CN110357894B - 一种三环生物碱类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三环生物碱类化合物及其制备方法与应用。所述的三环生物碱类化合物是从金丝马尾莲中分离得到，命名为5,6‑二氢‑8,9‑二甲氧基‑2‑甲基‑11H‑吡咯并[2,1‑b][3]苯并杂卓‑11‑酮，英文名为：5,6‑dihydro‑8,9‑dimethoxy‑2‑methyl‑11H‑pyrrolo[2,1‑b][3]benzazepin‑11‑one，其分子式为C₁₆H₁₇NO₃，为棕红色胶状物，具有下述结构式：

。制备方法包括浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤。应用为所述的三环生物碱类化合物在制备抑菌剂中的应用或所述的三环生物碱类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。

Description

一种三环生物碱类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种三环生物碱类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

唐松草属(拉丁学名：Thalictrum L.)是毛茛科中的一属。该属植物为多年生草本，全球约有200种，广泛分布于亚洲、欧洲、非洲、北美洲和南美洲；其中中国约有67种，在全国各省区均有分布，多数分布于西南部。该属植物约有29种可供药用，一些种类均有清热、治湿、发汗、止痢、治目赤等作用。金丝马尾莲连(学名：Thalictrum glandulosissimum (Finet & Gagnep.) W. T. Wang & S. H. Wang)，为唐松草属草本植物，分布于中国云南大理鹤庆、宾川一带生海拔2500米山坡草地。金丝马尾莲连具有有清热、抗菌、降压等功效，常代替黄连使用。其根和茎为云南白族民间常用的中药材，用于肠炎，痢疾，黄疸，目赤肿痛等疾病。前期研究表明金丝马尾莲富含生物碱类活性成分，其中异喹啉生物碱是其最具特征的活性成分。为了研究金丝马尾莲中生物碱类化合物的构效关系，进一步研究和开发更多的活性生物碱类化合物，从中寻找有效的先导化合物和活性基团。本发明从采于云南鹤庆的金丝马尾莲中分离得到了一种新的三环生物碱类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道，值得一提的是该化合物具有显著的抗烟草花叶病病毒活性。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种三环生物碱类化合物；第二目的在于提供所述的三环生物碱类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述的三环生物碱类化合物的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的三环生物碱类化合物是从金丝马尾莲中分离得到，命名为5,6-二氢-8,9-二甲氧基-2-甲基-11H-吡咯并[2,1-b][3]苯并杂卓-11-酮，英文名为：5,6-dihydro-8,9-dimethoxy-2-methyl-11H-pyrrolo[2,1-b][3]benzazepin-11-one，其分子式为C₁₆H₁₇NO₃，为棕红色胶状物，具有下述结构式：

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本发明的第二目的是这样实现的，是以金丝马尾莲为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤，具体包括：

A、浸膏提取：将金丝马尾莲粉碎过筛，用95%乙醇回流提取2~3次，每次30~50min，合并提取液浓缩得到物料a，物料a中加入酒石酸溶液稀释得到物料b，物料b采用乙酸乙酯萃取1~3次，收集水相得到物料c，物料c用碳酸钠饱和，再次用乙酸乙酯萃取1~3次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得到浸膏d；

B、硅胶柱层析：浸膏a用浸膏a重量2~8倍量的160~300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析，以体积配比为20:1~0:1的三氯甲烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，合并相同的部分；

C、高压液相色谱分离：B步骤洗脱液的8:2部分经反相C₁₈中压液相色谱分离纯化，所得32.2min的色谱峰对应的洗脱液，进一步经高压液相色谱分离纯化得到目标物三环生物碱类化合物。

以上述方法制备的三环生物碱类化合物的结构是通过以下方法鉴定出来的：

本发明化合物为棕红色胶状物，HRESI-MS 显示其准分子离子峰为 294.1112 [M+Na]⁺，结合¹H 和¹³C NMR谱确定分子式为 C₁₆H₁₇NO₃，为生物碱类化合物，且化合物的不饱合度为9。其红外光谱显示化合物中有羰基 (1652 cm^-1)，和芳环 (1603、1568和1431 cm^-1)信号吸收，紫外光谱在 253、326和352 nm 有吸收峰也证实化合物中存在芳环结构。根据¹H和¹³C NMR 信号，化合物中总共有16个碳和17个氢，根据其化学位移值的DEPT谱信号，可初步分类为1个甲基、两个亚甲基、2个甲氧基、1个羰基、4个双键次甲基、以及6个双键季碳(其中2个为氧化季碳)。结合其HSQC和HMBC相关谱，这些信号可进一步归类为1个1,2,4,5-四取代苯环 (C-7~C-13，H-7和H-10), 1个1,2,4-三取代的吡咯环(C-1~C-3, C-12, H-1 和 H-3), 1个和N-连接的-CH₂-CH₂-片段 (C-5 和 C-6, H₂-5 和H₂-6)，1个羰基 (C-11), 1个甲基(C-15 和 H₃-15)以及两个甲氧基 (δ _C 55.9、56.3 q，δ _H 3.79 s、3.82)。进一步分析其HMBC谱 (图2)：1,2,4,5-四取代苯环和通过H-7和C-8、C-9、C-13、C-14，以及H-10 和 C-8,C-9、C-13、C-14的HMBC相关得到证实；1,2,4-三取代的吡咯环可通过H-1和C-2、C-3、C-12，以及H-3和C-1、C-2、C-12的HMBC相关得到证实；存在-N-CH₂-CH₂-结构片段可通过H₂-5和C-6，以及H₂-6和C-5的HMBC相关得到证实。此外，化合物的不饱合度为9，除去苯环的不饱合度4、吡咯环的不饱合度3、羰基的不饱合度1，化合物中还应该有一个环以支持其不饱合度。从HMBC相关谱(图3和4)中可观测到H₂-6和C-7、C-13、C-14，H-5和C-3、C-12，以及H-3和C-5的HMBC相关，可推测N-CH₂-CH₂-结构片段的一端和苯环相了解，另一端和吡咯环的氮相连接。根基苯环上的氢(H-10)和吡咯环上的氢(H-1)和羰基都有HMBC相关信号，这可证实该羰基一端连接到苯环上、另一端连接到和吡咯环上。这样，苯环，吡咯环、羰基、-N-CH₂-CH₂-结构片段形成了一个氮杂卓环，化合物的母体结构定位苯并杂卓类三环生物碱。化合物的母体结构确定后，进一步通过HMBC相关信号确定取代基团(两个甲氧基和一个甲基) 的位置。根据H₃-15 与C-1、C-2、C-3，以及H-1和 H-2与C-15的HMBC相关，可证实该甲基取代在C-2位。根据两个甲氧基氢信号(δ _H 3.79 s、3.82)分别和C-8、C-9有HMBC相关信号，可证实两个甲氧基分别取代在C-8和C-9位。至此化合物1 的结构得到确认，该化合物命名为：5,6-二氢-8,9-二甲氧基-2-甲基-11H-吡咯并[2,1-b][3]苯并杂卓-11-酮 (1)。

化合物的红外、紫外和质谱数据：UV (CH₃OH) λ _max (log ε)220 (4.24)、253(3.68)、326 (3.60), 352 (3.87) nm；IR (KBr) ν _max 3055、2928、1652、1603、1568、1431、1389、1267、1172、1138、1069、1027、953、796 cm^-1; ¹H NMR和¹³C NMR 数据 (CDCl₃, 125 和500 MHz) 见表-1；正离子模式 ESIMS m/z 294 [M+Na]⁺，HRESIMS m/z 294.1112 [M+Na]⁺(计算值 C₁₆H₁₇NNaO₃, 294.1106)。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的三环生物碱类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。

用半叶法进行了本发明化合物的抗烟草花叶病毒活性测试，结果明本化合物的相对抑制率为48.6%，超过对照宁南霉素的相对抑制率30.3%，说明化合物有很好的抗烟草花叶病毒活性。

本发明化合物是首次被分离出来的，通过上述核磁共振和质谱测定方法确定为三环生物碱类化合物，并表征了其具体结构。活性检测结果揭示了本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒生物农药中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗花叶病毒药物研发的先导性化合物用于抗花叶病毒药物制剂研发。

附图说明

图1为本发明三环生物碱类化合物的核磁共振碳谱；

图2为本发明三环生物碱类化合物的核磁共振氢谱；

图3为本发明三环生物碱类化合物的核磁共振HSQC谱；

图4为本发明三环生物碱类化合物的核磁共振HMBC谱；

图5为本发明三环生物碱类化合物的主要HMBC相关。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的三环生物碱类化合物是从金丝马尾莲中分离得到，命名为5,6-二氢-8,9-二甲氧基-2-甲基-11H-吡咯并[2,1-b][3]苯并杂卓-11-酮，英文名为：5,6-dihydro-8,9-dimethoxy-2-methyl-11H-pyrrolo[2,1-b][3] benzazepin-11-one，其分子式为C₁₆H₁₇NO₃，为棕红色胶状物，具有下述结构式：

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本发明所述的三环生物碱类化合物的制备方法，是以金丝马尾莲为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤，具体包括：

A、浸膏提取：将金丝马尾莲粉碎过筛，用95%乙醇回流提取2~3次，每次30~50min，合并提取液浓缩得到物料a，物料a中加入酒石酸溶液稀释得到物料b，物料b采用乙酸乙酯萃取1~3次，收集水相得到物料c，物料c用碳酸钠饱和，再次用乙酸乙酯萃取1~3次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得到浸膏d；

B、硅胶柱层析：浸膏a用浸膏a重量2~8倍量的160~300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析，以体积配比为20:1~0:1的三氯甲烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，合并相同的部分；

C、高压液相色谱分离：B步骤洗脱液的8:2部分经反相C₁₈中压液相色谱分离纯化，所得32.2min的色谱峰对应的洗脱液，进一步经高压液相色谱分离纯化得到目标物三环生物碱类化合物。

A步骤中所述的粉碎过筛是粉碎过30~50目筛。

浸膏d在经硅胶柱层析前，用浸膏d重量比1.5~3倍的有机溶剂溶解，然后用浸膏d重量1~2.5倍的80~100目硅胶拌样。

所述的有机溶剂为纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮。

所述的三氯甲烷-丙酮溶液体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2。

C步骤中的反相C₁₈中压液相色谱分离纯化是以21.2 mm × 250 mm、5 μm的C₁₈色谱柱为固定相，以56%的甲醇为流动相，流速为15 mL/min，紫外检测器检测波长为254nm，收集32.2 min的色谱峰，多次累加后蒸干。

高压液相色谱分离纯化后的化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。

本发明所述的三环生物碱类化合物的应用为所述的三环生物碱类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1

制备三环生物碱类化合物C₁₆H₁₇NNaO₃，包括浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离，具体采用以下步骤：

（1）、浸膏提取：取取金丝马尾莲全株晒干，粉碎到约 30~50 目。称取2.8~3.5 kg粉碎后的样品，置于20 L的玻璃反应釜中，加入95% 的乙醇10~15 L，回流提取30~50 min，滤出提取液；再次往残渣中加入95%的乙醇10~15 L，回流提取30~50 min，滤除提取液。合并两次提取液浓缩到小体积，然后用3% 的酒石酸溶液 5~8 L 稀释，用5~8 L的乙酸乙酯萃取2次。萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用5~ 8 L的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏32.2 ~42.8 g。

（2）、硅胶柱层析：浸膏用重量比1.5～3倍量的纯甲醇或纯乙醇或纯丙酮溶解后，然后用40~60 g (80-100 目) 粗硅胶拌样，烘干，用 150~250 g硅胶 (150-200 目) 柱色谱，三氯甲烷：丙酮（20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5）梯度洗脱，分成 6 个部分。

（3）、高压液相色谱分离纯化：选取 8:2 洗脱部分进行 HPLC进一步分离：用Agilent 公司的 Zorbax PrepHT GF (21.2 mm × 25 cm) 反相柱，以 56% 甲醇水溶液为流动相，流速为 15 mL/min，紫外检测器检测波长为254 nm，收集 32.2 min 的色谱峰，多次累加后蒸干，得化合物粗品。粗品再用甲醇溶解，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱净化，得化合物纯品。

经所述高效液相色谱分离纯化后，一个优选的后续处理方案为，所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。

本发明所用金丝马尾莲原料不受地区和品种限制，均可以实现本发明，下面以来源于云南大理的金丝马尾莲原料，对本发明做进一步说明：

实施例2

金丝马尾莲样品来源于云南大理鹤庆县。取取金丝马尾莲全株晒干，粉碎到约 35目。称取3.0 kg粉碎后的样品，置于20 L的玻璃反应釜中，加入95% 的乙醇12 L，回流提取40 min，滤出提取液；再次往残渣中加入95%的乙醇12 L，回流提取40 min，滤除提取液。合并两次提取液浓缩到小体积，然后用3% 的酒石酸溶液 6 L 稀释，用6 L的乙酸乙酯萃取2次。萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用6 L的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏36.3 g。浸膏用 45 g (80-100 目) 粗硅胶拌样，烘干，用 180g硅胶 (150-200 目) 柱色谱，三氯甲烷：丙酮（20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5）梯度洗脱，分成 6 个部分。选取 8:2 洗脱部分进行 HPLC进一步分离：用 Agilent 公司的 ZorbaxPrepHT GF (21.2 mm × 25 cm) 反相柱，以 56% 甲醇水溶液为流动相，流速为 15 mL/min，紫外检测器检测波长为254 nm，收集 32.2 min 的色谱峰，多次累加后蒸干，得化合物粗品。粗品再用甲醇溶解，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱净化，得化合物纯品。

实施例3

金丝马尾莲样品来源于云南大理宾川县。取取金丝马尾莲全株晒干，粉碎到约 40目。称取3.2 kg粉碎后的样品，置于20 L的玻璃反应釜中，加入95% 的乙醇14 L，回流提取30 min，滤出提取液；再次往残渣中加入95%的乙醇14 L，回流提取30 min，滤除提取液。合并两次提取液浓缩到小体积，然后用3% 的酒石酸溶液 9 L 稀释，用8 L的乙酸乙酯萃取2次。萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用8 L的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏40.6 g。浸膏用 50 g (80-100 目) 粗硅胶拌样，烘干，用 220g硅胶 (150-200 目) 柱色谱，三氯甲烷：丙酮（20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5）梯度洗脱，分成 6 个部分。选取 8:2 洗脱部分进行 HPLC进一步分离：用 Agilent 公司的 ZorbaxPrepHT GF (21.2 mm × 25 cm) 反相柱，以 56% 甲醇水溶液为流动相，流速为 15 mL/min，紫外检测器检测波长为254 nm，收集 32.2 min 的色谱峰，多次累加后蒸干，得化合物粗品。粗品再用甲醇溶解，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱净化，得化合物纯品。

实施例4

金丝马尾莲样品来源于云南剑川县。取取金丝马尾莲全株晒干，粉碎到约 30 目。称取3.2 kg粉碎后的样品，置于20 L的玻璃反应釜中，加入95% 的乙醇14 L，回流提取50min，滤出提取液；再次往残渣中加入95%的乙醇14 L，回流提取50 min，滤除提取液。合并两次提取液浓缩到小体积，然后用3% 的酒石酸溶液 8 L 稀释，用8 L的乙酸乙酯萃取2次。萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用8 L的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏42.2 g。浸膏用 45 g (80-100 目) 粗硅胶拌样，烘干，用 220 g硅胶(150-200 目) 柱色谱，三氯甲烷：丙酮（20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5）梯度洗脱，分成 6 个部分。选取 8:2 洗脱部分进行 HPLC进一步分离：用 Agilent 公司的 Zorbax PrepHT GF(21.2 mm × 25 cm) 反相柱，以 56% 甲醇水溶液为流动相，流速为 15 mL/min，紫外检测器检测波长为254 nm，收集32.2 min 的色谱峰，多次累加后蒸干，得化合物粗品。粗品再用甲醇溶解，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱净化，得化合物纯品。

实施例5

------ 化合物结构的鉴定

取实施例1-4制备的化合物，以上述方法制备得到的三环生物碱类化合物的结构通过以下方法进行测定。本发明化合物1为棕红色胶状物，HRESI-MS 显示其准分子离子峰为 294.1112 [M+Na]⁺，结合¹H 和¹³C NMR谱确定分子式为 C₁₆H₁₇NO₃，为生物碱类化合物，且化合物的不饱合度为9。其红外光谱显示化合物中有羰基 (1652 cm^-1)，和芳环 (1603、1568和1431 cm^-1) 信号吸收，紫外光谱在 253、326和352 nm 有吸收峰也证实化合物中存在芳环结构。根据¹H和¹³C NMR 信号，化合物中总共有16个碳和17个氢，根据其化学位移值的DEPT谱信号，可初步分类为1个甲基、两个亚甲基、2个甲氧基、1个羰基、4个双键次甲基、以及6个双键季碳(其中2个为氧化季碳)。结合其HSQC和HMBC相关谱，这些信号可进一步归类为1个1,2,4,5-四取代苯环 (C-7~C-13，H-7和H-10), 1个1,2,4-三取代的吡咯环(C-1~C-3, C-12, H-1和 H-3), 1个和N-连接的-CH₂-CH₂-片段 (C-5 和 C-6, H₂-5 和H₂-6)，1个羰基 (C-11), 1个甲基(C-15 和H₃-15)以及两个甲氧基 (δ _C 55.9、56.3 q，δ _H 3.79 s、3.82)。进一步分析其HMBC谱 (图2)：1,2,4,5-四取代苯环和通过H-7和C-8、C-9、C-13、C-14，以及H-10 和 C-8, C-9、C-13、C-14的HMBC相关得到证实；1,2,4-三取代的吡咯环可通过H-1和C-2、C-3、C-12，以及H-3和C-1、C-2、C-12的HMBC相关得到证实；存在-N-CH₂-CH₂-结构片段可通过H₂-5和C-6，以及H₂-6和C-5的HMBC相关得到证实。此外，化合物的不饱合度为9，除去苯环的不饱合度4、吡咯环的不饱合度3、羰基的不饱合度1，化合物中还应该有一个环以支持其不饱合度。从HMBC相关谱(图3和4)中可观测到H₂-6和C-7、C-13、C-14，H-5和C-3、C-12，以及H-3和C-5的HMBC相关，可推测N-CH₂-CH₂-结构片段的一端和苯环相了解，另一端和吡咯环的氮相连接。根基苯环上的氢(H-10)和吡咯环上的氢(H-1)和羰基都有HMBC相关信号，这可证实该羰基一端连接到苯环上、另一端连接到和吡咯环上。这样，苯环，吡咯环、羰基、-N-CH₂-CH₂-结构片段形成了一个氮杂卓环，化合物的母体结构定位苯并杂卓类三环生物碱。化合物的母体结构确定后，进一步通过HMBC相关信号确定取代基团(两个甲氧基和一个甲基) 的位置。根据H₃-15 与C-1、C-2、C-3，以及H-1和 H-2与C-15的HMBC相关，可证实该甲基取代在C-2位。根据两个甲氧基氢信号(δ _H 3.79 s、3.82)分别和C-8、C-9有HMBC相关信号，可证实两个甲氧基分别取代在C-8和C-9位。至此化合物 1 的结构得到确认，该化合物命名为：5,6-二氢-8,9-二甲氧基-2-甲基-11H-吡咯并[2,1-b][3]苯并杂卓-11-酮。

实施例6

取实施例3制备的化合物，为黄色胶状物。测定方法与实施例5相同，确认实施例3制备的化合物为所述的三环生物碱类化合物——5,6-二氢-8,9-二甲氧基-2-甲基-11H-吡咯并[2,1-b][3]苯并杂卓-11-酮。

实施例7

取实施例4制备的化合物，为黄色胶状物。测定方法与实施例5相同，确认实施例4制备的化合物为所述的5,6-二氢-8,9-二甲氧基-2-甲基-11H-吡咯并[2,1-b][3]苯并杂卓-11-酮。

实施例8

取实施例1-4制备的任三环生物碱类化合物进行抗烟草花叶病毒活性试验，试验情况如下：

采用半叶法，在药剂的质量浓度均为50 mg/L时对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5～6龄烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先将叶片均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10^-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，立即放在盛有药液的培养皿中处理20 min，取出，擦去叶片上水珠和药液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保湿的玻璃缸中，并盖上玻璃盖，控温(23 ± 2)℃，放在温室自然光照射，2～3 d即可见枯斑．每个处理都设另一半叶为对照，另外设有1组为商品宁南霉素的处理作为对比，按下公式计算相对抑制率。

XI％=(CK-T)／CK×100％

X：相对抑制率(％)，CK：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，T浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。

结果明本化合物的相对抑制率为48.6%，超过对照宁南霉素的相对抑制率30.3%，说明化合物有很好的抗烟草花叶病毒活性。

Claims (9)

1.一种三环生物碱类化合物，其特征在于，所述三环生物碱类化合物具有下述结构式：

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2.一种权利要求1所述的三环生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，是以金丝马尾莲为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤，具体包括：

A、浸膏提取：将金丝马尾莲粉碎过筛，用95%乙醇回流提取2~3次，每次30~50min，合并提取液浓缩得到物料a，物料a中加入酒石酸溶液稀释得到物料b，物料b采用乙酸乙酯萃取1~3次，收集水相得到物料c，物料c用碳酸钠饱和，再次用乙酸乙酯萃取1~3次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得到浸膏d；

B、硅胶柱层析：浸膏a用浸膏a重量2~8倍量的160~300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析，以体积配比为20:1~0:1的三氯甲烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，合并相同的部分；

C、高压液相色谱分离：B步骤洗脱液的8:2部分经反相C₁₈中压液相色谱分离纯化，所得32.2min的色谱峰对应的洗脱液，经多次累加后蒸干得到三环生物碱类化合物粗品。

3.根据权利要求2所述的三环生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，A步骤中所述的粉碎过筛是粉碎过30~50目筛。

4.根据权利要求2所述的三环生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，浸膏d在经硅胶柱层析前，用浸膏d重量比1.5~3倍的有机溶剂溶解，然后用浸膏d重量1~2.5倍的80~100目硅胶拌样。

5.根据权利要求4所述的三环生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮。

6.根据权利要求2所述的三环生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，所述的三氯甲烷-丙酮溶液体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1。

7.根据权利要求2所述的三环生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，C步骤中的反相C₁₈中压液相色谱分离纯化是以21.2mm×250mm、5μm的C₁₈色谱柱为固定相，以56%的甲醇为流动相，流速为15mL/min，紫外检测器检测波长为254nm，收集32.2min的色谱峰对应的洗脱液，多次累加后蒸干。

8.根据权利要求2所述的三环生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，将三环生物碱类化合物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。

9.一种权利要求1所述的三环生物碱类化合物的应用，其特征在于，所述的三环生物碱类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。

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