CN102898497B - 从甘青铁线莲中提取的三萜皂苷类化合物及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从甘青铁线莲中提取的三萜皂苷类化合物，分子式为C₅₉H₉₆O₂₇，采用高分辨质谱和二维核磁共振谱等光谱技术，以及化学方法，确定该化合物的化学结构为3β-O-[3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-21α-羟基-常春藤-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖(21α-hydroxy-3β-O-[3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl]-hederagenin-28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside)。体外抗心肌缺血活性结果显示，该化合物对缺氧/复氧模型诱导的心肌细胞损伤有明显的保护作用。本发明为治疗心肌缺血性疾病提供了先导化合物，可以成为治疗心血管的药物。

Description

从甘青铁线莲中提取的三萜皂苷类化合物及用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是从甘青铁线莲中提取的三萜皂苷类化合物及用途，具体地说是从传统藏药甘青铁线莲中提取分离到的一种新的三萜皂苷类化合物及其在制备心血管药物中的应用。

背景技术

缺血性心脏病是人类最主要的致病死因，其高发病率和死亡率严重影响患者的生存质量，危及生命。目前临床治疗心血管疾病的药物主要有硝酸酯类，钙拮抗剂及β受体阻滞剂等。这些药物虽然在临床上取得一定的疗效，但是都存在不同程度的毒副作用和耐药性。因此新型高效安全的心血管药物的开发是治疗该疾病的迫切需求。

毛茛科铁线莲属植物甘青铁线莲(Clematis tangutica)，别名唐古特铁线莲，藏药名又称叶芒那布、叶濛。主要分布于青藏高原地区，根据《晶珠本草》和《藏药志》等典籍记载，其性辛、甘、温，祛寒，增生胃火，活血通瘀，破痞瘤积聚。此外，甘青铁线莲作为复方制剂益心康泰胶囊的主药在治疗心脑血管疾病方面疗效显著。已有文献报道了甘青铁线莲中的三萜皂苷类成分（详见：Zhong HM,Chen CX.et al,Triterpenoid Saponins from Clematis tangutica.Planta Med,2001,67(5),484；Du ZZ,Zhu N.et al,Two new antifungal saponins from the Tibetan herbal medicineClematis tangutica.Planta Med.2003,69:547-551），但甘青铁线莲的有效成分仍不明确。我们对甘青铁线莲总皂苷进行了系统分离，获得了一种新的三萜皂苷类化合物，其化学结构和抗心肌缺血活性未见有过报道。

发明内容

本发明目的提供一种从甘青铁线莲中提取的三萜皂苷类化合物及用途，它具有心肌保护作用。

本发明的目的是这样实现的，从甘青铁线莲中提取的三萜皂苷类化合物，其特征在于化学结构式如下：

式Ι

上述结构其化学名称为3^β-O-[3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-21α-羟基-常春藤-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖(21α-hydroxy-3^β-O-[3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl]-hederagenin-28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside)，是从甘青铁线莲中分离的三萜皂苷类化合物，以下简称其为GQZG。

所述三萜皂苷类化合物GQZG的制备方法是以甘青铁线莲为原料，原料经粉碎后，按重量体积比加入3~5倍原料重的甲醇或乙醇回流提取，共提取3次，每次1~3小时；合并提取液，回收溶剂，得甲醇或乙醇提取物，提取物分散于按重量体积比4~8倍的水中，再依次用石油醚、水饱和正丁醇萃取3次，回收溶剂，分别得到石油醚和正丁醇的两个萃取部位；正丁醇层采用硅胶柱层析，以体积比为8:2:1～6.5:3.5:1的氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，收集含式I化合物GQZG的流份，再用Sephadex LH-20凝胶柱层析，以体积比为1:1的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，合并含GQZG的流份，进而采用RP-18柱层析，以体积比为4:6～7:3的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，最后再经高效液相色谱仪分离纯化，体积比为61:39的甲醇-水混合溶剂为流动相洗脱，得到GQZG的纯品。

所述三萜皂苷类化合物GQZG的制备方法除应用常规的溶剂提取、溶剂萃取和各种色谱分离技术外，在应用硅胶柱层析方法从总苷提取物制备总皂苷时，对包含有GQZG的总皂苷的确定是采用如下手段来检查的：以硅胶薄层层析检测，采用体积比为12:3:5的正丁醇-乙酸-水混合溶剂或体积比为70:15:2的氯仿-甲醇-水混合溶剂展开，收集R_f值在0.2～0.35处显示紫红色斑点的流份，即为总皂苷。

所述的从甘青铁线莲中提取的三萜皂苷类化合物在制备心血管药物中的应用。

所述三萜皂苷类化合物GQZG在50μmol/L~100μmol/L的浓度能降低细胞血清中肌酸激酶和乳酸脱氢酶的水平，从而抑制缺氧/复氧模型诱导的心肌细胞损伤，并且呈现出一定的剂量依赖性。

本发明的特点是：式Ι化合物GQZG是21位存在羟基的常春藤苷元，这种结构的三萜皂苷在天然界鲜有报道，在铁线莲属植物中也是首次发现。该化合物对缺氧/复氧模型诱导的心肌细胞损伤有明显的抑制作用也表明其可以进一步作为新的心血管药物进行研究开发。

本发明从甘青铁线莲中通过提取、分离纯化得到式Ι化合物GQZG，该化合物可用于制备治疗缺血性心脏病药物，为研制新的心血管药物提供了先导化合物。

具体实施方式

下面结合具体实施例来说明本发明的实质。应理解，这些实施例仅用于证实本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：化合物的提取和分离

采集青海省黄南自治州的甘青铁线莲全草作为原料，原料经粉碎成粗粉后，取3公斤，加入15升浓度为70%的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次3小时。合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物540克。提取物分散于4.5升水中，用石油醚萃取3次，每次4.5升。萃取后的水相再用正丁醇萃取3次，每次4.5升，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂后得到总皂苷提取物120克。将总皂苷进行硅胶柱层析，以体积比为8:2:1～6.5:3.5:1(均取下层作为洗脱液)的氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，按150mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检测(薄层展开溶剂采用体积比为12:3:5的正丁醇-乙酸-水混合溶剂，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105°C加热显色)，收集R_f值在0.2～0.35处显示紫红色斑点的流份，即为含化合物GQZG的总皂苷混合物，减压蒸干溶剂后得9.6克样品。样品采用Sephdex LH-20(GE-Healthcare公司)葡聚糖凝胶柱层析，以体积比为1:1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，按20mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含GQZG的第8～14流份，减压蒸干溶剂后得3.2克样品。样品再经过RP-18柱(Merck公司)层析，以体积比为4:6~7:3的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，按15mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含GQZG的第11～18流份(0.84克)。最后经高效液相色谱仪(戴安公司)分离纯化(HPLC条件为：YMC-Pack R&D ODS-A色谱柱20×250mm，61%甲醇为流动相，流速7mL/min，25°C，206nm紫外检测)，得到如下式Ι化合物GQZG的纯品99毫克。

式Ι

上述结构其化学名称为3^β-O-[3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-21α-羟基-常春藤-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖(21α-hydroxy-3^β-O-[3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl]-hederagenin-28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside)，是从甘青铁线莲中分离的三萜皂苷类化合物，简称其为GQZG。

实施例2：

采集青海省黄南自治州的甘青铁线莲全草作为原料，原料经粉碎成粗粉后，取3公斤，加入12升浓度为70%的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次2小时。合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物508克。提取物分散于3升水中，用石油醚萃取3次，每次3升。萃取后的水相再用正丁醇萃取3次，每次3升，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂后得到总皂苷提取物112克。将总皂苷进行硅胶柱层析，以体积比为8:2:1～6.5:3.5:1(均取下层作为洗脱液)的氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，按150mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检测(薄层展开溶剂采用体积比为70:15:2的氯仿-甲醇-水混合溶剂，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105°C加热显色)，收集R_f值在0.2～0.35处显示紫红色斑点的流份，即为含化合物GQZG的总皂苷混合物，减压蒸干溶剂后得9.3克样品。样品采用Sephdex LH-20(GE-Healthcare公司)葡聚糖凝胶柱层析，以体积比为1:1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，按20mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含GQZG的第8～13流份，减压蒸干溶剂后得3.2克样品。样品再经过RP-18柱(Merck公司)层析，以体积比为4:6~7:3的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，按15mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含GQZG的第11～17流份(0.81克)。最后经高效液相色谱仪(戴安公司)分离纯化(HPLC条件为：YMC-Pack R&D ODS-A色谱柱20×250mm，61%甲醇为流动相，流速7mL/min，25°C，206nm紫外检测)，得到实施例1式Ι化合物GQZG的纯品87毫克。

实施例3：

采集青海省黄南自治州的甘青铁线莲全草作为原料，原料经粉碎成粗粉后，取1公斤，加入3升甲醇进行回流提取，共提取3次，每次1小时。合并提取液，减压回收溶剂，得甲醇提取物150克。提取物分散于0.6升水中，用石油醚萃取3次，每次0.6升。萃取后的水相再用正丁醇萃取3次，每次0.6升，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂后得到总皂苷提取物45克。将总皂苷进行硅胶柱层析，以体积比为8:2:1～6.5:3.5:1(均取下层作为洗脱液)的氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，按100mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检测(薄层展开溶剂采用体积比为70:15:2的氯仿-甲醇-水混合溶剂，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105°C加热显色)，收集R_f值在0.2～0.35处显示紫红色斑点的流份，即为含化合物GQZG的总皂苷混合物，减压蒸干溶剂后得3克样品。样品采用Sephdex LH-20(GE-Healthcare公司)葡聚糖凝胶柱层析，以体积比为1:1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，按18mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含GQZG的第8～13流份，减压蒸干溶剂后得1.1克样品。样品再经过RP-18柱(Merck公司)层析，以体积比为4:6~7:3的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，按10mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含GQZG的第10～16流份(0.29克)。最后经高效液相色谱仪(戴安公司)分离纯化(HPLC条件为：YMC-Pack R&D ODS-A色谱柱20×250mm，62%甲醇为流动相，流速7mL/min，25°C，206nm紫外检测)，得到实施例1式ΙGQZG的纯品38毫克。

化合物的结构鉴定

实施例1式Ι化合物GQZG为白色不定形粉末，–26(c 0.13,MeOH)，Liebermann-Burchard反应和Molish反应均为阳性。ESI-MS给出准分子离子峰m/z 1259[M+Na]⁺(正离子模式)和m/z 1235[M-H]-(负离子模式)；HR-ESI-MS(正离子模式)给出准分子离子峰m/z1259.6031[M+Na]⁺(计算值C₅₉H₉₆NaO₂₇,1259.6037)，结合¹H NMR和¹³C NMR波谱数据(表1)，确定其分子式为C₅₉H₉₆O₂₇。对化合物GQZG采用三氟乙酸进行水解并常法制备水解产物(糖部分)的三甲基硅醚化衍生物，以L-Chirasil-Val气相色谱柱(25m×0.32mm.)进行GC分析，经与标准糖制备的相应衍生物作对照。结果显示化合物GQZG中存在L-阿拉伯糖,L-鼠李糖和D-葡萄糖，组成比例为1:2:2。

通过对比GQZG和已知化合物kizutasaponin K12(Kizu H,Shimana H,et al.Studies on theconstituents of Clematis species.VI.The constituents of Clematis stans Sieb.et Zucc.Chem PharmBull 1995;43:2187–2194)的波谱数据可知这两个化合物具有相同的3-O-二糖链和28-O-三糖链。而苷元部分数据基本一致，但是化合物GQZG的苷元E环缺少一个亚甲基信号，取而代之的是一个连氧次甲基信号(δ73.4)，表明E环上存在一个直接与羟基相连的碳原子。在HMBC谱中H₃-30/C-19,H₃-30/C-21,H₃-29/C-19,H₃-29/C-21和H-19a(δ_H1.18)/C-13分别存在远程相关，可确定羟基位于苷元的C-21位。NOESY谱中显示H-21和H₃-30存在相关，表明21-OH为α构型。结合DQCOSY，TOCSY，HMQC和HMBC给出的波谱数据归属了化合物的所有碳、氢信号，见(表1)。

表1式Ι化合物的¹H和¹³C核磁共振数据(测试溶剂：氘代吡啶)

综上所述，化合物GQZG的结构鉴定为3β-O-[3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-21α-羟基-常春藤-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖。

化合物体外抗心肌缺血作用的研究

对实施例1式I化合物GQZG进行了体外抗心肌缺血试验，试验所采用的细胞为新生大鼠心肌细胞，其分离和培养方法依据文献(Akao M,Ohler A,et al.Mitochondrial ATP-sensitivepotassium channels inhibit apoptosis induced by oxidative stress in cardiac cells.CircRes,2001,88(12):1267-1275)的方法进行。心肌保护效果采用MTT测定法、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK-MB)含量测定法。

(1)MTT法测定细胞存活率

根据细胞生长速率，将处于对数生长期的细胞以1×10⁴个细胞/孔接种于96孔培养板，贴壁生长48小时后，弃去原培养液，加入用DMEM培养液配制好的含不同浓度(50μmol/L~100μmol/L)本发明化合物的溶液200μL，每个浓度设6个复孔，并设盐酸地尔琉卓阳性对照、生理盐水对照、模型组和无细胞调零孔，置37°C培养箱(5%CO₂)中培养24小时。随后细胞置于缺氧箱(95%N₂+5%CO₂,37°C)中培养3小时，复氧培养(95%O₂+5%CO₂,37°C)1小时。加入PBS溶解的浓度为10mg/mL的MTT(Sigma公司)20μL，在正常条件下孵育4小时。最后，每孔加入200μL的二甲基亚砜，混匀。将96孔板置酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光度(OD)值。按下式计算被测物对细胞存活率：

细胞存活率＝治疗组OD值/对照组OD值×100%

假设对照组的细胞存活率为1。

统计学分析：

所有数据均采用SPSS13.0统计学软件进行分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05认为有统计学差异。

实验结果见表2:

表2不同浓度GQZG对缺氧/复氧损伤大鼠心肌细胞存活率的影响(n＝6

与模型组相比**P＜0.01，*P＜0.05

与模型组比，50μmol/L，75μmol/L，100μmol/L组均能提高缺氧/复氧损伤后心肌细胞的存活率，有一定的剂量依赖性。表明化合物GQZG对缺氧缺血后的细胞有保护作用。

(2)乳酸脱氢酶和肌酸激酶含量测定法

根据细胞生长速率，将处于对数生长期的细胞以5×10⁴个细胞/孔接种于96孔培养板，贴壁生长48小时后，弃去原培养液，加入用DMEM培养液配制好的含不同浓度(50μmol/L~100μmol/L)本发明化合物的溶液200μL，每个浓度设6个复孔，并设盐酸地尔琉卓阳性对照、生理盐水对照、模型组和无细胞调零孔，细胞在37°C、5%CO₂-95%O₂条件下培养24小时后，置于缺氧箱(5%CO₂-95%N₂,37°C)中培养3小时，再复氧培养(5%CO₂-95%O₂,37°C)1小时。细胞损伤指标乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK-MB)含量采用试剂盒(南京建成生物工程有限公司)测定，具体实验方法依据生产商提供的方法进行，分别于660nm和340nm处采用酶标仪测定LDH和CK-MB的含量。

统计学分析：

所有数据均采用SPSS13.0统计学软件进行分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05认为有统计学差异。

实验结果见表3:

表3不同浓度GQZG对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤后血清中LDH和CK-MB的影响(n＝6)

与模型组相比**P＜0.01，*P＜0.05；模型组与对照组比ΔΔP＜0.01

结果显示，与模型组比，化合物GQZG 50μmol/L，75μmol/L，100μmol/L组均能显著降低细胞血清中乳酸脱氢酶和肌酸激酶的含量，且呈一定的剂量依赖性。提示GQZG对大鼠心肌细胞缺氧缺血性损伤有治疗作用，可用于制备治疗心血管疾病的药物。

本实施例没有详细叙述的部分和英文缩写属本行业的公知常识，在网上可以搜索到，这里不一一叙述。

Claims (2)

1.从甘青铁线莲中提取的三萜皂苷类化合物，其特征在于化学结构式如下：

式Ι

上述结构其化学名称为3β-O-[3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-21α-羟基-常春藤-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖 (21α-hydroxy-3β-O-[3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl]-hederagenin-28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside)，是从甘青铁线莲中分离的三萜皂苷类化合物，以下简称其为GQZG。

2.权利要求1所述的从甘青铁线莲中提取的三萜皂苷类化合物在制备心血管药物中的应用。