CN109053746A - 抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物及其制备方法，属于生物技术领域，本发明采用活性追踪的方法，从烟草中得到具有抗TMV活性的生物碱类化合物，其中3个为新化合物（1~3）[(S)‑Nkolbisine‑β‑D‑glucoside，(R)‑Nkolbisine‑β‑D‑glucoside，Lepabisine A]，9个已知化合物（4~12）均为该属植物中首次分离得到，该类生物碱对烟草普通花叶病毒具有钝化、保护、治疗及抑制病毒增殖作用，新化合物1对病毒抑制作用强于对照药物宁南霉素。本发明首次从烟草中发现具有抗TMV活性的一类生物碱类化合物，为进一步系统研究烟草内源性抗烟草花叶病物质提供了科学依据。

Description

抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物及其制备方法。
背景技术
烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)作为世界上最先发现并确定的病毒，严重危害了烟叶的产量和质量，给烟农造成了巨大的经济损失。
由于植物病毒对寄主细胞具有绝对寄生性，病毒传播方式具有多样性，而植物缺乏完整的免疫系统，因而高效抗病毒剂的开发存在极大困难，至今尚未有理想的防治药剂。目前，采用的农业防治措施存在较大的局限性，化学防治则易引发环保问题。因此，急需进行抗TMV天然产物的研究与开发。
发明内容
为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物及其制备方法，利用色谱分离、纯化技术，采用活性追踪的方法，从烟草中得到高效、特异的内源性抗TMV化学防御物质用于烟草自身，不仅可以解决抗病毒药剂对寄主植物本身的毒害作用，也可以扩宽烟草的使用空间，为进一步开发利用烟草源抗性物质提供基础。
为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物，其结构式为：
抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物的制备方法，具体包括以下步骤：
1)粗粉制备：将全株烟株自然阴干，粉碎后过40目筛得到样品粗粉；
2)浸膏提取：称取样品粗粉，用95％甲醇浸泡24小时后装入渗漏桶，压实后用95％甲醇渗漏提取至提取液颜色较浅为止，合并滤液后减压浓缩得浸膏，于4℃冰箱中保存备用；
3)硅胶柱层析分离：将浸膏用蒸馏水悬浊，分别经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，将乙酸乙酯萃取部分与60-100目硅胶拌样晾干后上100-200目硅胶色谱柱进行柱层析分离，用体积比为1:0～8:2的氯仿-甲醇进行梯度洗脱，得到组分Fr.1～Fr.4；将Fr.2用小孔树脂(MCI)除去色素后，经200～300目硅胶柱层析，以体积比为10:1～2:1的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，得到3个部分Fr.2-1～Fr.2-3；
4)反相柱层析：将Fr.2-2经反相RP-18色谱柱，以体积浓度分别为30％、70％和100％甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩；
5)高压色谱分离纯化：再经制备和半制备分离纯化得到生物碱类化合物。
进一步的，步骤2)中，粗粉与甲醇体积比为1:5。
进一步的，步骤2)中，乙酸乙酯萃取部分与硅胶按1:1.2比例拌样。
进一步的，步骤3)中，氯仿-甲醇的体积比为1:0、9:1、7:1、8:2。
进一步的，步骤3)中，石油醚-丙酮的体积比为10:1、7:1、5:1、3:1、2:1。
进一步的，步骤5)中，制备条件为18C-反相色谱柱(9.5*21.2cm)、流速10ml/min，乙腈：水35:65；半制备条件为18C-反相色谱柱(2.5*21.2cm)、流速2ml/min，乙腈：水30:65。
抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物在抗烟草普通花叶病毒药物中的应用。
本发明的有益效果：
本研究首次从植物防御角度对烟草的防御物质进行了系统研究，并利用色谱分离、纯化技术，采用活性追踪的方法从中分离得到了一类具有抗TMV活性的生物碱类化合物，其中3个为新化合物(1～3)，9个已知化合物(4～12)均为该属植物中首次分离得到，该类生物碱对烟草普通花叶病毒具有钝化、保护、治疗及抑制病毒增殖作用，为进一步系统研究烟草内源性抗烟草花叶病物质提供了科学依据。
附图说明
图1是本发明生物碱类化合物1-12的结构图；
图2是化合物1和2的主要2D NMR相关信号；
图3是化合物1和2的结构；
图4是化合物3的结构及其主要2D NMR相关信号。
图中，1-(S)-Nkolbisine-β-D-glucoside、2-(R)-Nkolbisine-β-D-glucoside、3-Lepabisine A、4-Skimmiamine、5-(S)-Nkolbisine、6-Nkolbisine、7-Methylevoxine、8-Haploperine、9-Melineurine、10-Evodine、11-Evoxoidine、12-Myrtifoline。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例
以心叶烟为供试植物，进行抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物类化合物的制备。
1材料与方法
1.1供试植物
心叶烟(NicotianaglutinosaL.)种子由云南烟草农业科学研究院提供，供试植株采集于玉溪市马桥科研基地，全株自然阴干后粉碎过40目筛备用。
1.2供试病毒
烟草普通花叶病毒(TMV)U1普通株系，由云南省烟草农业科学研究院提供。通过常规摩擦接种，使其在普通烟K326(NicotianatatobacumK326)上繁殖，采用Gooding[5]的方法提纯。准确量取5μL提纯的TMV，用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PB)稀释100倍，紫外分光光度计法测定其质量浓度为16mg/mL。于-20℃冰箱中保存，临用前用0.01mol/L的PB稀释至32μg/mL。
1.3抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物的制备方法，具体包括以下步骤：
1)粗粉制备：将全株烟株自然阴干，粉碎后过40目筛得到样品粗粉；
2)浸膏提取：称取样品粗粉10kg，用工业级甲醇(浓度为95％)浸泡24小时后装入渗漏桶，压实后用95％甲醇渗漏提取至提取液颜色较浅为止(粗粉与甲醇体积比为1:5)，合并滤液后减压浓缩得浸膏1.3kg，于4℃冰箱中保存备用；
3)硅胶柱层析分离：将浸膏利用蒸馏水悬浊，分别经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，包括水相共得到4个极性部分。利用活体半叶枯斑法，对各组分进行抗TMV活性测试，其中乙酸乙酯萃取部分表现出较强的抗TMV活性。将该部分用60-100目硅胶按1:1.2比例拌样进行正相硅胶(100-200目)柱层析分离，用体积比为1:0、9:1、7:1、8:2的氯仿-甲醇进行梯度洗脱，得到组分Fr.1～Fr.4。同样采用活体半叶枯斑法进行活性检测，发现Fr.2抗TMV活性最强。将Fr.2用小孔树脂(MCI)除去大部分色素后，经200～300目硅胶柱层析，以体积比为10:1、7:1、5:1、3:1、2:1的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，得到3个部分Fr.2-1～Fr.2-3。采用活体半叶枯斑法进行活性检测，发现Fr.2-2抗TMV活性最强。
4)反相柱层析：将Fr.2-2经反相RP-18色谱柱，以体积浓度为30％～100％甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩；
5)高压色谱分离纯化：制备条件为18C-反相色谱柱(9.5*21.2cm)、流速10ml/min，乙腈：水35:65；半制备条件为18C-反相色谱柱(2.5*21.2cm)、流速2ml/min，乙腈：水30:65；经以上条件纯化各部分得到生物碱类化合物1(8mg)，2(4mg)，3(9mg)，4(25mg)，5(85mg)，6(10mg)，7(25mg)，8(12mg)，9(38mg)，10(22mg)，11(43mg)，12(24mg)。
1.4活性测定
采用半叶枯斑法，在(22±1)℃室温下进行，以健康、生长旺盛的5～6叶期心叶烟为试验材料。化合物的供试浓度均为1mg/mL，以宁南霉素20倍稀释液为对照。(对照药剂：2％宁南霉素水剂(ningnanmycin AS)，黑龙江强尔生化技术开发有限公司提供。)
半叶枯斑法即在心叶烟上完成，首先将种子于无虫温室中漂浮育苗。挑选6～8片叶龄，且大小、质量相似的健康植株供试。
1.4.1体外钝化作用钝化试验中，左半叶接种化合物与病毒等体积混合液，右半叶接种蒸馏水与病毒等体积混合液(对照)。化合物和宁南霉素均稀释50倍，钝化时间均为1h。每处理接种6片叶子，重复3次，3d后统计枯斑数，计算抑制率。枯斑抑制率按照1.4.3中公式计算。
1.4.2抑制TMV初侵染和增殖作用初侵染试验中，各处理分别在施药24h后接种病毒；增殖试验中，均在接种病毒后24h施药。施药方式为涂抹法，左半叶涂抹供试药剂，右半叶为清水对照。每处理接种6片叶子，重复3次，3d后统计枯斑数，计算抑制率。枯斑抑制率按照1.4.3中公式计算。
1.4.3提取物TMV体内增殖抑制活性中采用叶圆片悬浮筛选法进行测定。在室温普通烟上采用圆盘悬浮筛选法与半叶枯斑法测定同步进行。方法：用TMV接种普通烟K326叶片，6h后用清水冲洗叶片，2h后(叶片淋洗水变干)，用打孔器在接种叶片上切取直径12mm的圆盘。将接种面朝上，让其漂浮在含不同浓度的供试液培养皿中，3d后磨碎叶片，用间接ELISA法检测病毒含量，并分别设药剂空白接种病毒和不接种病毒的阳性和阴性叶片为对照。每处理6个圆盘。病毒增殖抑制率(％)＝[(药剂空白阳性叶片对照病毒含量-药剂处理叶片病毒含量)/药剂空白阳性叶片对照病毒含量]×100。
1.4.4结果计算及统计方法室内生测试验中，统计处理和对照的枯斑数，计算枯斑抑制率：
枯斑抑制率(％)＝(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数×100
采用SPSS13.0统计软件进行数据分析处理，用单因素方差分析统计各处理平均数的差异，LSD法比较各处理间的差异显著性。
2结果
2.1结构鉴定
采用色谱技术从心叶烟中分离得到3个新化合物和9个已知化合物，经鉴定如下：3个新化合物包括：(S)-Nkolbisine-β-D-glucoside(1)、(R)-Nkolbisine-β-D-glucoside(2)、Lepabisine A(3)，9个已知化合物包括Skimmiamine(4)、(S)-Nkolbisine(5)、Nkolbisine(6)、Methylevoxine(7)、Haploperine(8)、Melineurine(9)、Evodine(10)、Evoxoidine(11)、Myrtifoline(12)，具体结构如图1(*表示新化合物)。
2.1.1新化合物结构鉴定化合物1为白色粉末，ESI+MS显示准分子离子峰510[M+H]+，13C NMR谱显示24个碳信号(表1)：4个甲基(δC 25.8，26.4，60.0，62.1)，2个亚甲基(δC62.5，71.2)，10个次甲基(δC 71.4，75.7，77.9，78.0，86.3，106.2，106.3，114.3，119.6，144.3)，8个季碳(δC 73.7，103.2，115.8，152.9，141.9，142.6，159.0，165.9)，结合其二维核磁共振谱图数据，可以确定分子式为C24H31NO11，不饱和度为10。
由1H NMR谱(δH 4.55(1H，d，7.8)，3.24(1H，m)，3.28(1H，m)，3.33(1H，m)，3.28(1H，m)，3.68(1H，dd，11.6，4.4)，3.60(1H，dd，11.6，4.4)及13C NMR谱(δC 106.2(d)75.7(d)78.0(d)；71.4(d)；77.9(d)，62.5(t)推测该化合物含糖，经比对发现该化合物糖部分化学位移值与葡萄糖基本一致，推测1可能是苷元与葡萄糖成苷。
将Ⅰ的苷元部分各化学位移值与(S)-Nkolbisine[8]的波谱数据进行比对，发现Ⅰ的苷元部分与(S)-Nkolbisine的数据基本吻合，但在C-2’处的化学位移值不同。应用HMQC对碳氢数据归属后，在HMBC中可观察到H-Glc-1’(δH 4.55，1H，d，J＝7.8Hz)与C-2’(δC 86.3)的相关信号(图2)。以上信息说明化合物Ⅰ中的葡萄糖C-1与苷元的C-2’相连。这样就确定了该化合物的平面结构。
化合物1经过水解后得到苷元部分和糖部分，经分离测定苷元CD数据[245(Δε+4.51)，220(Δε+0.32)nm]，发现与(S)-Nkolbisine[8]基本一致，说明二者构型相同，同时得到的糖在HPLC上保留时间与β-D型葡萄糖一致。至此确定了化合物1的结构(图3)，命名为(S)-Nkolbisine-β-D-glucoside。
把化合物2的NMR数据与化合物1进行比较发现两个化合物的数据基本一致，仅在连糖的2’位和糖的1位化学位移值存在较大差异。在1中2’位和糖的1位上的碳氢化学位移值分别为δC 86.3，106.2和δH 3.90，4.55；而在2中2’位和糖的1位上的碳氢化学位移值则分别为δC 83.9，103.6和δH 4.12，4.83；说明化合物1和2的2’位构型不同，这样我们确定了化合物2的结构，如图2，命名为(R)-Nkolbisine-β-D-glucoside。
表1化合物1和2NMR数据(in CD3OD,δin ppm,J in Hz)
化合物3为白色粉末，通过其高分辨质谱HREIMS m/z 351.1312[M]+(calcd.forC17H21NO7,351.1318)，和一维和二维核磁共振谱图数据(表2)，可以确定分子式为C17H21NO7，不饱和度为8。其13C NMR谱显示17个碳信号：4个甲基(δC 24.9，26.5，53.1，60.0)，1个亚甲基(δC 66.8)，5个次甲基(δC 77.0，106.9，123.2，138.9，146.7)，7个季碳(δC 72.5，110.3，120.4，160.5，164.0，167.1，167.4)，从这些数据可知，该化合物骨架结构类似Nkolbisine，但又有差异。
通过HMQC对碳氢数据进行归属，在1H-1H COSY中可以观察到H-2’(δH3.37，1H，dd，8.5，2.5)与H-1’(δH 3.90，1H，dd，11.5，8.5和4.20，1H，dd，11.5，2.5)的相关信号。另外在HMBC中可以观察到H-4’和H-5’(δH 1.10，3H，s和1.67，3H，s)与C-2’(δC 77.0)和C-3’，H-1’与C-4(δC 167.1)的相关信号，说明异戊烯基的存在并连接在C-4位；在HMBC中还可以观察到H-7(δH 7.19，1H，d，11.8)与C-8(δC 123.2)，C-9(δC 167.4)，C-5(δC 120.4)，C-4(δC167.1)，C-6(δC 160.5)的相关信号；H-β(7.28，1H，d，2.6)与C-2(δC164.0)，C-3(δC 110.3)，C-α(δC 146.7)的相关信号，根据这些信息基本可以确定该化合物的平面结构，如图4；根据H-7和H-8的耦合常数(11.8)可知该双键为E式。通过这些分析我们最后确定了3的结构，该化合物为一新化合物，命名为lepabisine A。
表2化合物3的NMR数据(in CD3OD,δin ppm,J in Hz)
2.1.2化合物理化数据
(1)(S)-Nkolbisine-β-D-glucoside：白色粉末，C24H31NO11。1H NMR(400MHz,CD3OD)and 13C NMR(100MHz,CD3OD),see Table 1ESI+MS:510[M+H]+，532[M+Na]+,1041[2M+Na]+.ESI-MS:508[M-H]-。
(2)(R)-Nkolbisine-β-D-glucoside：白色粉末，C24H31NO11。1H NMR(400MHz,CD3OD)and 13C NMR(100MHz,CD3OD),see Table 1；ESI+MS:510[M+H]+,532[M+Na]+,1041[2M+Na]+,苷元CD(c 0.08,MeOH):λ(Δε)220(0.32),245(4.51)。
(3)Lepabisine A：白色粉末；[α]22.8D+0.6(c 0.10,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)204(4.46),251(4.05)nm；CD(c 0.13,MeOH)λ(Δε)195(3.5),225(–0.9),nm；IR(KBr)νmax3429,2954,1726,1638,1571,1376,1276,1171,1096,1053cm–1；1H NMR(500MHz,CD3OD)and13C NMR(100MHz,CD3OD),see Table 2；HREIMS m/z 351.1312[M]+(calcd.for C17H21NO7,351.1318)。
2.2各化合物生物活性测定
2.2.1各化合物对TMV体外钝化作用表3表明，部分化合物对TMV病毒粒子具有强烈的体外钝化活性，3个新化合物1～3和已知化合物6的抑制率均大于80％；在相同浓度和钝化时间下，化合物1和6表现出与宁南霉素相近的活性。
表3各化合物对TMV钝化作用
注：不同字母表示组内差异显著(p＜0.05)，下同。
2.2.2各化合物对TMV初侵染的抑制作用由表4可看出，部分化合物对TMV初侵染表现出明显的抑制作用，施药24h后接种，新化合物1和2及已知化合物9处理对TMV的抑制率分别达到了81.6％、84.1％和78.0％，显著高于同等浓度对照药剂宁南霉素处理。
表4各化合物对TMV初侵染的抑制作用
2.2.3各化合物对TMV复制增殖的抑制作用从表5可以看出，部分化合物对TMV的复制增殖表现出较好的抑制作用。接种24h后施药，化合物1和化合物11对TMV的抑制率分别达到71.5％和75.9％，表现出与同等浓度宁南霉素相近的活性。
表5各化合物对TMV复制增殖的抑制作用
2.2.4为了进一步验证各化合物对TMV的抑制活性，采用圆盘悬浮筛选法对各化合物对TMV-DNA增殖的抑制活性进行测定。从表6可见：化合物1表现出与宁南霉素相近的活性。
表6各化合物对TMV-DNA增殖的抑制作用
化合物 OA值 抑制率
(S)-Nkolbisine-β-D-glucoside(1) 0.2218ab 55.22％
(R)-Nkolbisine-β-D-glucoside(2) 0.2475bc 50.03％
Lepabisine A(3) 0.4933j 0.42％
Skimmiamine(4) 0.36757e 25.79％
(S)-Nkolbisine(5) 0.3792f 23.44％
Nkolbisine(6) 0.4138h 16.46％
Methylevoxine(7) 0.4475i 9.66％
Haploperine(8) 0.3650e 26.32％
Melineurine(9) 0.3841fg 22.45％
Evodine(10) 0.3931g 20.64％
Evoxoidine(11) 0.2599c 47.54％
Myrtifoline(12) 0.3191d 35.57％
Ningnanmycin(宁南霉素) 0.1939<sub>a</sub> 60.85％
水 0.4953
综上所述，本发明从心叶烟中分离得到了12个对烟草普通花叶病毒具有较强抗性的一类生物碱，其中3个为新化合物，9个已知化合物(4～12)均为该属植物中首次分离得到。用半叶枯斑法测定12个化合物对TMV的抑制作用表明，12个化合物对烟草普通花叶病毒均具有钝化、保护、治疗及抑制病毒增殖作用，其中新化合物1(S)-Nkolbisine-β-D-glucoside对TMV的活体钝化作用、初侵染、复制增殖及DNA增殖的抑制率分别为93.06％、81.55％、71.54％和55.22％，钝化作用和初侵染抑制作用均强于对照宁南霉素，显示了心叶烟中的小分子化合物良好的抗TMV活性。
本发明首次从烟草中发现具有抗TMV活性的一类生物碱类化合物，为进一步系统研究烟草内源性抗烟草花叶病物质提供了科学依据。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物，其特征在于：其结构式为：
2.根据权利要求1所述的抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
1)粗粉制备：将全株烟株自然阴干，粉碎后过40目筛得到样品粗粉；
2)浸膏提取：称取样品粗粉，用95％甲醇浸泡24小时后装入渗漏桶，压实后用95％甲醇渗漏提取至提取液颜色较浅为止，合并滤液后减压浓缩得浸膏，于4℃冰箱中保存备用；
3)硅胶柱层析分离：将浸膏用蒸馏水悬浊，分别经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，将乙酸乙酯萃取部分与60-100目硅胶拌样晾干后上100-200目硅胶色谱柱进行柱层析分离，用体积比为1:0～8:2的氯仿-甲醇进行梯度洗脱，得到组分Fr.1～Fr.4；将Fr.2用小孔树脂(MCI)除去色素后，经200～300目硅胶柱层析，以体积比为10:1～2:1的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，得到3个部分Fr.2-1～Fr.2-3；
4)反相柱层析：将Fr.2-2经反相RP-18色谱柱，以体积浓度分别为30％、70％和100％甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩；
5)高压色谱分离纯化：再经制备和半制备分离纯化得到生物碱类化合物。
3.根据权利要求2所述的抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物的制备方法，其特征在于：步骤2)中，粗粉与甲醇体积比为1:5。
4.根据权利要求3所述的抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物的制备方法，其特征在于：步骤2)中，乙酸乙酯萃取部分与硅胶按1:1.2比例拌样。
5.根据权利要求4所述的抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物的制备方法，其特征在于：步骤3)中，氯仿-甲醇的体积比为1:0、9:1、7:1、8:2。
6.根据权利要求5所述的抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物的制备方法，其特征在于：步骤3)中，石油醚-丙酮的体积比为10:1、7:1、5:1、3:1、2:1。
7.根据权利要求6所述的抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物的制备方法，其特征在于：步骤5)中，制备条件为18C-反相色谱柱、流速10ml/min，乙腈：水35:65；半制备条件为18C-反相色谱柱、流速2ml/min，乙腈：水30:65。
8.抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物在抗烟草普通花叶病毒药物中的应用，其特征在于：所述抗烟草普通花叶病毒病活性生物碱类化合物是利用权利要求7的方法制备得到的。
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