CN113200989A - 一种色酮生物碱类化合物的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种色酮生物碱类化合物及其制备方法和应用。该化合物具有如下结构式：

，该化合物以鹤庆唐松草为原料，以高浓度甲醇、高浓度丙酮/水或高浓度乙醇/水提取，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏；浸膏用硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以氯仿‑丙酮溶液进行梯度洗脱；洗脱液的8:2部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所需的色酮生物碱类化合物。经活性测试表明，该化合物对烟草黑胫病具有很好的抑制作用。本发明化合物结构新颖，且具有较好的抗黑胫病活性，可作为抗烟草黑胫病的先导化合物用于抗烟草黑胫病防治生物农药的研发。

Description

一种色酮生物碱类化合物的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种从鹤庆唐松草中首次提取分离得到的色酮生物碱类化合物，还涉及该化合物的制备方法以及在抗烟草黑胫病中的应用。

背景技术

唐松草属(拉丁学名：Thalictrum L.)属于毛茛科多年生草本植物。该属植物全球约有200种，其中中国约有67种，多数分布于西南部。在全世界约200种唐松草属植物中，有化学成分报道的该属植物有90余种，主要活性成分有生物碱、皂甙、黄酮等类型。超过43种的该属植物在中国有民间药用记载。鹤庆唐松草(学名：Thalictrum scabrifolium Franch. var. leve Franch)，为双子叶植物纲、毛茛目、毛茛科、唐松草属的一个种。庆唐松草为多年生草本植物，茎高25-40厘米，有稀疏短柔毛，变无毛，上部分枝。该植物分布于主要分布于云南鹤庆县、丽江玉龙县一带，生长于山地草坡、林边或林中。鹤庆唐松草为云南白族民间常用的中药材，主热病心烦；湿热泻痢；肺热咳嗽；目赤肿痛；痈肿疮疖的功效。

烟草黑胫病是烟草生产上最具毁灭性的病害之一，又称烟草疫病，烟农称为“黑杆疯”、“黑根”、“乌头病”。中国各主要产烟区均有不同程度发生，其中安徽、山东、河南省为历史上的重病区；云南、贵州、四川、湖南、广东、广西、福建等南方烟区发生亦相当普遍。目前黑胫病的防治主要通过轮作栽培、品种基因改良、生物农药等方法实现防治。其中用生物农药防治是最常用且最容易实现的方法。

目前从药用植物资源中发现具有植物病害防治功效的新活性防治是天然产物研究热点。本发明通过对采于我国西南的鹤庆唐松草化学成分研究和活性筛选，从中分离得到了一种新的色酮生物碱类化合物，该化合物至今未见到相关报道，值得一提的是该化合物还具有显著的抗烟草黑胫病活性。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种色酮生物碱类化合物，本发明的第二目的是提供所述化合物的制备方法，本发明的第三目的是提供所述化合物的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，一种色酮生物碱类化合物，该化合物的命名为：8-乙酰基-3-羟甲基-7-甲氧基-10H-苯并吡喃[3,2-c]吡啶-10-酮，英文名为：8-Acetyl-3-hydroxymethyl- 7-methoxy-10H-chromeno[3,2-c]pyridin-10-one。化合物为棕红色胶状物，其分子式为C₁₆H₁₃NO₅，具有下述结构式：

。

本发明的第二目的是这样实现的，一种制备所述的色酮生物碱类化合物的方法，包括以下步骤：

1）浸膏提取：将鹤庆唐松草全株干燥粉碎后于玻璃反应釜中以第一溶剂进行回流提取，得到的提取液浓缩后用第二溶剂萃取得浸膏；

2）硅胶柱层析：浸膏用第三溶剂溶解后，用80-100 目的粗硅胶拌样，经150-200目的硅胶柱色谱层析，以三氯甲烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集三氯甲烷-丙酮溶液体积比为8:2的洗脱液；

3）高压液相色谱分离纯化：将洗脱液用HPLC色谱分离得到化合物粗品；

4）将所述化合物粗品用用凝胶柱进一步分离纯化得化合物纯品。

本发明的第三目的是这样实现的，所述色酮生物碱类化合物的应用为在制备抗烟草黑胫病生物农药中的应用。

本发明的有益效果为：

1）本发明提供了一个从鹤庆唐松草中分离得到的色酮生物碱类新化合物，本化合物结构简单，具有突出的抗烟草黑胫病活性，可作为抗烟草黑胫病的先导化合物用于抗烟草黑胫病防治生物农药研发。

2）本发明化合物的原料来源即鹤庆唐松草生长迅速、生物产量大，来源广泛、成本低，可持续为本发明所述的活性化合物分离制备提供原料，易于产业化生产。

附图说明

图1为实施例1制备的色酮生物碱类化合物的核磁共振碳谱；

图2为实施例1制备的色酮生物碱类化合物的核磁共振氢谱；

图3为实施例1制备的色酮生物碱类化合物的主要HMBC相关图示。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

本发明一种色酮生物碱类化合物，具有下述结构：

。

本发明还提供了一种制备所述的色酮生物碱类化合物的方法，包括以下步骤：

1）浸膏提取：将鹤庆唐松草全株干燥粉碎后于玻璃反应釜中以第一溶剂进行回流提取，得到的提取液浓缩后用第二溶剂萃取得浸膏；

2）硅胶柱层析：浸膏用第三溶剂溶解后，用80-100 目的粗硅胶拌样，经150-200目的硅胶柱色谱层析，以三氯甲烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集三氯甲烷-丙酮溶液体积比为8:2的洗脱液；

3）高压液相色谱分离纯化：将洗脱液用HPLC色谱分离得到化合物粗品；

4）将所述化合物粗品用用凝胶柱进一步分离纯化得化合物纯品。

所述步骤1中，所述第一溶剂为95%的乙醇。

所述步骤1中，所述第二溶剂为乙酸乙酯，萃取方法为：提取液浓缩到小体积，然后用3%的酒石酸溶液稀释，再用等体积的乙酸乙酯萃取2-3次；萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用3~5 L的乙酸乙酯萃取2-3次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得浸膏。

所述步骤2中，第三溶剂为甲醇或丙酮或乙醇。

所述步骤2中，梯度洗脱的三氯甲烷-丙酮溶液体积比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5。

所述步骤3中，高压液相色谱分离纯化采用21.2 mm × 250 mm，5µm的C₁₈色谱柱，流速为20 mL/min，流动相为62%的甲醇，紫外检测器检测波长为336 nm，收集33.5 min的色谱峰，多次累加后蒸干。

所述步骤4中，化合物粗品先用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱纯化分离。

本发明还提供了所述色酮生物碱类化合物的应用，具体为在制备抗烟草黑胫病生物农药中的应用。

本发明所用鹤庆唐松草原料不受地区和品种限制，均可以实现本发明，下面以来源于云南大理的鹤庆唐松草原料，对本发明做进一步说明：

实施例1

本实施例鹤庆唐松草样品来源于云南大理鹤庆县。取鹤庆唐松草全株晒干，粉碎到约 40 目。称取3.0 kg粉碎后的样品，置于20 L的玻璃反应釜中，加入95%的乙醇6 L，回流提取50 min，滤出提取液；再次往残渣中加入95%的乙醇6 L，回流提取50 min，滤除提取液。合并两次提取液浓缩到小体积，然后用3%的酒石酸溶液 6 L 稀释，用6 L的乙酸乙酯萃取2次。萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用6 L的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏46.9g。浸膏用60g (80-100 目) 粗硅胶拌样，烘干，用 170g硅胶 (150-200目) 柱色谱，三氯甲烷：丙酮（20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5）梯度洗脱，分成6个部分。选取8:2洗脱部分进行HPLC进一步分离：用Agilent公司的Zorbax PrepHT GF(21.2 mm × 25 cm) 反相柱，以 62% 甲醇水溶液为流动相，流速为20 mL/min，紫外检测器检测波长为336 nm，收集 33.5 min 的色谱峰，多次累加后蒸干，得化合物粗品。粗品再用甲醇溶解，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱净化，得化合物纯品。

取实施例1制备的化合物，对其结构通过以下方法进行测定。

本化合物为棕红色胶状物，由高分辨质谱数据m/z 3322.0696 [M+Na]⁺ (计算值322.0691，C₁₈H₁₇NNaO₄)可确定其分子式为C₁₆H₁₃NO₅，不饱和度为11。红外光谱 (溴化钾压片)显示该化合物中有羟基(3389 cm^-1)、胺基(3262 cm^-1)、羰基(1680、1642 cm^-1)和芳香环(1610、1548、1475、1410 cm^-1)特征官能团，紫外光谱在246、298、336 nm波长处有强吸收，也进一步证实化合物中存在共轭结构。结合¹H和¹³C 与HSQC NMR数据（¹H和¹³C NMR图谱分别见图1和图2，数据见表1），化合物中有16个碳和13个氢。包括4个sp2芳香族次甲基[C-1、C-4、C-6、C-8，其中一个次甲基和氮原子连接(C-1)]，7个sp2 芳香族季碳 (C-3、C-7、C-9、C-4a、C-5a、C-9a、C-10a)，一个共轭羰基(C-10), 一个甲氧基 (δ _C 56.2，δ _H 3.79)，一个乙酰基(C-11和C-12，H₃-12)， 以及一个羟甲基(C-13和H₂-13)。根据这些碳化学位移，酮羰基、5个碳碳双键和1个氮碳双键包含了7个不饱和度。化合物中还应该有3个环，以满足11个不饱和度。而且，4个芳香族次甲基，7个sp2芳香族季碳和共轭羰基应该形成1个苯并吡喃-吡啶三环结构，由此可推测色酮部分通过与吡啶环通过共用C-4a和C-10a融合形成苯并吡喃[3,2-c]吡啶环。该推测可进一步通过H-1和C-3、C-10、C-4a、C-10a， H-4和C-4a、C-10a， H-6和C-5a、C-9a，以及H-9和C-10、C-5a、C-9a的HMBC相关得到确定。

化合物的母体骨架确定后，剩余的取代基(羟甲基、乙酰基和甲氧基)位置可通过进一步分析其HMBC相关确定（见图3）。根据H₃-12与C-8，H-9与C-11的HMBC相关，可确定乙酰基取代在C-8位；根据H₂-13与C-3、C-4，H-4与C-13的HMBC相关，可确定羟甲基取代在C-3位。最后，根据甲氧基氢(δ _H 3.79)与C-7的HMBC相关，可确定甲氧基取代在C-7位。至此，本发明化合物的结构得到确认，鉴定为：8-乙酰基-3-羟甲基-7-甲氧基-10H-苯并吡喃[3,2-c]吡啶-10-酮。

化合物的红外、紫外和质谱数据：UV (CH₃OH) λ _max (log ε)222 (4.22)、246(4.08)、298 (3.80)、336 nm (3.72)；IR (KBr) ν _max3389、3262、3068、2952、1680、1642、1610、1548、1475、1410、1216、1180、1053, 896 cm^-1；¹H NMR和 ¹³C NMR 数据 (CDCl₃, 500和 125 MHz) 见表1；正离子模式 ESIMS m/z322 [M+Na]⁺，HRESIMS m/z322.0696 [M+Na]⁺(计算值 C₁₆H₁₃NNaO₅,322.0691)。

表1实施例1制备的化合物的 ¹H NMR 和 ¹³C NMR 数据 (溶剂为CDCl₃)

实施例2

本实施例鹤庆唐松草样品来源于云南大理剑川县。取鹤庆唐松草全株晒干，粉碎到约 40 目。称取3.6 kg粉碎后的样品，置于20 L的玻璃反应釜中，加入95%的乙醇8 L，回流提取40 min，滤出提取液；再次往残渣中加入95%的乙醇8 L，回流提取40 min，滤除提取液。合并两次提取液浓缩到小体积，然后用3%的酒石酸溶液 8 L 稀释，用8 L的乙酸乙酯萃取2次。萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用8 L的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏58.2g。浸膏用80g (80-100 目) 粗硅胶拌样，烘干，用 180g硅胶 (150-200目) 柱色谱，三氯甲烷：丙酮（20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5）梯度洗脱，分成6个部分。选取8:2洗脱部分进行HPLC进一步分离：用Agilent公司的Zorbax PrepHT GF(21.2 mm × 25 cm) 反相柱，以 62% 甲醇水溶液为流动相，流速为20 mL/min，紫外检测器检测波长为336 nm，收集 33.5 min 的色谱峰，多次累加后蒸干，得化合物粗品。粗品再用甲醇溶解，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱净化，得化合物纯品。

本实施例制备的化合物为棕红色胶状物。对其结构采用实施例1相同的方法进行测定，确认实施例2制备的化合物为8-乙酰基-3-羟甲基-7-甲氧基-10H-苯并吡喃[3,2-c]吡啶-10-酮。

实施例3

本实施例鹤庆唐松草样品来源于云南剑洱源县。取鹤庆唐松草全株晒干，粉碎到约 50 目。称取4.0 kg粉碎后的样品，置于20 L的玻璃反应釜中，加入95%的乙醇10 L，回流提取30 min，滤出提取液；再次往残渣中加入95%的乙醇10 L，回流提取50 min，滤除提取液。合并两次提取液浓缩到小体积，然后用3%的酒石酸溶液 10 L 稀释，用10 L的乙酸乙酯萃取2次。萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用8 L的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏66.9g。浸膏用80g (80-100 目) 粗硅胶拌样，烘干，用280 g硅胶 (150-200目) 柱色谱，三氯甲烷：丙酮（20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5）梯度洗脱，分成6个部分。选取8:2洗脱部分进行HPLC进一步分离：用Agilent公司的Zorbax PrepHT GF(21.2 mm × 25 cm) 反相柱，以 62% 甲醇水溶液为流动相，流速为20 mL/min，紫外检测器检测波长为336 nm，收集 33.5 min 的色谱峰，多次累加后蒸干，得化合物粗品。粗品再用甲醇溶解，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱净化，得化合物纯品。

本实施例制备的化合物为棕红色胶状物。对其结构采用实施例1相同的方法进行测定，确认实施例3制备的化合物为8-乙酰基-3-羟甲基-7-甲氧基-10H-苯并吡喃[3,2-c]吡啶-10-酮。

实施例4 抗烟草黑胫病活性试验

对实施例1制备的色酮生物碱类化合物进行抗烟草黑胫病活性试验。

一、化合物的抑制烟草疫霉菌效果实验

试验方法：燕麦片加水1000 mL, 在沸水浴上加热1 小时，纱布过滤后加水补足1000 mL，然后加糖和琼脂，加热使琼脂完全熔化后，趁热用纱布(中间加脱脂棉) 过滤于三角瓶中，121 ℃、15 磅灭菌20min (分钟)，取出冷却至45℃左右，于无菌操作台上加入氨苄青霉素(5 mg/100 mL) , 混匀后倾倒于平皿中, 28℃培养48 小时，经检查无菌后待用。

取直径5 mm 的圆形滤纸, 放入培养皿中, 置于15 磅高压灭菌30 min, 烘干后分别浸入20 µM的实施例1制备的化合物、75%乙醇溶液及灭菌蒸馏水中。于无菌操作台上用无菌吸管分别吸取0.2 mL 烟草疫霉菌的新鲜菌液于燕麦片琼脂培养基平板上。用三角玻璃涂棒涂布均匀, 将滤纸片用镊子分别轻贴于相应的平板上, 置28℃培养观察实验结果,测定抑菌圈大小。同时，以农用氯霉素作为阳性对照。

结果：本发明的色酮生物碱类化合物抑菌圈直径为13.6±1.1 mm，阳性对照农用氯霉素的抑菌圈直径为12.2±1.2 mm。说明本发明化合物的抑制烟草疫霉菌效果显著优于阳性对照农用氯霉素，具有突出的抑制黑胫病活性。

二、化合物的烟草黑胫病防治效果实验

试验方法：烟苗移栽到直径10 cm，高10 cm的花盆中，栽培基质为：灭菌土壤、草炭、珍珠岩培养(2:2:1) ，每盆1 株。移栽缓苗后于根部加入菌谷10 g/株，将烟苗置于人工气候室内培养，白天30 ℃，黑夜28 ℃，光照∶ 黑暗 ( 12 h :12 h) ，相对湿度95%。，使烟苗发病。在黑胫病发病前使用20 µM的本发明化合物对烟苗进行灌根处理，每株浇10 mL；共浇2次。，每个处理10 株，重复3 次， 14 d 后调查发病情况，计算病情指数。

结果：本发明化合物对烟草黑胫病防治效果为(66.8±3.5)%，具有显著的烟草黑胫病防治效果。

Claims (9)

1.一种具有下述结构的色酮生物碱类化合物，

。

2.一种制备权利要求1所述色酮生物碱类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）浸膏提取：将鹤庆唐松草全株干燥粉碎后于玻璃反应釜中以第一溶剂进行回流提取，得到的提取液浓缩后用第二溶剂萃取得浸膏；

2）硅胶柱层析：浸膏用第三溶剂溶解后，用80-100 目的粗硅胶拌样，经150-200目的硅胶柱色谱层析，以三氯甲烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集三氯甲烷-丙酮溶液体积比为8:2的洗脱液；

3）高压液相色谱分离纯化：将洗脱液用HPLC色谱分离得到化合物粗品；

4）将所述化合物粗品用用凝胶柱进一步分离纯化得化合物纯品。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤1中，所述第一溶剂为95%的乙醇。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤1中，所述第二溶剂为乙酸乙酯，萃取方法为：提取液浓缩到小体积，然后用3%的酒石酸溶液稀释，再用等体积的乙酸乙酯萃取2-3次；萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用3~5 L的乙酸乙酯萃取2-3次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得浸膏。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤2中，梯度洗脱的三氯甲烷-丙酮溶液体积比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5。

6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤2中，第三溶剂为甲醇或丙酮或乙醇。

7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤3中，高压液相色谱分离纯化采用21.2 mm × 250 mm，5 µm的C₁₈色谱柱，流速为20 mL/min，流动相为62%的甲醇，紫外检测器检测波长为336 nm，收集33.5 min的色谱峰，多次累加后蒸干。

8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤4中，化合物粗品先用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱纯化分离。

9.权利要求1所述化合物在制备抗烟草黑胫病生物农药中的应用。

Images