CN110483396B - 一种异戊烯基异喹啉生物碱类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种异戊烯基异喹啉生物碱类化合物及其制备方法和应用。该化合物以星毛唐松草全株为原料，经乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化后得到。分子式为C₁₈H₂₁NO₃，具有下述结构式：

命名为：3‑羟基‑1‑(6‑甲氧基‑7‑异戊烯基异喹啉‑1‑基)‑丙‑1‑酮。该化合物对烟草疫霉菌的抑制作用显著优于农用链霉素，对烟草黑胫病防治效果达到(65.7±3.0)％。本发明生产原料分布广、生物产量大、生物碱含量高，化合物制备工艺简单，生产成本低、容易实现产业化应用。

Description

一种异戊烯基异喹啉生物碱类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体是涉及一种从星毛唐松草中首次提取分离得到的异戊烯基异喹啉生物碱类化合物。同时，本发明还涉及该化合物的制备方法，以及该化合物在烟草黑胫病防治中的应用。

背景技术

唐松草属(拉丁学名：Thalictrum L.)属于毛茛科多年生草本植物。该属植物全球约有200种，其中中国约有67种，多数分布于西南部。在全世界的唐松草属植物中，有化学成分报道的该属植物有90余种，主要活性成分有生物碱、皂甙、黄酮等类型。超过43种的该属植物在中国有民间药用记载。星毛唐松草(拉丁学名：Thalictrum cirrhosum H.Lev.)，是唐松草属下的一种草本植物，其主要分布在我国云南昆明至大理一带海拔2200-2400米间山地沟旁灌丛中或山坡上。该植物全草可入药，可用于治疗黄疸、肝炎、消化道炎症、过敏等症状。前期研究表明星毛唐松草富含生物碱类活性成分。

烟草黑胫病是烟草生产上最具毁灭性的病害之一，又称烟草疫病，烟农称为“黑杆疯”、“黑根”、“乌头病”。中国各主要产烟区均有不同程度发生，其中安徽、山东、河南省为历史上的重病区；云南、贵州、四川、湖南、广东、广西、福建等南方烟区发生亦相当普遍。目前黑胫病的防治主要通过轮作栽培、品种基因改良、生物农药等方法实现防治。其中用生物农药防治是最常用且最容易实现的方法。

从药用植物资源中发现具有植物病害防治功效的新活性物质一直是国内外生物农药研究的热点。本发明通过对星毛唐松草化学成分的研究和活性筛选，提取分离得到了一种新的异戊烯基异喹啉生物碱类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道，值得一提的是该化合物具有显著的抗烟草黑胫病病毒活性的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的异戊烯基异喹啉生物碱类化合物。

本发明的另一个目的是提供一种制备所述异戊烯基异喹啉生物碱类化合物的方法。

本发明的目的还在于提供所述异戊烯基异喹啉生物碱类化合物在烟草黑胫病防治中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

一种异戊烯基异喹啉生物碱类化合物，其分子式为C₁₈H₂₁NO₃，具有下述结构式：

该化合物命名为：3-羟基-1-(6-甲氧基-7-异戊烯基异喹啉-1-基)-丙-1-酮，英文名为：3-hydroxy-1-(6-methoxy-7-prenylisoquinolin-1-yl)propan-1-one。

一种制备所述异戊烯基异喹啉生物碱类化合物的方法，包括以下步骤：

(1)浸膏提取：取星毛唐松草全株晒干，粉碎到35～60目，将粉碎后的样品置于玻璃反应釜中，用95％的乙醇回流提取2次，合并两次提取液浓缩到小体积，然后用3％的酒石酸溶液稀释，再用乙酸乙酯萃取2次；萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏；

(2)硅胶柱层析：步骤(1)所得浸膏用重量比1.5～3倍量的纯甲醇或纯乙醇或纯丙酮溶解后，用重量比0.8～2.5倍的80～100目硅胶拌样，烘干；装柱硅胶为150～200目，用量为浸膏重量的3～6倍；以重量比 20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5的三氯甲烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

(3)高压液相色谱分离纯化：取柱层析梯度洗脱液的8:2部分进行高压液相色谱分离纯化：用Agilent公司的Zorbax PrepHT GF，21.2mm×25 cm反相柱，以62％甲醇水溶液为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为342nm，收集26.2min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得到所述的异戊烯基异喹啉生物碱类化合物。

步骤(3)中，经高压液相色谱分离纯化后得到的化合物再用纯甲醇溶解，并以纯甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱层析分离，得到的黄色胶状物即为化合物纯品。

化合物的结构鉴定：

本发明化合物为黄色胶状物，HRESI-MS显示其准分子离子峰为 322.1412[M+Na]⁺，结合¹H和¹³C NMR谱确定分子式为C₁₈H₂₁NO₃，为生物碱类化合物，且化合物的不饱和度为9。其红外光谱显示化合物中有羟基 (3397cm^-1)、羰基(1668cm^-1)和芳环(1614、1548和1462cm^-1)信号，紫外光谱在222、268、305和342nm有最大吸收也证实化合物中存在芳环结构。化合物的¹H、¹³C-NMR和DEPT谱(表-1)显示其含有18个碳和21个氢。包括：一个1,6,7-取代的异喹啉母核(C-1～C-10；H-3,H-4,H-5,和H-8)，一个异戊烯基(-CH₂CH＝C(CH₃)₂，C-1″～C-5″，H₂-1″、H-2″、H₃-4″和H₃-5″)，一个3-羟基丙-1-酮基(-CO-CH₂CH₂-OH；C-1′～C-3′；H₂-2′和H₂-3′)，以及一个甲氧基(δ_C 56.2q，δ_H 3.79s)。异喹啉母核的存在可通过化合物中H-3 和C-1、C-4、C-10；H-4和C-3、C-5、C-9、C-10；H-5和C-4、C-9、C- 10；以及H-8和C-1、C-9、C-10的HMBC相关(图3 )证实。异戊烯基的存在可通过H₂-1″和H-2″的¹H-¹H COSY相关，以及H₂-1″和C-2″、C-3″，H- 2″和C-1″、C-3″、C-4″、C-5″，H₃-4″和C-3″、C-2″、C-5″，H₃-5″和C-3″、 C-2″、C-4″的HMBC相关得到证实，3-羟基丙-1-酮基的存在可通过H₂-2′和 H₂-3′的¹H-¹H COSY相关，以及H₂-2′和C-1′、C-3′，H₃-3′和C-1′、C-2′的 HMBC相关得到证实。

化合物的母核和关键取代片段确定后，可进一步通过HMBC相关确定异戊烯基、3-羟基丙-1-酮基和甲氧基的位置。通过H₂-1″和C-6、C-7、C-8， H-2″和C-7，以及H-8和C-1″的HMBC相关，可证实异戊烯基取代在C-7 位。通过H₂-2′和C-1的HMBC相关，可证实3-羟基丙-1-酮基取代在C-1 位。通过甲氧基氢(δ_H 3.79)和C-6(δ_C 162.5)的HMBC相关，可证实甲氧基取代在C-6位。至此化合物的结构得到确认，该化合物命名为：3-羟基-1- (6-甲氧基-7-异戊烯基异喹啉-1-基)-丙-1-酮。

表-1、化合物的¹H和¹³C核磁共振数据(溶剂CDCl3，500和125MHz)

化合物的红外、紫外和质谱数据：UV(CH₃OH)λ_max(logε)222(4.22)、 268(3.60)、305(3.57)、342(3.53)nm；IR(KBr)ν_max 3397、3054、2960、 1668、1614、1548、1462、1360、1238、1159、1046、926、853cm^-1；¹H NMR和¹³C NMR数据(CDCl₃,500和125MHz)见表-1；正离子模式 ESIMS m/z 322[M+Na]⁺，HRESIMS m/z 322.1412[M+Na]⁺(计算值 C₁₈H₂₁NNaO₃,322.1419)。

本发明的异戊烯基异喹啉生物碱类化合物在烟草黑胫病防治中的应用。

1、烟草黑胫病是由烟草疫霉菌浸染而导致的，测定本发明化合物抑制烟草疫霉菌活性的能力，包括以下步骤：

(1)燕麦片琼脂培养基的制备：燕麦片加水1000mL,在沸水浴上加热1小时，纱布过滤后加水补足1000mL，然后加糖和琼脂，加热使琼脂完全熔化后，趁热用纱布(中间加脱脂棉)过滤于三角瓶中，121℃、15磅灭菌20min,取出冷却至45℃左右，于无菌操作台上加入氨苄青霉素(5 mg/100mL),混匀后倾倒于平皿中,28℃培养48小时，经检查无菌后待用。

(2)抑菌实验：取直径5mm的圆形滤纸,放入培养皿中,置于15磅高压灭菌30min,烘干后分别浸入20μM的化合物、75％乙醇溶液及灭菌蒸馏水中。于无菌操作台上用无菌吸管分别吸取0.2mL烟草疫霉菌的新鲜菌液于燕麦片琼脂培养基平板上。用三角玻璃涂棒涂布均匀,将滤纸片用镊子分别轻贴于相应的平板上,置28℃培养观察实验结果,测定抑菌圈大小。同时，以农用氯霉素作为阳性对照。

测试结果表明：本发明的异戊烯基异喹啉生物碱类化合物抑菌圈直径为13.8±1.2mm，阳性对照农用氯霉素的抑菌圈直径为12.2±1.0mm。说明本发明化合物抑制烟草疫霉菌的效果显著优于阳性对照农用氯霉素，具有突出的抑制黑胫病活性。

2、本发明化合物对烟草黑胫病的防治效果：

烟苗移栽到直径10cm，高10cm的花盆中，栽培基质为：灭菌土壤、草炭、珍珠岩培养(2:2:1)，每盆1株。移栽缓苗后于根部加入菌谷10g/株，将烟苗置于人工气候室内培养，白天30℃，黑夜28℃，光照∶黑暗(12 h:12h)，相对湿度95％，使烟苗发病。在黑胫病发病前使用20μM的本发明化合物对烟苗进行灌根处理，每株浇10mL；共浇2次。每个处理10株，重复3次，14d后调查发病情况，计算病情指数。结果表明：本发明化合物对烟草黑胫病防治效果为(65.7±3.0)％，具有显著的烟草黑胫病防治效果。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明从星毛唐松草中首次提取分离得到一种异戊烯基异喹啉生物碱类化合物，其对烟草疫霉菌的抑制作用显著优于农用链霉素，对烟草黑胫病防治效果达到(65.7±3.0)％。该化合物的应用，将给烟草黑茎病防治提供高效、安全的新型生物农药分子结构。

(2)本发明生产原料(星毛唐松草)分布广、生物产量大、生物碱含量高，化合物制备工艺简单，生产成本低、容易实现产业化应用。

附图说明

图1为本发明异戊烯基异喹啉生物碱类化合物的核磁共振碳谱；

图2为本发明异戊烯基异喹啉生物碱类化合物的核磁共振氢谱；

图3为本发明异戊烯基异喹啉生物碱类化合物的主要HMBC相关图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步地详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化或等同替换，均应属于本发明的保护范围。

实施例1

制备异戊烯基异喹啉生物碱类化合物C₁₈H₂₁NO₃，包括浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离，具体采用以下步骤：

(1)、浸膏提取：取星毛唐松草全株晒干，粉碎到约35～60目。称取 2.6～4.3kg粉碎后的样品，置于20L的玻璃反应釜中，加入95％的乙醇 6～10L，回流提取35～60min，滤出提取液；再次往残渣中加入95％的乙醇 6～10L，回流提取35～60min，滤除提取液。合并两次提取液浓缩到小体积，然后用3％的酒石酸溶液4～6L稀释，用4～6L的乙酸乙酯萃取2次。萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用4～6L的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏38.6～61.2g。

(2)硅胶柱层析：浸膏用重量比1.5～3倍量的纯甲醇或纯乙醇或纯丙酮溶解后，然后用30～80g(80-100目)粗硅胶拌样，烘干，用120～220g硅胶(150-200目)柱色谱，三氯甲烷：丙酮(20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5) 梯度洗脱，分成6个部分。

(3)、高压液相色谱分离纯化：选取8:2洗脱部分进行HPLC进一步分离：用Agilent公司的Zorbax PrepHT GF(21.2mm×25cm)反相柱，以62％甲醇水溶液为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为342nm，收集26.2min的色谱峰，多次累加后蒸干，得化合物粗品。粗品再用甲醇溶解，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱净化，得化合物纯品。

本发明所用星毛唐松草原料不受地区和品种限制，均可以实现本发明，下面以来源于云南大理的星毛唐松草原料对本发明做进一步说明：

实施例2

星毛唐松草样品来源于云南大理鹤庆县。取星毛唐松草全株晒干，粉碎到约40目。称取2.8kg粉碎后的样品，置于20L的玻璃反应釜中，加入 95％的乙醇6L，回流提取50min，滤出提取液；再次往残渣中加入95％的乙醇6L，回流提取50min，滤除提取液。合并两次提取液浓缩到小体积，然后用3％的酒石酸溶液6L稀释，用6L的乙酸乙酯萃取2次。萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用6L的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏42.3g。浸膏用50g(80-100目)粗硅胶拌样，烘干，用150g硅胶(150-200目)柱色谱，三氯甲烷：丙酮(20:1、9:1、 8:2、7:3、6:4、5:5)梯度洗脱，分成6个部分。选取8:2洗脱部分进行 HPLC进一步分离：用Agilent公司的Zorbax PrepHT GF(21.2mm×25cm) 反相柱，以62％甲醇水溶液为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为342nm，收集26.2min的色谱峰，多次累加后蒸干，得化合物粗品。粗品再用甲醇溶解，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱净化，得化合物纯品。

实施例3

星毛唐松草样品来源于云南大理宾川县。取星毛唐松草全株晒干，粉碎到约40目。称取3.2kg粉碎后的样品，置于20L的玻璃反应釜中，加入 95％的乙醇8L，回流提取40min，滤出提取液；再次往残渣中加入95％的乙醇8L，回流提取40min，滤除提取液。合并两次提取液浓缩到小体积，然后用3％的酒石酸溶液8L稀释，用8L的乙酸乙酯萃取2次。萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用8L的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏42.8g。浸膏用60g(80-100目)粗硅胶拌样，烘干，用160g硅胶(150-200目)柱色谱，三氯甲烷：丙酮(20:1、9:1、 8:2、7:3、6:4、5:5)梯度洗脱，分成6个部分。选取8:2洗脱部分进行 HPLC进一步分离：用Agilent公司的Zorbax PrepHT GF(21.2mm×25cm) 反相柱，以62％甲醇水溶液为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为342nm，收集26.2min的色谱峰，多次累加后蒸干，得化合物粗品。粗品再用甲醇溶解，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱净化，得化合物纯品。

实施例4

星毛唐松草样品来源于云南剑川县。取星毛唐松草全株晒干，粉碎到约50目。称取4.2kg粉碎后的样品，置于20L的玻璃反应釜中，加入95％的乙醇10L，回流提取30min，滤出提取液；再次往残渣中加入95％的乙醇10L，回流提取50min，滤除提取液。合并两次提取液浓缩到小体积，然后用3％的酒石酸溶液10L稀释，用10L的乙酸乙酯萃取2次。萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用8L的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏53.8g。浸膏用70g(80-100目)粗硅胶拌样，烘干，用180g硅胶(150-200目)柱色谱，三氯甲烷：丙酮(20:1、 9:1、8:2、7:3、6:4、5:5)梯度洗脱，分成6个部分。选取8:2洗脱部分进行HPLC进一步分离：用Agilent公司的Zorbax PrepHT GF(21.2mm×25 cm)反相柱，以62％甲醇水溶液为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为342nm，收集26.2min的色谱峰，多次累加后蒸干，得化合物粗品。粗品再用甲醇溶解，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱净化，得化合物纯品。

实施例5

------化合物结构的鉴定

取实施例2制备的异戊烯基异喹啉生物碱类化合物，通过以下方法进行测定。化合物为黄色胶状物，HRESI-MS显示其准分子离子峰为 322.1412[M+Na]⁺，结合¹H和¹³C NMR谱确定分子式为C₁₈H₂₁NO₃，为生物碱类化合物，且化合物的不饱和度为9。其红外光谱显示化合物中有羟基 (3397cm^-1)、羰基(1668cm^-1)和芳环(1614、1548和1462cm^-1)信号，紫外光谱在222、268、305和342nm有最大吸收也证实化合物中存在芳环结构。化合物的¹H、¹³C-NMR和DEPT谱(表-1)显示其含有18个碳和21个氢。包括：一个1,6,7-取代的异喹啉母核(C-1～C-10；H-3,H-4,H-5,和H-8)，一个异戊烯基(-CH₂CH＝C(CH₃)₂，C-1″～C-5″，H₂-1″、H-2″、H₃-4″和H₃-5″)，一个3-羟基丙-1-酮基(-CO-CH₂CH₂-OH；C-1′～C-3′；H₂-2′和H₂-3′)，以及一个甲氧基(δ_C 56.2q，δ_H 3.79s)。异喹啉母核的存在可通过化合物中H-3 和C-1、C-4、C-10；H-4和C-3、C-5、C-9、C-10；H-5和C-4、C-9、C- 10；以及H-8和C-1、C-9、C-10的HMBC相关(图3 )证实。异戊烯基的存在可通过H₂-1″和H-2″的¹H-¹H COSY相关，以及H₂-1″和C-2″、C-3″，H- 2″和C-1″、C-3″、C-4″、C-5″，H₃-4″和C-3″、C-2″、C-5″，H₃-5″和C-3″、 C-2″、C-4″的HMBC相关得到证实，3-羟基丙-1-酮基的存在可通过H₂-2′和 H₂-3′的¹H-¹H COSY相关，以及H₂-2′和C-1′、C-3′，H₃-3′和C-1′、C-2′的 HMBC相关得到证实。

化合物的母核和关键取代片段确定后，可进一步通过HMBC相关确定异戊烯基、3-羟基丙-1-酮基和甲氧基的位置。通过H₂-1″和C-6、C-7、C-8， H-2″和C-7，以及H-8和C-1″的HMBC相关，可证实异戊烯基取代在C-7 位。通过H₂-2′和C-1的HMBC相关，可证实3-羟基丙-1-酮基取代在C-1 位。通过甲氧基氢(δ_H 3.79)和C-6(δ_C 162.5)的HMBC相关，可证实甲氧基取代在C-6位。至此化合物的结构得到确认，该化合物命名为：3-羟基-1- (6-甲氧基-7-异戊烯基异喹啉-1-基)-丙-1-酮。

实施例6

取实施例3制备的化合物，为黄色胶状物。测定方法与实施例5相同，确认实施例3制备的化合物为所述的异戊烯基异喹啉生物碱类化合物——3- 羟基-1-(6-甲氧基-7-异戊烯基异喹啉-1-基)-丙-1-酮。

实施例7

取实施例4制备的化合物，为黄色胶状物。测定方法与实施例5相同，确认实施例4制备的化合物为所述的3-羟基-1-(6-甲氧基-7-异戊烯基异喹啉 -1-基)-丙-1-酮。

实施例8

取实施例1-4制备的任一异戊烯基异喹啉生物碱类化合物进行抗烟草黑胫病活性试验，试验情况如下：

(1)燕麦片加水1000mL,在沸水浴上加热1小时，纱布过滤后加水补足1000mL，然后加糖和琼脂，加热使琼脂完全熔化后，趁热用纱布(中间加脱脂棉)过滤于三角瓶中，121℃、15磅灭菌20min,取出冷却至45℃左右，于无菌操作台上加入氨苄青霉素(5mg/100mL),混匀后倾倒于平皿中,28℃培养48小时，经检查无菌后待用。

(2)取直径5mm的圆形滤纸,放入培养皿中,置于15磅高压灭菌30 min,烘干后分别浸入20μM的化合物、75％乙醇溶液及灭菌蒸馏水中。于无菌操作台上用无菌吸管分别吸取0.2mL烟草疫霉菌的新鲜菌液于燕麦片琼脂培养基平板上。用三角玻璃涂棒涂布均匀,将滤纸片用镊子分别轻贴于相应的平板上,置28℃培养观察实验结果,测定抑菌圈大小。同时，以农用氯霉素作为阳性对照。

(3)测试结果表明，本发明的异戊烯基异喹啉生物碱类化合物抑菌圈直径为13.8±1.2mm，阳性对照农用氯霉素的抑菌圈直径为12.2±1.0mm。说明本发明化合物抑制烟草疫霉菌效果显著优于阳性对照农用氯霉素，具有突出的抑制黑胫病活性。

(4)烟苗移栽到直径10cm，高10cm的花盆中，栽培基质为：灭菌土壤、草炭、珍珠岩培养(2:2:1)，每盆1株。移栽缓苗后于根部加入菌谷 10g/株，将烟苗置于人工气候室内培养，白天30℃，黑夜28℃，光照∶黑暗(12h:12h)，相对湿度95％，使烟苗发病。在黑胫病发病前使用20 μM的本发明化合物对烟苗进行灌根处理，每株浇10mL；共浇2次。每个处理10株，重复3次，14d后调查发病情况，计算病情指数。结果表明：本发明化合物对烟草黑胫病防治效果为(65.7±3.0)％，具有显著的烟草黑胫病防治效果。

Claims (4)

1.一种异戊烯基异喹啉生物碱类化合物，其分子式为C₁₈H₂₁NO₃，具有下述结构式：

该化合物命名为：3-羟基-1-(6-甲氧基-7-异戊烯基异喹啉-1-基)-丙-1-酮，英文名为：3-hydroxy-1-(6-methoxy-7-prenylisoquinolin-1-yl)propan-1-one。

2.权利要求1所述异戊烯基异喹啉生物碱类化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)浸膏提取：取星毛唐松草全株晒干，粉碎到35～60目，将粉碎后的样品置于玻璃反应釜中，用95％的乙醇回流提取2次，合并两次提取液浓缩到小体积，然后用3％的酒石酸溶液稀释，再用乙酸乙酯萃取2次；萃取完后水相用碳酸钠饱和，再次用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取的乙酸乙酯相，减压浓缩得生物碱部位浸膏；

(2)硅胶柱层析：步骤(1)所得浸膏用重量1.5～3倍量的纯甲醇或纯乙醇或纯丙酮溶解后，用重量0.8～2.5倍的80～100目硅胶拌样，烘干；装柱硅胶为150～200目，用量为浸膏重量的3～6倍；以重量比20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5的三氯甲烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

(3)高压液相色谱分离纯化：取柱层析梯度洗脱液的8:2部分进行高压液相色谱分离纯化：用Agilent公司的Zorbax PrepHT GF，21.2mm×25cm反相柱，以62％甲醇水溶液为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为342nm，收集26.2min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得到所述的异戊烯基异喹啉生物碱类化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，经高压液相色谱分离纯化后得到的化合物再用纯甲醇溶解，并以纯甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱层析分离，得到的黄色胶状物即为化合物纯品。

4.权利要求1所述的异戊烯基异喹啉生物碱类化合物在烟草黑胫病防治中的应用。

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