CN113717184B - 雪茄烟中一种具有抗烟草花叶病毒活性的喹啉生物碱及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种喹啉生物碱(Ⅰ)及其制备方法和应用。以雪茄烟烟叶为原料，以高浓度甲醇、高浓度丙酮/水或高浓度乙醇/水提取，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏；浸膏用硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以氯仿‑丙酮溶液进行梯度洗脱；洗脱液的7:3部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所需的喹啉生物碱。本发明还公开了上述化合物的用途，经活性测试表明，其对烟草花叶病毒具有很好的抑制作用。本发明化合物结构新颖，且具有较好的抗毒活性较好，可作为抗烟草花叶病毒的先导化合物用于抗烟草花叶病毒药物制剂研发。
Description
技术领域
本发明属于雪茄烟综合利用技术领域，具体涉及一种从雪茄烟中首次提取得到的喹啉生物碱。同时，本发明还涉及该化合物的制备方法和在抗烟草花叶病毒中的应用。
背景技术
烟草是世界上化学成分最为复杂的植物，次生代谢产物非常丰富，据1982年Dube和Green等报道，烟草中已鉴定出的化学成分就超过2549种，到2008年，Rodgman和perfetti的报道称，烟草、烟草代用品以及卷烟烟气中发现的化合物总数大约为8700种。目前，人们从烟草中鉴定出来的单体化学物质就超过3000多种，而且还有许多成分尚未鉴定出来。
雪茄烟属于烟草属栽培烟草(Nicotiana tabacum)的变种。雪茄烟经过烟叶种植、晾制、发酵后，卷制成品，供消费者吸食。雪茄烟是中国烟草核心竞争力的重要组成部分，是卷烟消费的有益补充。自2012年以来，国内雪茄烟市场呈现爆发式增长，年均销量增幅保持在40％以上，到2019年，国内手工雪茄产销量已突破540万支。中国雪茄市场已初具规模，国内雪茄消费群体正在不断发展与壮大。此外，雪茄烟除主要用于卷烟抽吸用途外，还可从中提取多种有利用价值的化学成分，为药物和生物农药开发提供新的先导性化合物。
喹啉生物碱类化合物在很多天然植物中存在，这类生物碱的生理活性极强，一直是国内外研究开发利用的热点。无论是从天然植物中提取还是人工合成或分子结构改造，以及构效关系的研究，异喹啉类生物碱一直是寻找有开发应用前景的先导化合物和生物活性成分的源泉。为可从烟草属植物中发现更多的活性化合物，发展和方法烟草的非吸烟用途，本发明从云南雪茄烟烟叶中分离得到了一种新的喹啉生物碱，该化合物至今尚未见到相关报道，值得一提的是该化合物具有显著的抗烟草花叶病毒活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的喹啉生物碱。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述喹啉生物碱的方法。
本发明的目的还在于提供所述喹啉生物碱在抗烟草花叶病毒中的应用。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
本发明从雪茄烟中分离出一种新的喹啉生物碱，其分子式为C13H11NO3，具有下述结构式：
该化合物的命名为：(7-甲氧基-呋喃[3,2-c]喹啉-6-基)-甲醇，英文名为：(7-methoxy-furo[3,2-c]quinolin-6-yl)-methanol，为浅黄色胶状物。
制备所述喹啉生物碱的方法，该方法包括以下步骤：
(1)浸膏提取：将烟叶样品粉碎，用高浓度甲醇(w％：80％～100％)或高浓度乙醇(w％：80％～100％)或高浓度丙酮(w％：60％～90％)为提取溶剂，提取溶剂：雪茄烟(重量比)＝2～4:1，浸泡24h～72h，提取3～5次，合并提取液、过滤浓缩成浸膏；
(2)硅胶柱层析：浸膏用重量比1.5～3倍量的纯甲醇或纯乙醇或纯丙酮溶解后用重量比0.8～1.2倍的80～100目硅胶拌样，用重量比2～4倍量的160～300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为(1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2)的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；
(3)高压液相色谱分离纯化：柱层析洗脱液的7:3部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的喹啉生物碱。
高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C18色谱柱，流速为20mL/min，流动相为52％的甲醇，紫外检测器检测波长为334nm，每次进样200μL，收集30.2min的色谱峰，多次累加后蒸干。
经所述高效液相色谱分离纯化后，一个优选的后续处理方案为，所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。
表-1.化合物的1H NMR和13C NMR数据(CDCl3)
以上述方法制备得到的喹啉生物碱的结构通过以下方法进行测定。本发明化合物为浅黄色胶状物。高分辨质谱(HR-ESIMS)给出准分子离子峰m/z 252.0645[M+Na]+(计算值252.0637)。结合1H和13C NMR谱给出一个分子式C13H11NO3，不饱和度为9。其红外光谱显示有羟基(3389cm-1)、碳氮键(1819cm-1)和芳环(1614,1469,1374cm-1)结构，紫外光谱在210、242、334nm有最大吸收证实化合物中存在芳环共轭结构。化合物的1H和13C NMR和DEPT数据(表-1)显示化合物中存在13个碳和11个氢，包含1个1,2,4,5-四取代的苯环(C-5～C-8，C-4a和C-8a；H-5和H-8)，一个呋喃结构片段(C-2和C-3,H-2和H-3)，一个羟甲基(-CH2-OH,C-1'和H-1')，一个甲氧基(-MeO-7，δH 3.78s和δC 56.3q)，以及一个–C＝C-CH＝N-结构片段(C-4，C-3a，C-9a；H-9a)。
根据其核磁共振信号，苯环、呋喃环和–C＝C-CH＝N-结构片段包含了9个不饱和度中的8个，苯环和–C＝C-CH＝N-结构片段之间应该形成1个喹啉环以满足9个不饱和度，而且可推测化合物可能是呋喃[3,2-c]喹啉结构。该推测进一步可通过H-5和C-4、C-4a、C-8a，H-8和C-4a、C-8a，H-9a和C-3、C-4、C-3a、C-8a，H-2和C-4、C-3a，以及H-3和C-4、C-3a、C-9a的HMBC相关的到证实。
化合物中的呋喃[3,2-c]喹啉骨架得到确认后，其他取代基(羟甲基和甲氧基)的位置也可通过分析其HMBC相关得到确认。羟甲基取代在C-6位可通过H-1'和C-5、C-6、C-7的HMBC相关确定，进一步通过甲氧基氢(δH 3.78s)和C-7的HMBC相关可确定甲氧基取代在C-7位。至此，化合物的结构得到确认，并命名为：(7-甲氧基-呋喃[3,2-c]喹啉-6-基)-甲醇。
化合物的红外、紫外和质谱数据：UV(MeOH),λmax(logε)210(4.58)、242(4.32)、334(3.90)nm；IR(KBr)νmax 3389、3084、2322、1819、1614、1469、1374、162、1058、936cm-1；ESI-MS(正离子模式)m/z 252[M+Na]+；HR-ESI-MS(正离子模式)m/z 252.0645[M+Na]+(计算值252.0637，C13H11NNaO3)。
采用半叶法进行了本发明化合物的抗烟草花叶病毒活性测试，结果明本化合物的相对抑制率为42.2％，超过对照宁南霉素的相对抑制率32.5％，说明化合物有很好的抗烟草花叶病毒活性。
本发明化合物是首次被分离出来的，通过上述核磁共振和质谱测定方法确定为喹啉生物碱，并表征了其具体结构。活性检测结果揭示了本发明的化合物在制备抗轮状病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性较好，提取分离和后续的人工合成容易实现，可作为抗花叶病毒药物研发的先导性化合物，并用于抗花叶病毒药物制剂研发。
附图说明
图1为本发明喹啉生物碱的核磁共振碳谱；
图2为本发明喹啉生物碱的核磁共振氢谱；
图3为本发明喹啉生物碱的主要HMBC相关。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
实施例1
制备喹啉生物碱C13H11NO3，包括浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离，具体采用以下步骤：
1.浸膏提取：取烟叶粉碎，用高浓度甲醇(w％：95％)或高浓度乙醇(w％：95％)或高浓度丙酮(w％：70％)为提取溶剂，提取溶剂：雪茄烟(重量比)＝3:5，浸泡54h，提取4次，合并提取液、过滤浓缩成浸膏。
2.硅胶柱层析：浸膏用重量比2.8倍量的纯甲醇或纯乙醇或纯丙酮溶解后用重量比1.2倍的80～100目硅胶拌样，用重量比3倍量的250目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为(1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2)的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩。
3.高压液相色谱分离：柱层析洗脱液的7:3部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的喹啉生物碱，高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C18色谱柱，流速为20mL/min，流动相为52％的甲醇，紫外检测器检测波长为334nm，每次进样200μL，收集30.2min的色谱峰，多次累加后蒸干。
高压液相色谱法分离纯化后的物质，一个优选的后处理方案为，所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。
本发明所用烟叶原料不受地区和品种限制，均可以实现本发明，下面以来源于云南中烟工业有限责任公司不同产地的烟叶原料，对本发明做进一步说明：
实施例2
雪茄烟样品来源于云南玉溪，品种为云雪8号。将雪茄烟取样2.0kg粉碎以95％的甲醇提取5次，每次提取24h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏118g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用136g的100目粗硅胶拌样，0.4kg的160目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为7:3的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以52％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为334nm，每次进样200μL，收集30.2min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物(68.4mg)。
实施例3
雪茄烟样品来源于云南德宏，品种为云雪2号，将雪茄烟取样3.5kg切碎，以95％的乙醇提取4次，每次提取48h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏280g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用250g的80目粗硅胶拌样，1.0kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以52％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为334nm，每次进样200μL，收集30.2min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物(115.6mg)。
实施例4
雪茄烟样品来源于云南临沧，品种为云雪4号，将雪茄烟取样5kg粉碎，以75％的丙酮用超声提取3次，每次提取72h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏368g。浸膏用重量比1.6倍量的纯甲醇溶解后用400g的90目粗硅胶拌样，1.4kg的180目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以52％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为334nm，每次进样200μL，收集30.2min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物(158mg)。
实施例5
------化合物结构的鉴定
取实施例1-4制备的化合物，上述方法制备得到的喹啉生物碱的结构通过以下方法进行测定。化合物为浅黄色胶状物。高分辨质谱(HR-ESIMS)给出准分子离子峰m/z252.0645[M+Na]+(计算值252.0637)。结合1H和13C NMR谱给出一个分子式C13H11NO3，不饱和度为9。其红外光谱显示有羟基(3389cm-1)、碳氮键(1819cm-1)和芳环(1614,1469,1374cm-1)结构，紫外光谱在210、242、334nm有最大吸收证实化合物中存在芳环共轭结构。化合物的1H和13C NMR和DEPT数据(表-1)显示化合物中存在13个碳和11个氢，包含1个1,2,4,5-四取代的苯环(C-5～C-8，C-4a和C-8a；H-5和H-8)，一个呋喃结构片段(C-2和C-3,H-2和H-3)，一个羟甲基(-CH2-OH,C-1'和H-1')，一个甲氧基(-MeO-7，δH 3.78s和δC56.3q)，以及一个–C＝C-CH＝N-结构片段(C-4，C-3a，C-9a；H-9a)。
根据其核磁共振信号，苯环、呋喃环和–C＝C-CH＝N-结构片段包含了9个不饱和度中的8个，苯环和–C＝C-CH＝N-结构片段之间应该形成1个喹啉环以满足9个不饱和度，而且可推测化合物可能是呋喃[3,2-c]喹啉结构。该推测进一步可通过H-5和C-4、C-4a、C-8a，H-8和C-4a、C-8a，H-9a和C-3、C-4、C-3a、C-8a，H-2和C-4、C-3a，以及H-3和C-4、C-3a、C-9a的HMBC相关的到证实。
化合物中的呋喃[3,2-c]喹啉骨架得到确认后，其他取代基(羟甲基和甲氧基)的位置也可通过分析其HMBC相关得到确认。羟甲基取代在C-6位可通过H-1'和C-5、C-6、C-7的HMBC相关确定，进一步通过甲氧基氢(δH 3.78s)和C-7的HMBC相关可确定甲氧基取代在C-7位。至此，化合物的结构得到确认，并命名为：(7-甲氧基-呋喃[3,2-c]喹啉-6-基)-甲醇。
实施例6
取实施例3制备的化合物，为黄色胶状物。测定方法与实施例5相同，确认实施例3制备的化合物为所述的喹啉生物碱——(7-甲氧基-呋喃[3,2-c]喹啉-6-基)-甲醇。
实施例7
取实施例4制备的化合物，为黄色胶状物。测定方法与实施例5相同，确认实施例4制备的化合物为所述的——(7-甲氧基-呋喃[3,2-c]喹啉-6-基)-甲醇。
实施例8
取实施例1-4制备的任喹啉生物碱进行抗烟草花叶病毒活性试验，试验情况如下：
采用半叶法，在药剂的质量浓度均为50mg/L时对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5～6龄烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先将叶片均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，立即放在盛有药液的培养皿中处理20min，取出，擦去叶片上水珠和药液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保湿的玻璃缸中，并盖上玻璃盖，控温(23±2)℃，放在温室自然光照射，2～3d即可见枯斑.每个处理都设另一半叶为对照，另外设有1组为商品宁南霉素的处理作为对比，按下公式计算相对抑制率。
XI％＝(CK-T)/CK×100％
X：相对抑制率(％)，CK：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，T浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。
结果明本化合物的相对抑制率为42.2％，超过对照宁南霉素的相对抑制率32.5％，说明化合物有很好的抗烟草花叶病毒活性。可作为烟草花叶病防治生物农药研发的新先导化合物。
Claims (3)
1.一种具有下述结构式的喹啉生物碱：
该化合物的命名为：(7-甲氧基-呋喃[3,2-c]喹啉-6-基)-甲醇，英文名为：(7-methoxy-furo[3,2-c]quinolin-6-yl)-methanol。
2.一种权利要求1所述的喹啉生物碱的制备方法，该方法包括以下步骤：
（1）浸膏提取: 以烟叶为原料，将烟叶粉碎或切成小段，用重量百分浓度80%～100%的甲醇或乙醇，或重量百分浓度60%～90%的丙酮为提取溶剂；烟叶的重量比 = 2～4:1，浸泡24 h～72 h，提取3～5次，合并提取液、过滤浓缩成浸膏；
（2）硅胶柱层析：浸膏用重量比2～4倍量的160～300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；
（3）高压液相色谱分离纯化：洗脱液的7:3部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所需的喹啉生物碱；
步骤（3）中，高压液相色谱分离纯化后的化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化；
步骤（3）中，所述的高压液相色谱分离纯化是采用21.2 mm × 250 mm，5 μm的C18色谱柱，流速为20 mL/min，流动相为52%的甲醇，紫外检测器检测波长为334 nm，每次进样200 μL，收集30.2 min的色谱峰对应的洗脱液，多次累加后蒸干；
步骤（2）中，所述的浸膏在经硅胶柱层析粗分前，用重量比1.5～3倍量的纯甲醇或纯乙醇或纯丙酮溶解后，用重量比0.8～1.2倍的80～100目硅胶拌样；
步骤（2）中，所述的梯度洗脱，氯仿-丙酮溶液体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2。
3.权利要求1所述的喹啉生物碱在抗烟草花叶病毒中的应用。
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