CN111574492A

CN111574492A - 抗烟草花叶病毒的化合物、制备方法及其用途及含有该化合物的烟草花叶病毒抑制剂

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Publication number: CN111574492A
Application number: CN202010513776.9A
Authority: CN
Inventors: 周敏; 胡秋芬; 杨光宇; 汪伟光; 董淼; 杨文武; 高茜; 刘欣; 李雪梅; 米其利; 李晶; 王晋; 黄海涛; 许�永
Original assignee: Yunnan Minzu University
Current assignee: Yunnan Minzu University
Priority date: 2020-06-08
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2040-06-08
Also published as: CN111574492B

Abstract

本发明公开了一种抗烟草花叶病毒的化合物、制备方法及其用途及含有该化合物的烟草花叶病毒抑制剂。所述化合物的结构式如下：

；其制备方法包括样品提取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离及凝胶柱层析；所述烟草花叶病毒抑制剂包括以下比例的原料：2.5～10%所述化合物、2.5～10 ppm芸苔素内酯、2～5%氨基寡糖素、20～30%麦芽糖糊精，其余量为水。本发明首次从翅荚决明的枝叶中分离得到一个新骨架类型的化合物，具有显著的抗烟草花叶病毒活性，本化合物在20μM浓度下的相对抑制率为52.3±3.2%，超过对照宁南霉素的相对抑制率33.6±3.0%。本发明烟草花叶病毒抑制剂配方简单、成本低廉，防治烟草花叶病毒的效果可达83.6％，远高于相同浓度的市售的化学防治剂38.5％的抑制率。

Description

抗烟草花叶病毒的化合物、制备方法及其用途及含有该化合物的烟草花叶病毒抑制剂

技术领域

本发明属于植物化学领域，具体涉及抗烟草花叶病毒的化合物、制备方法及其用途及含有该化合物的烟草花叶病毒抑制剂。

背景技术

植物病毒病一直是农业生产中的一大危害，素有植物“癌症”之称，由于病毒在植物细胞中绝对寄生，其复制所需的物质、能量、场所完全依赖寄主，且植物没有完整的免疫代谢系统，使得植物病毒病的防治较为困难，给农业生产造成了极大损失。因此病毒病的防治成了全球植物保护工作面临的重要问题，也是植物病毒理论和实践中的重要研究领域。烟草是一种经济作物，由烟草花叶病毒引起的烟草病害是世界各烟区的重要病毒病害，烟草花叶病严重影响了烟叶的产量和质量。据报道，全球每年仅因烟草花叶病毒病造成的损失就达1亿多美元。为了寻找较好的防治植物病毒病的资源，人们进行了多方面的探索和研究。

翅荚决明（Cassia alata L.）为豆科决明属下的一个种。原产美洲热带地区，广布于全世界热带地区，在我国分布于广东和云南南部地区。该植物花色艳丽，有较高的观赏价值，常用作园林绿化树种。同时，它也是重要的药用植物，具有杀真菌的作用，可以用来治疗皮肤病，是香皂、洗发液、洗液的常用原料之一。它的种子含有的皂角苷可以作为驱除肠道寄生虫的驱虫剂；其叶水煎液常被用来治疗高血压、胃病、发烧、哮喘、毒蛇咬伤、杀虫、性病等。

目前国内外学者对翅荚决明进行过一些研究，主要报道的化学成分有色酮、黄酮、萜、异香豆素、甾体、生物碱等类化合物，部分从翅荚决明中发现的色酮和异香豆素类化合物具有显著的抗烟草花叶病毒活性。

为充分利用我国丰富的植物资源，寻找新的活性天然产物，为烟草花叶病的综合防治提供新的生物农药，本发明通过对翅荚决明化学成分的研究，发现了一种从翅荚决明中分离到的新类型化合物，该化合物为色酮和异香豆素的聚合体，其具有显著的抗烟草花叶病毒活性，依托本发明化合物制备的抑制烟草花叶病毒制剂具有很好的烟草花叶病防治效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗烟草花叶病毒的化合物，本发明的第二目的是提供一种抗烟草花叶病毒的化合物的制备方法及用途，本发明的第三目的是提供一种烟草花叶病毒抑制剂。

本发明的第一目的是这样实现的，一种抗烟草花叶病毒的化合物，所述化合物为色酮和异香豆素的聚合体，命名为翅荚决明素A，英文名为：alatain A。

结构式如下：

其中，本化合物的a片段为色酮，b片段为异香豆素。

本发明的第二目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的化合物的制备方法，具体包括以下步骤：

A、样品提取：烤烟烟叶采烤后，将烟茎的茎皮剥下晒干、粉碎至30~50目作为原料，用提取溶剂回流提取2~5次，每次提取溶剂为样品质量的2~6倍，提取时间为 30~60分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至刚有沉淀物析出，静置20~60分钟，滤除沉淀物得到样品提取液；再将样品提取液减压浓缩成浸膏;

B、硅胶柱层析：将所述浸膏上硅胶柱层析，以氯仿和丙酮体积比依次为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5的氯仿-丙酮洗脱液进行梯度洗脱，经TLC监测，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩；

C、高效液相色谱分离：将步骤B采用体积比为9:1的氯仿-丙酮洗脱液洗脱所得部分再采用高效液相色谱分离纯化得粗品；

D、凝胶柱层析：将所述粗品用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离纯化即得目标物；

其中，所述高效液相色谱分离纯化条件如下：以体积浓度为70~80%的甲醇水溶液为流动相，流速15~25 mL/min，以21.2 × 250 mm，5 μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为362nm，每次进样0.5 ~ 1.0 mL，收集30 ~ 45 min的色谱峰，多次累加后蒸干。

所述抗烟草花叶病毒的化合物在防治烟草花叶病中的用途。

本发明的第三目的是这样实现的，一种烟草花叶病毒抑制剂，包括以下比例的原料：2.5～10%所述翅荚决明素A、2.5～10 ppm芸苔素内酯、2-5%氨基寡糖素、20～30%麦芽糖糊精，其余量为水。

所述烟草花叶病毒抑制剂各原料的具体效果如下:

翅荚决明素A具有抗烟草花叶病毒的活性，其在20μM浓度下的相对抑制率为52.3±3.2%；

芸苔素内酯为新型绿色环保植物生长调节剂，能提高作物的抗旱、抗寒能力，缓解作物遭受病虫害、药害、肥害、冻害的症状。

氨基寡糖素为植物生长促进剂，能激发植物体内基因产生具有抗病作用的几丁酶、葡聚糖酶、保素及PR蛋白等，并具有细胞活化作用，有助于受害植株的恢复，促根壮苗，增强作物的抗逆性，促进植物生长发育。

麦芽糖糊精为助溶剂，具有良好曾溶和增稠效果，避免制剂出现沉淀分层现象。

各成分按比例混合均匀，并充分溶解，得到稳定均匀的溶液，即为本发明的烟草花叶病毒抑制剂。使用时，将所述抑制剂用水稀释，喷施到看浸染过烟草花叶病毒的烟草叶片上即可。

本发明的有益效果为：

1、本发明首次从豆科决明属翅荚决明的枝叶中分离得到一个具有新骨架类型的化合物，具有显著的抗烟草花叶病毒活性。活性筛选结果表明：本化合物在20μM浓度下的相对抑制率为52.3±3.2%，超过对照宁南霉素的相对抑制率33.6±3.0%，可以应用于抗烟草花叶病毒的防治中。另外，经试验证明，本化合物安全无毒，因此可用于开发绿色安全的烟草花叶病毒抑制剂。

2、本化合物制备方法简单，其原料来源于翅荚决明，翅荚决明分布广泛、生物产量大，种植栽、培容易，因此本发明化合物原料来源非常广泛、原料成本很低，容易实现大规模生产制备。

3、本发明提供的烟草花叶病毒抑制剂配方简单、成本低廉，易于规模化制备，适用于产业化生产。另外，另外本抑制剂效果显著，高效稳定，防治烟草花叶病毒的效果可达83.6％，远高于相同浓度的市售的化学防治剂38.5％的抑制率，且不会产生化学残留而对环境造成污染，绿色环保，值得大力推广使用。

附图说明

图1本发明化合物的核磁共振碳谱（¹³C NMR）。

图2为本发明化合物的核磁共振氢谱（¹H NMR）。

图3本发明化合物的关键HMBC相关图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所采用的原料和设备若非特指，均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明一种抗烟草花叶病毒的化合物，结构式如下：

所述的抗烟草花叶病毒的化合物的制备方法，包括样品提取、硅胶柱层析和高效液相色谱分离，其特征在于，具体包括以下步骤：

所述步骤B中硅胶柱装柱硅胶为160~200目，所述装柱硅胶的重量为6~10倍浸膏重量。

所述A步骤的提取溶剂为70~100%的丙酮水溶液、90~100%的乙醇水溶液或90~100%的甲醇水溶液。

所述B步骤中浸膏在经硅胶柱层析前，用1.5~3倍浸膏重量份的丙酮或甲醇溶解浓缩物，再用0.8~1.2倍浸膏重量份的80~100目硅胶拌样后上样。

所述抗烟草花叶病毒的化合物在防治烟草花叶病中的用途。

本发明一种烟草花叶病毒抑制剂，包括以下比例的原料：2.5～10%权利要求1所述化合物、2.5～10 ppm芸苔素内酯、2-5%氨基寡糖素、20～30%麦芽糖糊精，其余量为水。

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例中翅荚决明枝叶采于云南西双版纳。

取晒干的翅荚决明枝叶取100 kg，粉碎至40目，用体积浓度为95%的乙醇水溶液300 L回流提取4次，每次回流60 min。合并提取液，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，减压浓缩得到12.6 kg浸膏；

取浸膏1.26 kg并加入1.2 kg的丙酮溶解，然后加入100目硅胶2.2 kg拌样，用200目硅胶10.0 kg装柱，拌样后上柱；用体积比分别为20:1，9:1，8:2, 7:3，6:4和 1:1的氯仿-丙酮洗脱液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分A-F，其中，对收集到的样品A (9:1) 部分285 g，再以72%的甲醇为流动相，流速20 ml/min，21.2 × 250 mm，5 mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为362 nm，每次进样1.0 mL，收集35.6 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本发明所述的翅荚决明素A粗品。所得粗品再次用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化可得翅荚决明素A纯品。

实施例2

本实施例中翅荚决明枝叶采于云南德宏。

取晒干的翅荚决明枝叶取50 kg，粉碎至30目后用体积浓度为100%的甲醇水溶液600 L回流提取5次，每次回流30 min。合并提取液，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，减压浓缩得到7.2 kg浸膏；

取浸膏0.72kg并加入2.2 kg的甲醇溶解，然后加入80目硅胶0.8 kg拌样，用160目硅胶4.3kg装柱，拌样后上柱；用体积比分别为20:1，9:1，8:2, 7:3，6:4和 1:1的氯仿-丙酮洗脱液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分A-F，其中，对收集到的样品A (9:1) 部分158 g，再以80%的甲醇为流动相，流速15 ml/min，21.2× 250 mm，5 mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为362nm，每次进样0.5 mL，收集45 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本发明所述的翅荚决明素A粗品。所得粗品再次用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化即得翅荚决明素A纯品。

实施例3

本实施例中翅荚决明枝叶采于云南文山。

取晒干的翅荚决明枝叶取25 kg、粉碎至50目，用体积浓度为100%的丙酮溶液150L回流提取2次，每次回流45 min。合并提取液，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，减压浓缩得到3.8 kg浸膏；

取浸膏0.38 kg并加入0.8 kg的乙醇水溶液溶解，然后加入90目硅胶0.5 kg拌样，用180目硅胶2.5kg装柱，拌样后上柱；用体积比分别为20:1，9:1，8:2, 7:3，6:4和 1:1的氯仿-丙酮洗脱液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分A-F，其中，对收集到的样品A (9:1) 部分65 g，再以70%的甲醇为流动相，流速25ml/min，21.2 × 250 mm，5 mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为362 nm，每次进样0.7mL，收集30min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本发明所述的翅荚决明素A粗品。所得粗品再次用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化即得翅荚决明素A纯品。

实施例4

一种烟草花叶病毒抑制剂，包括以下比例的原料：2.5%翅荚决明素A、4 ppm芸苔素内酯、2%氨基寡糖素、20%麦芽糖糊精，其余部分为水。

实施例5

一种烟草花叶病毒抑制剂，包括以下比例的原料：10%翅荚决明素A、5 ppm 芸苔素内酯、5%氨基寡糖素、30%麦芽糖糊精，其余部分为水。

实施例6

一种烟草花叶病毒抑制剂，包括以下比例的原料：2.5～10%翅荚决明素A、8 ppm芸苔素内酯、2.5%氨基寡糖素、25%麦芽糖糊精，其余部分为水。

实施例7

一种烟草花叶病毒抑制剂，包括以下比例的原料：2.5%翅荚决明素A、5 ppm芸苔素内酯、5%氨基寡糖素、30%麦芽糖糊精，其余部分为水。

试验例1

本化合物为黄色色胶状化合物，通过MS、HRMS、 1H NMR、1H和13C NMR 、HMBC及DEPT 等光谱技术对实施例1-3分离得到的抗烟草花叶病毒的化合物进行结构鉴定，具体数据及分析如下：

(1)紫外光谱（溶剂为甲醇）

210 (4.20), 262 (3.65), 290 (3.78),362 (3.55) nm。

(2)红外光谱（溴化钾压片）3410, 2942, 1725, 1650, 1600, 1543, 1462,1351, 1138, 1057, 962, 839 cm^–1。

(3)HRESIMS显示准分子离子峰m/z 459 [M + Na]⁺; HRESIMS m/z 459.1067 [M+ Na]⁺ (calcd for C₂₄H₂₀O₈Na, 459.1056)；¹H和¹³C NMR谱（图1和图2）给出其分子式为C₂₄H₂₀O₈。

(4)¹H NMR（CDCl3，500MHz）和¹³C NMR（CDCl3，125MHz）数据见表1。

翅荚决明素A的¹H NMR谱(图1)显示了一些特征信号，包括2个甲基(δ _H 2.30, s;3.87, s)，三个亚甲基(δ _H 3.40, s; 4.15, s; 4.44, s)，两个双键单峰信号(δ _H 6.22, s;6.35, s)，一个1,2,3,5-四取代苯环信号 (δ _H 6.54, d, J = 1.8 Hz; 6.67, d, J = 1.8Hz)和一个1,2,3,4-四取代苯环信号(δ _H 6.76, d, J = 8.4 Hz; 7.69, d, J = 8.4 Hz)。其DEPT NMR谱 (图2) 显示了24个碳信号包括了2个甲基碳 (包括一个含氧甲基)，3个亚甲基（包括1个含氧碳信号），6个烯碳次甲基乙基13个季碳原子信号（包括了3个羰基和5个含氧碳信号）。其中，3个羰基和 18个烯碳占据了12个不饱和度，提示化合物为1个四环体系的化合物。综上所述，初步可以判断翅荚决明素A为一个高度芳构化的异分子二聚体，它主要由一个C₁₃色酮母核 (1a片段)和一个二环芳烃片段构成 (1b片段)，见图3，其平面结构通过1D和2D核磁共振综合解析得到确定：在片段1a的色酮母核 (rings A and B)通过特征¹H和¹³C信号(δ _H 6.22, 6.54, and 6.67; δ _C 165.3, 114.7, 180.7, 138.7, 121.1,164.4, 103.5, 161.1, and 115.5)得到确定。该片段通过H-3 (δ _H 6.22, s) and C-2/C-4/C-10, H-6 (δ _H 6.54, d, J = 1.8 Hz)与C-8/C-10以及H-8 (δ _H 6.67, d, J = 1.8 Hz)与C-6/C-10的HMBC相关得到确定。除此之外，一个羰基片段 (C-11 至 C-13的三碳单元)和一个羟基 (7-OH) 分别连接在色酮片段的C-5 和C-7位，该推论通过H₂-11 (δ _H 4.15, s)与 C-6/C-10，以及 7-OH (δ _H 10.70, s) 与 C-6/C-7/C-8 得到证实。这些特征与已知化合物 5-acetonyl-7-hydroxy-2-methylchromone 非常类似，不同之处仅仅是原本A环中的C-14甲基变成了1a中的亚甲基，该推测通过H-3与C-14 (δ _C 32.8, t)以及H₂-14 (δ _H 3.40,s) 和C-2 (δ _C 165.3, s)、C-3 (δ _C 114.7, d) 和 C-9 (δ _C 161.1, s) (⁴ J _CH)得到证实，推测1a片段通过C-14与 1b片段连接起来。余下的11个碳信号（包括1个甲氧基、1个含氧的亚甲基、3个烯碳次甲基和6个季碳信号）归属为1个含有1个甲氧基和一个羟甲基的C9二环结构（1b片段）。进一步通过关键的HMBC信号H-4' (δ _H 6.35, s)与C-1' (δ _C 161.4, s)(⁴ J _CH)、C-3' (δ _C 155.7, s)、C-4a' (δ _C 138.2, s)、C-5' (δ _C 129.5, s)、C-8a' (δ _C123.0, s) 和 C-9' (δ _C 63.9, t)相关，H-7' (δ _H 6.76, d, J = 8.4 Hz)与C-5'、C-6'(δ _C 162.3, s)、C-8' (δ _C 131.5, d)、和C-8a'相关，H-8' (δ _H 7.69, d, J = 8.4 Hz) 与C-4a'、C-6'、C-7' (δ _C 128.8, d) 和 C-8a'相关确定该C9母核为一个异香豆素骨架。除此之外，取代基1个甲氧基和一个羟甲基通过相应的HMBC确定分别连接在C-6' 和 C-3'位置上。最终，片段1a和1b通过关键的H₂-14 与 C-4a'/C-5'/C-6' HMBC相关证实其通过C-14和C-5'连接起来，至此，化合物翅荚决明素A结构得以确定，其英文名为alatain A。

表1 翅荚决明素A的¹H和¹³C NMR（CDCl3，500 和125 MHz）数据

。

试验例2 本发明化合物的抗烟草花叶病毒活性检测

对该化合物进行了抗烟草花叶病毒活性试验，采用半叶法，在药剂的质量浓度均为50mg/L时对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5～6龄烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先将叶片均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10^-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，立即放在盛有药液的培养皿中处理20 min，取出，擦去叶片上水珠和药液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保湿的玻璃缸中，并盖上玻璃盖，控温(23 ± 2)℃，放在温室自然光照射，2～3 d即可见枯斑．每个处理都设另一半叶为对照，另外设有1组为商品宁南霉素的处理作为对比，按下公式计算相对抑制率。

XI％=(CK-T)／CK×100％

X：相对抑制率(％)，CK：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，T浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。

试验结果表明，本化合物的相对抑制率为52.3±3.2%，超过对照宁南霉素的相对抑制率33.6±3.0%，说明化合物有较强的抗烟草花叶病毒活性。

试验例3 本发明烟草花叶病毒抑制剂的防治效果对比试验

试验处理：在烟草生长到苗叶期时进行叶面喷雾处理，处理一：将实施例4的抑制剂与水(1：200比例)混合后进行喷雾，用量2.0 g/㎡；处理二：使用市售的防治烟草花叶病毒的化学制剂宁南霉素，按照说明书进行等量喷施；处理三：使用等量清水喷施。

试验方法：对上述三组处理在烟草的苗叶期进行喷雾处理，共喷雾3次，喷施后5天进行调查并记录各组处理的发病株数。

烟草病毒病严重度分级标准(国家标准GB/T23222-2008)以株为单位分级调查：0级：全株无病；1级：心叶脉明或轻微花叶，病株无明显矮化；3级：三分之一叶片花叶但不变形，或病株矮化为正常株高的四分之三以上；5级：三分之一至二分之一叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或病株矮化为正常株高的三分之二至四分之三；7级：二分之一至三分之二叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或病株矮化为正常株高的二分之一至三分之二；9级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，或病株矮化为正常株高的二分之一以上。

防治效果(％)＝(空白对照发病株数-处理组的发病株数)÷空白

对照的发病株数×100％。

试验结果表明，本发明抑制剂对烟草花叶病毒病的防治具有明显的防治效果，防效可达83.6％，远高于相同浓度的市售的化学防治剂的38.5％抑制率，且不会产生化学残留而对环境造成污染，绿色环保。

Claims

1.一种抗烟草花叶病毒的化合物，其特征在于，结构式如下：

。

2.权利要求1所述的抗烟草花叶病毒的化合物的制备方法，包括样品提取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离及凝胶柱层析，其特征在于，具体包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述抗烟草花叶病毒的化合物的制备方法，其特征在于，所述A步骤的提取溶剂为70~100%的丙酮水溶液、90~100%的乙醇水溶液或90~100%的甲醇水溶液。

4.根据权利要求2所述抗烟草花叶病毒的化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤B中硅胶柱装柱硅胶为160~200目，所述装柱硅胶的重量为6~10倍浸膏重量。

5.根据权利要求2所述抗烟草花叶病毒的化合物的制备方法，其特征在于所述B步骤中浸膏在经硅胶柱层析前，用1.5~3倍浸膏重量份的丙酮或甲醇溶解浓缩物，再用0.8~1.2倍浸膏重量份的80~100目硅胶拌样后上样。

6.权利要求1所述抗烟草花叶病毒的化合物在防治烟草花叶病中的用途。

7.一种烟草花叶病毒抑制剂，其特征在于，包括以下比例的原料：2.5～10%权利要求1所述化合物、2.5～10 ppm芸苔素内酯、2-5%氨基寡糖素、20～30%麦芽糖糊精，其余量为水。