CN104387361B

CN104387361B - 一种异香豆素类化合物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN104387361B
Application number: CN201410603525.4A
Authority: CN
Inventors: 尚善斋; 缪明明; 雷萍; 赵伟; 汤建国; 杨光宇; 袁大林; 郑绪东; 陈永宽
Original assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2014-10-30
Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2034-10-30
Also published as: CN104387361A

Abstract

本发明公开了一种异香豆素类化合物，其化学命名为3,5-双(羟甲基)-6-甲氧基-1H-异苯并吡喃-1-酮，其分子式为C₁₂H₁₂O₅，且具有下述结构：本发明还公开了上述化合物的用途，经活性测试表明，其对烟草花叶病毒具有很好的抑制作用。本发明化合物结构简单，抗烟草花叶病毒活性较好，可作为抗烟草花叶病毒的先导化合物用于抗烟草花叶病毒的农药制剂研发。

Description

一种异香豆素类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种源于烟草的异香豆素类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

烟草是世界上化学成分最为复杂的植物，次生代谢产物非常丰富，据1982年Dube和Green等报道，烟草中已鉴定出的化学成分就超过2549种，到2008年，Rodgman和perfetti的报道称，烟草、烟草代用品以及卷烟烟气中发现的化合物总数大约为8700种。目前，人们从烟草中鉴定出来的单体化学物质就超过3000多种，而且还有许多成分尚未鉴定出来。烟草除主要用于卷烟抽吸用途外，还可从中提取多种有利用价值的化学成分，从中发现有开发利用价值的先导性化合物。

异香豆素是一些天然产物的基本结构，广泛分布于自然界中，种类繁多，特别是最近发现其衍生物具有抗病毒、抗菌、消炎、抗癌、抑制蛋白酶和除草等生理和生物活性。同时已有研究证实，其药理作用与化学结构密切相关，为了研究这类化合物的构效关系，可进一步研究和开发更多的异香豆素类化合物，从中寻找有效的先导化合物和活性基团。本发明从烟草中分离得到了一种具有抗烟草花叶病毒活性的异香豆素类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道。

发明内容

本发明的第一方面在于提供一种新型的异香豆素类化合物，其分子式为C₁₂H₁₂O₅，经过分析化学鉴定，其具有下述结构：

根据有机化合物的系统命名法，该化合物被命名为3,5-双(羟甲基)-6-甲氧基-1H-异苯并吡喃-1-酮。

该化合物为白色固体，本发明人将其命名为“烟草异香豆丙素”，并将其英文名称命名为：tabaisocoumarin-C。

本发明的第二方面提供了上述第一方面所述的异香豆素类化合物的制备方法，该方法包括如下步骤：

a.制备烟草提取物浸膏：以烟草全株为原料，将其粉碎并用第一溶剂浸泡并提取所述烟草2～4次，每次24h～72h，将提取液合并、过滤并浓缩后得到所述烟草提取物浸膏；其中所述第一溶剂是选自乙醇、甲醇或丙酮的有机溶剂与水的混合物，其中有机溶剂占该第一溶剂的70wt％～100wt％，且第一溶剂：烟草＝2～4:1，重量比；

b.硅胶柱层析：将上述烟草提取物浸膏用选自纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮的第二溶剂溶解后与为烟草提取物浸膏的0.8～1.5重量倍的60～120目硅胶拌样，将拌样后的混合物再与为烟草提取物浸膏的2～5重量倍的160～300目硅胶混合后干法装柱，然后用体积比依次为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5和0:1的一系列氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集其中用体积比为9:1的氯仿-丙酮溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第一洗脱液；

c.高压液相色谱分离：将上述第一洗脱液通入高压液相色谱进行分离纯化，该高压液相色谱采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流动相为36wt％的乙腈水溶液，流动相流速为12mL/min，紫外检测器检测波长为316nm，第一洗脱液液每次进样150μL，收集每次进样后色谱峰保留时间为27.0min时所对应的洗脱液，称为第二洗脱液，将该第二洗脱液脱除溶剂后即得所述异香豆素类化合物。

前述高压是指使用时压力在5-15Mpa的反相制备色谱。

在优选的实施方案中，本发明还包括以下进一步提纯的步骤：将在所述高压液相色谱分离之后得到的所述异香豆素类化合物再次溶于体积比为1:1的氯仿/甲醇溶液，并以体积比为1:1的氯仿/甲醇溶液的为流动相，通过凝胶柱进行层析分离，提到进一步提纯的所述异香豆素类化合物。

本发明的第三方面提供了第一方面所述的异香豆素类化合物在制备抗烟草花叶病药物中的应用。

附图说明

图1为本发明的新型异香豆素类化合物的核磁共振碳谱。

图2为本发明的新型异香豆素类化合物的核磁共振氢谱。

图3为本发明的新型异香豆素按照天然产物化学中的经典编号方法的碳原子编号图，在下面结合该产物的各种谱图来鉴定该产物的结构过程中，使用了该经典编号方法。

图4为已知化合物6,8-二羟基-3-羟基甲基-异香豆素的结构。

图5为本发明的新型异香豆素类化合物的主要¹H-¹HCOSY和HMBC相关图示。

具体实施方式

本发明所制备的新型异香豆素类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：本发明化合物为白色固体；紫外光谱(溶剂为甲醇),λ_max(logε)210(4.03),255(3.76),280(3.65),316(3.64)nm；红外光谱(溴化钾压片)ν_max3426,3057,2922,2850,1732,1721,1608,1562,1476,1357,1209,1138,1067,865,774cm^-1；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰m/z259.0587[M+Na]⁺(计算值259.0582)。结合¹H和¹³CNMR谱给出分子式C₁₂H₁₂O₅，不饱和度为7。¹HNMR谱显示1个1,2,3,4-四取代的苯环信号[δ_H7.62(d,J＝8.4Hz)；6.83(d,J＝8.4Hz)]，1个孤立的不饱和质子信号[δ_H6.48(s)]，1个甲氧基[δ_H3.80(s)]。¹³CNMR谱显示9个不饱和碳原子，其中包括6个季碳原子(1个为酯羰基碳原子)，1个甲氧基碳原子，2两个氧化亚甲基(表1)。基于HSQC和HMBC二维核磁共振技术，¹H和¹³CNMR信号得以一一对应(表1,图5)。通过详细比对发现，烟草异香豆丙素的核磁数据与6,8-二羟基-3-羟基甲基-异香豆素(图4)类似，其主要区别在于两者的苯环上取代方式的不同，并且烟草异香豆丙素多了一个氧化亚甲基。从H-8到C-1,C-8a和C-4a的HMBC谱相关，结合H-7和H-8在¹H¹HCOSY谱中的相关，可以确定C-7和C-8的位置；6-OMe到C-6的HMBC相关，表明甲氧基连接在C-6上；H-1'到C-4a，C-5以及C-6的相关则表明该氧化亚甲基连接在C-5。其它二维相关进一步证明六元内酯环以外其它部分的结构(图5)。至此，本化合物的结构得以确定。

表1.化合物的¹HNMR和¹³CNMR数据(CDCl₃)

注：本表格及上面的结构解析中原子编号按照天然产物化学中经典的编号方法(图3)，并非按照有机化合物系统命名法的编号规则。但在鉴定天然产物结构方面，二者是等效的。

本发明化合物是首次被分离出来的，通过上述核磁共振和质谱测定方法确定了为异香豆素类化合物，并表征了其具体结构。经对抗烟草花叶病毒的实验，其相对抑制率达到20.4％，具有较好的抗烟草花叶病毒活性，以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗烟草花叶病毒药物研发的先导性化合物用于抗烟草花叶病毒的农药制剂研发。

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

本发明所用原料不受地区和品种限制，任何来源的烟草均可以实现本发明，下面以来源于云南中烟工业有限责任公司的烟草原料对本发明做进一步说明。除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

实施例1

烟草样品来源于云南玉溪，品种为玉溪红花大金元。将烟草取样2.0kg粉碎以90％的甲醇提取3次，每次提取48h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏110g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用120g的80目粗硅胶拌样，0.5kg的160目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、0:1的氯仿-丙酮梯度洗脱，将其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以36％的乙腈水溶液为流动相，ZorbaxSB-C₁₈(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流动相流速为12ml/min，紫外检测器检测波长为316nm，每次进样150μL，收集停留时间为27.0min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本发明所述的新型异香豆素类化合物。为了进一步提纯，还可以将所得产物用体积比1:1的氯仿/甲醇溶液溶解，再以体积比1:1的氯仿/甲醇溶液为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，即得更高纯度的该新化合物。

实施例2

烟草样品来源于云南大理，品种为云烟200，将烟草取样3.0kg切碎，以100％的乙醇提取4次，每次提取24h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏120g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用120g的80目粗硅胶拌样，0.7kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、0:1的氯仿-丙酮梯度洗脱，将其中用体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以36％的乙腈水溶液为流动相，ZorbaxSB-C₁₈(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流动相流速为12ml/min，紫外检测器检测波长为316nm，每次进样150μL，收集停留时间为27.0min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本发明所述的新型异香豆素类化合物。为了进一步提纯，还可以将所得产物用体积比1:1的氯仿/甲醇溶液溶解，再以体积比1:1的氯仿/甲醇溶液为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，即得更高纯度的该新化合物。

实施例3

烟草样品来源于云南昆明，品种为K326，将烟草取样5kg粉碎，以80％的丙酮用超声提取3次，每次提取72h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏300g。浸膏用重量比1.6倍量的纯甲醇溶解后用280g的120目粗硅胶拌样，1.5kg的180目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、0:1的氯仿-丙酮梯度洗脱，将其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以36％的乙腈水溶液为流动相，ZorbaxSB-C₁₈(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流动相流速为12ml/min，紫外检测器检测波长为316nm，每次进样150μL，收集停留时间为27.0min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本发明所述的新型异香豆素类化合物。为了进一步提纯，还可以将所得产物用体积比1:1的氯仿/甲醇溶液溶解，再以体积比1:1的氯仿/甲醇溶液为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，即得更高纯度的该新化合物。

实施例4

取实施例1制备的化合物，为白色固体。

本发明化合物为白色固体；紫外光谱(溶剂为甲醇),λ_max(logε)210(4.03),255(3.76),280(3.65),316(3.64)nm；红外光谱(溴化钾压片)ν_max3426,3057,2922,2850,1732,1721,1608,1562,1476,1357,1209,1138,1067,865,774cm^-1；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰m/z259.0587[M+Na]⁺(计算值259.0582)。结合¹H和¹³CNMR谱给出分子式C₁₂H₁₂O₅，不饱和度为7。¹HNMR谱显示1个1,2,3,4-四取代的苯环信号[δ_H7.62(d,J＝8.4Hz)；6.83(d,J＝8.4Hz)]，1个孤立的不饱和质子信号[δ_H6.48(s)]，1个甲氧基[δ_H3.80(s)]。¹³CNMR谱显示9个不饱和碳原子，其中包括6个季碳原子(1个为酯羰基碳原子)，1个甲氧基碳原子，2两个氧化亚甲基(表1)。基于HSQC和HMBC二维核磁共振技术，¹H和¹³CNMR信号得以一一对应(表1,图5)。通过详细比对发现，烟草异香豆丙素的核磁数据与6,8-二羟基-3-羟甲基-异香豆素(图4)类似，其主要区别在于两者的苯环上取代方式的不同，并且烟草异香豆丙素多了一个氧化亚甲基。从H-8到C-1,C-8a和C-4a的HMBC谱相关，结合H-7和H-8在¹H¹HCOSY谱中的相关，可以确定C-7和C-8的位置；6-OMe到C-6的HMBC相关，表明甲氧基连接在C-6上；H-1'到C-4a，C-5以及C-6的相关则表明该氧化亚甲基连接在C-5。其它二维相关进一步证明六元内酯环部分的结构(图5)。至此，本化合物的结构得以确定，并命名为烟草异香豆丙素，英文名称为tabaisocoumarin-C。

实施例5

取实施例2制备的化合物，为白色固体。测定方法与实施例4相同，确认实施例2制备的化合物为所述的异香豆素类化合物——烟草异香豆丙素。

实施例6

取实施例3制备的化合物，为白色固体。测定方法与实施例4相同，确认实施例3制备的化合物为所述的异香豆素类化合物——烟草异香豆丙素。

实施例7

取实施例1～3制备的任一异香豆素类化合物进行抗烟草花叶病毒活性试验，试验情况如下：

采用半叶法，在本发明的化合物的质量浓度均为50mg/L下对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5～6龄烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先在叶片上均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10^-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，将该测试用的叶片分为两个半叶，其中一个半叶放在盛有药液的培养皿中处理20min，取出，擦去该半叶上水珠和药液，作为考察药液的抗病毒活性的实验样品，而另一半叶则未浸入药液中，而是仅浸入清水中，作为对照样品。将分别作为实验样品和对照样品的上述两个半叶复原，排放在铺有卫生纸保湿的玻璃缸中，并盖上玻璃盖，控温(23±2)℃，放在温室自然光照射，2～3d即在各半叶上看见枯斑，记录在各半叶上的枯斑的数目，按下公式计算相对抑制率。

X％＝(CK-T)/CK×100％

X：相对抑制率(％)，CK：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，T浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。

结果表明，本化合物的相对抑制率为20.4％，具有较好的抗烟草花叶病毒活性，以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗烟草花叶病毒药物研发的先导性化合物用于抗烟草花叶病毒的农药制剂研发。

Claims

1.一种异香豆素类化合物，其特征在于具有下述结构：

其分子式为C₁₂H₁₂O₅，化学命名为:3,5-双(羟甲基)-6-甲氧基-1H-异苯并吡喃-1-酮。

2.一种权利要求1所述的异香豆素类化合物的制备方法，其包括以下步骤:

c.高压液相色谱分离：将上述第一洗脱液通入高压液相色谱进行分离纯化，该高压液相色谱采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流动相为36wt％的乙腈水溶液，流动相流速为12mL/min，紫外检测器检测波长为316nm，第一洗脱液每次进样150μL，收集每次进样后色谱峰保留时间为27.0min时所对应的洗脱液，称为第二洗脱液，将该第二洗脱液脱除溶剂后即得所述异香豆素类化合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述高压是指使用时压力在5-15MPa 的反相制备色谱。

4.根据权利要求2所述的方法，其还包括以下进一步提纯的步骤：将在所述高压液相色谱分离之后得到的所述异香豆素类化合物再次溶于体积比为1:1的氯仿/甲醇溶液，并以体积比为1:1的氯仿/甲醇溶液的为流动相，通过凝胶柱进行层析分离，提到进一步提纯的所述异香豆素类化合物。

5.根据权利要求1所述的异香豆素类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。