合物，是从傣药毛叶三条筋中分离得到，其分子式为C20H22O4，具有下述结构：
。
本发明所述的二聚单萜类化合物的制备方法，是以傣药毛叶三条筋为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤，具体为：
A、浸膏提取：取毛叶三条筋，经粉碎或切成小段，加入重量比2~4倍的质量百分比70~100%有机溶剂浸泡提取3~5次，每次24~72h，合并提取液，过滤浓缩成浸膏；
B、硅胶柱层析：浸膏用重量比2~5倍量的160~300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析，以体积比1:0~0:1的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；
C、高压液相色谱分离：B步骤洗脱液的9:1部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的二聚单萜类化合物。
A步骤中所述的毛叶三条筋为樟科植物香面叶的树皮。
A步骤中所述的有机溶剂为质量百分比80~100%的甲醇、质量百分比80~100%的乙醇或质量百分比70~100%的丙酮中的一种。
B步骤中所述的浸膏在经硅胶柱层析粗分前，用重量比1.5~3倍量的纯甲醇或纯乙醇或纯丙酮溶解后用重量比0.8~1.5倍的80~100目硅胶拌样。
B步骤中所述的氯仿-丙酮溶液体积配比为1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和0:1。
C步骤中所述的高压液相色谱分离纯化是采用21.2 mm×250mm，5μm的C18色谱柱，流速为20mL/min，流动相为60%的甲醇，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200μL，收集22.8min的色谱峰，多次累加后蒸干。
所述的高压液相色谱分离纯化步骤后，所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。
本发明的应用为所述的二聚单萜类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
本发明所述二聚单萜类化合物毛叶三条筋二聚单萜C的制备方法包括浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱以及凝胶柱层析步骤，具体包括：
A、浸膏提取：取毛叶三条筋样品树皮，毛叶三条筋可以粉碎或切成小段，用高浓度甲醇（w%：80%~100%）或高浓度乙醇（w%：80%~100%）或高浓度丙酮（w%：70%~100%）为提取溶剂，提取溶剂：毛叶三条筋（重量比）=2~4:1，浸泡24h~72h，提取3~5次，合并提取液、过滤浓缩成浸膏；
B、硅胶柱层析：浸膏用重量比1.5~3倍量的纯甲醇或纯乙醇或纯丙酮溶解后用重量比0.8~1.5倍的80~100目硅胶拌样，用重量比2~5倍量的160~300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1（1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、0:1）的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；
C、高压液相色谱分离：柱层析洗脱液的9:1部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的二聚单萜类化合物，高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C18色谱柱，流速为20mL/min，流动相为60%的甲醇，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200μL，收集22.8min的色谱峰，多次累加后蒸干。
D、凝胶柱层析：C步骤中高压液相色谱法分离纯化后的物质经所述高效液相色谱分离纯化后，所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。
本发明所用原料不受地区和品种限制，均可以实现本发明，下面以来源于云南中烟工业有限责任公司的毛叶三条筋原料对本发明做进一步说明：
实施例1
毛叶三条筋样品来源于云南西双版纳，将毛叶三条筋取样2.0kg粉碎以95%的甲醇提取5次，每次提取24h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏100g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用120g的100目粗硅胶拌样，0.6kg的160目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、0:1的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以60%的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18 (21.2×250mm, 5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200μL，收集22.8min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例2
毛叶三条筋样品云南德宏，将毛叶三条筋取样4.0kg切碎，以95%的乙醇提取4次，每次提取48h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏192g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用200g的80目粗硅胶拌样，1.2kg 的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、0:1的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以60%的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18 (21.2×250 mm，5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200μL，收集22.8min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例3
毛叶三条筋样品来源于云南河口，将毛叶三条筋取样6kg粉碎，以75%的丙酮用超声提取3次，每次提取72h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏320g。浸膏用重量比1.6倍量的纯甲醇溶解后用360g的90目粗硅胶拌样，2.4kg 的180目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、0:1的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以60%的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18 (21.2×250mm, 5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200μL，收集22.8min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例4
取实施例1制备的化合物，为黄色胶状物。
本发明化合物为白色固体；紫外光谱 (溶剂为甲醇), λmax (logε) 210 (3.28)、238 (2.15)、308 (1.87) nm；红外光谱 (溴化钾压片)νmax 3428、2968、2865, 1762、1735、1675、1610、1528、1467、1418、1253、1327、1138, 924, 871 cm-1；高分辨质谱 (HRESIMS) 给出准分子离子峰m/z 349.1412 [M+Na]+ (计算值349.1416)。结合1H和13C NMR谱给出一个分子式C20H22NaO4，不饱和度为10。从1H和13CNMR谱 (数据归属见表-1) 信号可以看出该化合物中具有3个羰基、4组双键、2个次甲基、2个亚甲基、1个氧化的季碳、4个甲基；根据化合物的不饱和度，该化合物应该有3个环；进一步通过HSQC相关和HMBC相关 (图3) 可确定化合物中碳、氢之间的联接，并确定化合物的结构。
实施例5
取实施例2制备的化合物，为黄色胶状物。测定方法与实施例4相同，确认实施例2制备的化合物为所述的二聚单萜类化合物——毛叶三条筋二聚单萜C。
实施例6
取实施例3制备的化合物，为黄色胶状物。测定方法与实施例4相同，确认实施例3制备的化合物为所述的二聚单萜类化合物——毛叶三条筋二聚单萜C。
实施例7
取实施例1制备的二聚单萜类化合物进行抗烟草花叶病毒活性试验，试验情况如下：
采用半叶法，在药剂的质量浓度均为50mg/L时对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5~6龄烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先将叶片均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，立即放在盛有药液的培养皿中处理20min，取出，擦去叶片上水珠和药液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保湿的玻璃缸中，并盖上玻璃盖，控温(23 ± 2)℃，放在温室自然光照射，2~3d即可见枯斑．每个处理都设另一半叶为对照，另外设有1组为商品宁南霉素的处理作为对比，按下公式计算相对抑制率。
XI%=(CK-T)／CK×100%
X：相对抑制率(%)，CK：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，T浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。
结果表明本化合物的相对抑制率为38.5%，超过对照宁南霉素的相对抑制率29.6%，说明化合物有很好的抗烟草花叶病毒活性。
实施例8
取实施例2、3制备的二聚单萜类化合物分别进行抗烟草花叶病毒活性试验，试验方法与实施例7相同，结果均表明制备得到的化合物的相对抑制率超过对照宁南霉素的相对抑制率，说明本发明化合物有很好的抗烟草花叶病毒活性。
Claims (7)
1.一种二聚单萜类化合物，其特征在于所述的二聚单萜类化合物是从傣药毛叶三条筋中分离得到，其分子式为C20H22O4，具有下述结构：
。
2.一种权利要求1所述的二聚单萜类化合物的制备方法，其特征在于是以傣药毛叶三条筋为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离、凝胶柱层析分离步骤得到，具体为：
A、浸膏提取：取毛叶三条筋，经粉碎或切成小段，加入重量比2~4倍的质量百分比70~100%有机溶剂浸泡提取3~5次，每次24~72h，合并提取液，过滤浓缩成浸膏；
B、硅胶柱层析：浸膏用重量比2~5倍量的160~300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析，以体积比1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和0:1的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；
C、高压液相色谱分离：B步骤洗脱液的9:1部分进一步用高压液相色谱分离纯化；
D、凝胶柱层析分离：C步骤所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化，即得所述的二聚单萜类化合物。
3.根据权利要求2所述的二聚单萜类化合物的制备方法，其特征在于A步骤中所述的毛叶三条筋为樟科植物香面叶的树皮。
4.根据权利要求2所述的二聚单萜类化合物的制备方法，其特征在于A步骤中所述的有机溶剂为质量百分比80~100%的甲醇、质量百分比80~100%的乙醇或质量百分比70~100%的丙酮中的一种。
5.根据权利要求2所述的二聚单萜类化合物的制备方法，其特征在于B步骤中所述的浸膏在经硅胶柱层析粗分前，用重量比1.5~3倍量的纯甲醇或纯乙醇或纯丙酮溶解后用重量比0.8~1.5倍的80~100目硅胶拌样。
6.根据权利要求2所述的二聚单萜类化合物的制备方法，其特征在于C步骤中所述的高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C18色谱柱，流速为20mL/min，流动相为60%的甲醇，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200μL，收集22.8min的色谱峰，多次累加后蒸干。
7.一种权利要求1所述的二聚单萜类化合物的应用，其特征在于所述的二聚单萜类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
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