CN113666984B - 唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺及其应用 - Google Patents

唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及化学对照品的制备和应用技术领域，具体涉及唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺及其应用。具体制备工艺为提取、正丁醇粗富集、大孔树脂精细富集、高速逆流色谱分离及结构鉴定。本发明方法将大孔树脂和高速逆流色谱技术相结合，通过优化富集和分离条件，建立了唐古特铁线莲中7种结构类似的齐墩果烷型皂苷类化学对照品的高效分离制备工艺，操作简单、方便、易于实现自动化控制，具有重复性和稳定性好的优点，非常适合唐古特铁线莲中7种皂苷类化学对照品的制备，对于天然产物中皂苷类化学对照品的制备具有重要的参考价值。本发明提供的齐墩果烷型三萜皂苷类化学对照品可作为抗肿瘤药物的先导性化合物，有良好的应用前景。

Description

唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺及其应用
技术领域
本发明涉及化学对照品的制备和应用技术领域，具体涉及唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺及其应用。
背景技术
唐古特铁线莲(Clematis tangutica(Maxim.)Korsh)是毛茛科铁线莲属的多年生草本。藏药文献记载其具有破痞瘤集聚、增生胃火、活血通瘀等作用，可用于消化不良、痞瘤病及寒性肿瘤、黄水病、浮肿等疾病的治疗。唐古特铁线莲的药理作用与其所含丰富的皂苷类成分密不可分，但其发挥抗肿瘤作用的药效成分还未明确。
皂苷是一类富有多种生物活性的化合物，但因其极性强、紫外吸收弱、具有表面活性剂的特性、易发生乳化现象，给皂苷类化合物的分离带来较大的挑战。由于天然产物成分的复杂性，很难将高纯度化合物直接从粗提取物中分离出来，因此在分离之前对目标组分进行富集非常必要。大孔树脂柱色谱具有技术重复性好、吸附能力高、操作费用低、溶剂消耗少、产品中无化学残留、再生方便等优点，是化合物富集的有效手段。在分离方面，高速逆流色谱是一种无载体的液-液分配色谱，克服了传统硅胶柱色谱带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点，且对于硅胶柱色谱难以分离的结构类似且极性相近的化合物，在分离上具有明显优势，还具有载样量大、回收率高、效率高、重现性好等特点。因此，采用大孔树脂和高速逆流色谱可以很好的富集和分离皂苷类化合物。目前还未有采用大孔树脂和高速逆流色谱用于富集和分离唐古特铁线莲中皂苷类化合物的报道。
发明内容
基于上述技术问题，本发明基于采用大孔树脂和高速逆流色谱，从唐古特铁线莲分离得到了7种结构类似的齐墩果烷型皂苷类化学对照品，并对其进行了肿瘤细胞抑制活性评价和对正常细胞的毒性评价。目的是提供唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺及其应用。
本发明保护唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将唐古特铁线莲全草干燥粉碎，以1g：5～30mL的比例用体积浓度为60～95％的乙醇，在提取温度为60～90℃的条件下进行加热回流提取，其中，提取次数1～4次、每次1～4h，合并提取液，减压浓缩冷冻干燥，得到粗提物；
步骤2，正丁醇粗富集：将上述粗提物混悬于纯水中，首先采用石油醚、乙酸乙酯分别萃取至上相无颜色，然后再用1～5倍体积的正丁醇萃取1～5次，收集所有正丁醇萃取液，减压浓缩，冷冻干燥，得到粗皂苷提取物；
步骤3，大孔树脂精细富集：上样，将上述粗皂苷提取物用纯水配置成7.5～60mg/mL的溶液，以1～5BV/h的流速上大孔树脂柱，流出液反复上柱1～5次，静置2～12h；除杂，采用0～40％乙醇以1～5BV/h的流速洗脱1～8BV；富集，在30～90％乙醇中，选取2～4种乙醇浓度，分别以1～5BV/h的流速洗脱1～8BV，得到2～4组洗脱馏分，分别减压浓缩至恒重，得到2～4组皂苷的精细富集粉末；
步骤4，高速逆流色谱分离：选取上述皂苷的精细富集粉末2组，分别采用高速逆流色谱分离，得到7种皂苷类化学对照品；UPLC-ELSD分析7个皂苷类化学对照品的纯度均大于98％；
步骤5，结构鉴定：将所述7种皂苷类单体化合物通过1H-NMR、13C-NMR进行结构鉴定，其中，6种已知皂苷分别为：Hederacholichiside F；Tanguticoside B；Tauroside St-H1；Hederoside H1；kalopanaxsaponinG；Hederasaponin B；1种新皂苷为3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester，对新皂苷进一步采用HMBC and NOESY确认；经结构鉴定出的7种皂苷类化学对照品为结构类似的齐墩果烷型皂苷类化合物；上述7种皂苷类化学对照品的化学结构式依次如下：
Figure BDA0003182078540000031
Hederacholichiside F
Figure BDA0003182078540000041
Tanguticoside B
Figure BDA0003182078540000042
Tauroside St-H1
Figure BDA0003182078540000043
Hederoside H1
Figure BDA0003182078540000051
kalopanaxsaponin G
Figure BDA0003182078540000052
Hederasaponin B
Figure BDA0003182078540000053
3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester。
进一步的，步骤3所述的大孔树脂为HPD-100，X-5，HPD-400，AB-8，HPD-450和ADS-7中的任意一种。
进一步的，步骤4所述高速逆流色谱分离中，采用的溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水＝1～4:1～4:1～4，v:v:v，主机转速为600～1000rpm，分离温度为25～40℃，流动相流速为1～4mL/min，采用“头-尾”或“尾-头”分离模式。
进一步的，步骤4所述高速逆流色谱分离步骤中，采用蒸发光散射检测器ELSD检测，其中，雾化器温度为60～90℃，载气流速为2.5L/min；采用自制分流阀系统实现分馏，所述自制分流阀系统由三通阀和处于样品收集端的微调阀组成，其中样品收集端管径为1/16～1/4英寸，样品检测端管径为100～500μm。当微调阀处于全部放松状态时，收集端无压力，因收集端管径远大于检测端管径，此时液体无法进入蒸发光散射检测器ELSD；适当拧紧样品收集端的微调阀，可以提高收集端压力，从而控制分流比例，同时达到检测和收集的目的。
本发明还保护唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的应用，所制备的皂苷类化学对照品对肿瘤细胞具有抑制活性，对正常上皮细胞均无毒性，可作为有效成分应用于抗肿瘤药物中。
进一步的，所制备的新皂苷3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester和已知皂苷Hederacholichiside F对胃癌细胞HGC-27具有选择抑制活性，IC50值分别为20.17μM和66.18μM；已知皂苷Hederasaponin B对胃癌细胞HGC-27、宫颈癌细胞Hela和卵巢癌细胞SK-OV-3具有广谱抑制作用，IC50分别为16.4μM，71.3μM和64.4μM；已知皂苷Tauroside St-H1对卵巢癌细胞株SK-OV-3具有选择性抑制活性，IC50＝48.70μM；分离到的7种皂苷类化学对照品对正常胃黏膜上皮细胞GES-1均无毒性，IC50>150μM；可作为有效成分应用于抗胃癌、宫颈癌或卵巢癌的抗肿瘤药物中。
进一步的，所述胃癌细胞HGC-27、宫颈癌细胞Hela、卵巢癌细胞SK-OV-3购买自武汉普诺赛生命科技有限公司，正常胃黏膜上皮细胞GES-1购买自北纳生物细胞库。
相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明方法将大孔树脂和高速逆流色谱技术相结合，通过优化富集和分离条件，建立了唐古特铁线莲中7种结构类似的齐墩果烷型皂苷类化学对照品的高效分离制备工艺，方法操作简单、方便、易于实现自动化控制，具有重复性和稳定性好的优点，非常适合唐古特铁线莲中7种皂苷类化学对照品的制备，对于天然产物中皂苷类化学对照品的制备具有重要的参考价值。
(2)本发明首次分离到的齐墩果烷皂苷对照品中新化学对照品3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester和已知皂苷Hederacholichiside F，Hederasaponin B和Tauroside St-H1在抗肿瘤方面的作用。本发明提供的齐墩果烷型三萜皂苷类化学对照品可作为抗肿瘤药物的先导性化合物，有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明精细富集产物组1的HSCCC分离图；
图2为本发明精细富集产物组2的HSCCC分离图
图3为本发明精细富集产物组1的UPLC色谱图；
图4为本发明精细富集产物组2的UPLC色谱图；
图5为本发明方法制得的皂苷类化学对照品ⅠHederacholichiside F的纯度检测图；
图6为本发明方法制得的皂苷类化学对照品ⅡTanguticoside B的纯度检测图；
图7为本发明方法制得的皂苷类化学对照品ⅢTauroside St-H1的纯度检测图；
图8为本发明方法制得的新皂苷类化学对照品Ⅳ3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester的纯度检测图；
图9为本发明方法制得的皂苷类化学对照品ⅤHederoside H1的纯度检测图；
图10为本发明方法制得的皂苷类化学对照品Ⅵkalopanaxsaponin G的纯度检测图；
图11为本发明方法制得的皂苷类化学对照品ⅦHederasaponin B纯度检测图；
图12为本发明方法制得的新皂苷类化学对照品的HMBC和NOESY结果。
图13为本发明方法中自制分流阀系统及整个工艺的流程图；
图14为不同大孔树脂对唐古特铁线莲皂苷的吸附能力(Ae)和解吸率(Dd)；
图15为上样浓度对富集过程的影响；
图16为乙醇浓度对富集效果的影响；
图17为洗脱体积对富集效果的影响。
其中，图中，Ⅰ、Hederacholichiside F；Ⅱ、Tanguticoside B；Ⅲ、Tauroside St-H1；Ⅳ、3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester；Ⅴ、Hederoside H1；Ⅵ、kalopanaxsaponin G；Ⅶ、Hederasaponin B。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将唐古特铁线莲全草干燥粉碎，以1g：5mL的比例用体积浓度为60％的乙醇，在提取温度为70℃的条件下进行加热回流提取，其中，提取次数1次、每次2h，合并提取液，减压浓缩冷冻干燥，得到粗提物；
步骤2，正丁醇粗富集：将上述粗提物混悬于纯水中，首先采用石油醚、乙酸乙酯分别萃取至上相无颜色，然后再用2倍体积的正丁醇萃取2次，收集所有正丁醇萃取液，减压浓缩，冷冻干燥，得到粗皂苷提取物；
步骤3，大孔树脂精细富集：上样，将上述粗皂苷提取物用纯水配置成15mg/mL的溶液，以2BV/h的流速上大孔树脂柱X-5，流出液反复上柱2次，静置6h；除杂，采用30％乙醇以4BV/h的流速洗脱4BV；富集，选取40％，60％，80％乙醇浓度，分别以4BV/h的流速洗脱4BV，得到3组洗脱馏分，分别减压浓缩至恒重，得到3组皂苷的精细富集粉末；
步骤4，高速逆流色谱分离：选取上述皂苷的精细富集粉末2组，分别采用高速逆流色谱分离，采用的溶剂系统分别为乙酸乙酯-正丁醇-水(1:1:1,v:v:v)和乙酸乙酯-正丁醇-水(4:1:2,v:v:v)，主机转速为800rpm，分离温度为30℃，流动相流速为2mL/min，采用“头-尾”或“尾-头”分离模式；采用蒸发光散射检测器ELSD检测，其中，雾化器温度为70℃，载气流速为2.5L/min；采用自制分流阀系统实现分馏，所述自制分流阀系统由三通阀和处于样品收集端的微调阀组成，其中样品收集端管径为1/4英寸，样品检测端管径为250μm；得到7种皂苷类化学对照品；UPLC-ELSD分析7个皂苷化学对照品的纯度均大于98％；
步骤5，结构鉴定：将所述7种皂苷类化学对照品通过1H-NMR、13C-NMR进行结构鉴定，其中，6种已知皂苷分别为：Hederacholichiside F；Tanguticoside B；Tauroside St-H1；Hederoside H1；kalopanaxsaponin G；Hederasaponin B；1种新皂苷为3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyrano syl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester，对新皂苷进一步采用HMBC and NOESY确认；经结构鉴定出的7种皂苷类化学对照品为结构类似的齐墩果烷型皂苷类化合物。
本发明所制备的皂苷类化学对照品对肿瘤细胞具有抑制活性，对正常上皮细胞均无毒性，可作为有效成分应用于抗肿瘤药物中；尤其作为有效成分应用于抗胃癌、宫颈癌或卵巢癌的抗肿瘤药物中。
实施例2
唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将唐古特铁线莲全草干燥粉碎，以1g：10mL的比例用体积浓度为70％的乙醇，在提取温度为60℃的条件下进行加热回流提取，其中，提取次数2次、每次2h，合并提取液，减压浓缩冷冻干燥，得到粗提物；
步骤2，正丁醇粗富集：将上述粗提物混悬于纯水中，首先采用石油醚、乙酸乙酯分别萃取至上相无颜色，然后再用3倍体积的正丁醇萃取2次，收集所有正丁醇萃取液，减压浓缩，冷冻干燥，得到粗皂苷提取物；
步骤3，大孔树脂精细富集：上样，将上述粗皂苷提取物用纯水配置成60mg/mL的溶液，以1BV/h的流速上大孔树脂柱AB-8，流出液反复上柱3次，静置10h；除杂，采用40％乙醇以3BV/h的流速洗脱3BV；富集，选取50％和70％乙醇浓度，分别以1BV/h的流速洗脱8BV，得到2组洗脱馏分，分别减压浓缩至恒重，得到2组皂苷的精细富集粉末；
步骤4，高速逆流色谱分离：选取上述皂苷的精细富集粉末2组，分别采用高速逆流色谱分离，采用的溶剂系统分别为乙酸乙酯-正丁醇-水(1:2:2,v:v:v)和乙酸乙酯-正丁醇-水(3:1:4,v:v:v)，主机转速为600rpm，分离温度为35℃，流动相流速为1.5mL/min，采用“头-尾”或“尾-头”分离模式；采用蒸发光散射检测器ELSD检测，其中，雾化器温度为60℃，载气流速为2.5L/min；采用自制分流阀系统实现分馏，所述自制分流阀系统由三通阀和处于样品收集端的微调阀组成，其中样品收集端管径为1/8英寸，样品检测端管径为500μm；得到7种皂苷类化学对照品；UPLC-ELSD分析7个皂苷化学对照品的纯度均大于98％；
步骤5，结构鉴定：将所述7种皂苷类化学对照品通过1H-NMR、13C-NMR进行结构鉴定，其中，6种已知皂苷分别为：Hederacholichiside F；Tanguticoside B；Tauroside St-H1；Hederoside H1；kalopanaxsaponin G；Hederasaponin B；1种新皂为3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyrano syl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester，对新皂苷进一步采用HMBC and NOESY确认；经结构鉴定出的7种皂苷类化学对照品为结构类似的齐墩果烷型皂苷类化合物。
本发明所制备的皂苷类化学对照品对肿瘤细胞具有抑制活性，对正常上皮细胞均无毒性，可作为有效成分应用于抗肿瘤药物中；尤其作为有效成分应用于抗胃癌、宫颈癌或卵巢癌的抗肿瘤药物中。
实施例3
唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将唐古特铁线莲全草干燥粉碎，以1g：15mL的比例用体积浓度为75％的乙醇，在提取温度为80℃的条件下进行加热回流提取，其中，提取次数3次、每次2h，合并提取液，减压浓缩冷冻干燥，得到粗提物；
步骤2，正丁醇粗富集：将上述粗提物混悬于纯水中，首先采用石油醚、乙酸乙酯分别萃取至上相无颜色，然后再用5倍体积的正丁醇萃取3次，收集所有正丁醇萃取液，减压浓缩，冷冻干燥，得到粗皂苷提取物；
步骤3，大孔树脂精细富集：上样，将上述粗皂苷提取物用纯水配置成30mg/mL的溶液，以2BV/h的流速上大孔树脂柱HPD-100，流出液反复上柱3次，静置12h；除杂，采用30％乙醇以2BV/h的流速洗脱4BV；富集，选取40％，50％和60％乙醇浓度，分别以2BV/h的流速洗脱4BV，得到3组洗脱馏分，分别减压浓缩至恒重，得到3组皂苷的精细富集粉末；
步骤4，高速逆流色谱分离：选取上述皂苷的精细富集粉末2组，分别采用高速逆流色谱分离，采用的溶剂系统分别为乙酸乙酯-正丁醇-水(1:1:2,v:v:v)和乙酸乙酯-正丁醇-水(4:1:4,v:v:v)，主机转速为800rpm，分离温度为35℃，流动相流速为1.5mL/min，采用“头-尾”或“尾-头”分离模式；采用蒸发光散射检测器ELSD检测，其中，雾化器温度为80℃，载气流速为2.5L/min；采用自制分流阀系统实现分馏，所述自制分流阀系统由三通阀和处于样品收集端的微调阀组成，其中样品收集端管径为1/16英寸，样品检测端管径为250μm；得到7种皂苷类化学对照品；UPLC-ELSD分析7个皂苷化学对照品的纯度均大于98％；
步骤5，结构鉴定：将所述7种皂苷类化学对照品通过1H-NMR、13C-NMR进行结构鉴定，其中，6种已知皂苷分别为：Hederacholichiside F；Tanguticoside B；Tauroside St-H1；Hederoside H1；kalopanaxsaponin G；Hederasaponin B；1种新皂苷为3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyrano syl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester，对新皂苷进一步采用HMBC and NOESY确认；经结构鉴定出的7种皂苷类化学对照品为结构类似的齐墩果烷型皂苷类化合物。
本发明所制备的皂苷类化学对照品对肿瘤细胞具有抑制活性，对正常上皮细胞均无毒性，可作为有效成分应用于抗肿瘤药物中；尤其作为有效成分应用于抗胃癌、宫颈癌或卵巢癌的抗肿瘤药物中。
实施例4
唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将唐古特铁线莲全草干燥粉碎，以1g：20mL的比例用体积浓度为80％的乙醇，在提取温度为90℃的条件下进行加热回流提取，其中，提取次数1次、每次4h，合并提取液，减压浓缩冷冻干燥，得到粗提物；
步骤2，正丁醇粗富集：将上述粗提物混悬于纯水中，首先采用石油醚、乙酸乙酯分别萃取至上相无颜色，然后再用5倍体积的正丁醇萃取1次，收集所有正丁醇萃取液，减压浓缩，冷冻干燥，得到粗皂苷提取物；
步骤3，大孔树脂精细富集：上样，将上述粗皂苷提取物用纯水配置成45mg/mL的溶液，以5BV/h的流速上大孔树脂柱ADS-7，流出液反复上柱5次，静置8h；除杂，采用20％乙醇以5BV/h的流速洗脱8BV；富集，选取30％，50％，70％和90％乙醇浓度，分别以5BV/h的流速洗脱5BV，得到4组洗脱馏分，分别减压浓缩至恒重，得到4组皂苷的精细富集粉末；
步骤4，高速逆流色谱分离：选取上述皂苷的精细富集粉末2组，分别采用高速逆流色谱分离，采用的溶剂系统分别为乙酸乙酯-正丁醇-水(2:2:3,v:v:v)和乙酸乙酯-正丁醇-水(3:4:4,v:v:v)，主机转速为1000rpm，分离温度为40℃，流动相流速为2.5mL/min，采用“头-尾”或“尾-头”分离模式；采用蒸发光散射检测器ELSD检测，其中，雾化器温度为90℃，载气流速为2.5L/min；采用自制分流阀系统实现分馏，所述自制分流阀系统由三通阀和处于样品收集端的微调阀组成，其中样品收集端管径为1/16英寸，样品检测端管径为100μm；得到7种皂苷类化学对照品；UPLC-ELSD分析7个皂苷化学对照品的纯度均大于98％；
步骤5，结构鉴定：将所述7种皂苷类化学对照品通过1H-NMR、13C-NMR进行结构鉴定，其中，6种已知皂苷分别为：Hederacholichiside F；Tanguticoside B；Tauroside St-H1；Hederoside H1；kalopanaxsaponin G；Hederasaponin B；1种新皂苷为3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyrano syl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester，对新皂苷进一步采用HMBC and NOESY确认；经结构鉴定出的7种皂苷类化学对照品为结构类似的齐墩果烷型皂苷类化合物。
本发明所制备的皂苷类化学对照品对肿瘤细胞具有抑制活性，对正常上皮细胞均无毒性，可作为有效成分应用于抗肿瘤药物中；尤其作为有效成分应用于抗胃癌、宫颈癌或卵巢癌的抗肿瘤药物中。
实施例5
唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将唐古特铁线莲全草干燥粉碎，以1g：30mL的比例用体积浓度为95％的乙醇，在提取温度为60℃的条件下进行加热回流提取，其中，提取次数4次、每次1h，合并提取液，减压浓缩冷冻干燥，得到粗提物；
步骤2，正丁醇粗富集：将上述粗提物混悬于纯水中，首先采用石油醚、乙酸乙酯分别萃取至上相无颜色，然后再用1倍体积的正丁醇萃取5次，收集所有正丁醇萃取液，减压浓缩，冷冻干燥，得到粗皂苷提取物；
步骤3，大孔树脂精细富集：上样，将上述粗皂苷提取物用纯水配置成45mg/mL的溶液，以3BV/h的流速上大孔树脂柱HPD-400，流出液反复上柱5次，静置2h；除杂，采用0％，即纯水，以1BV/h的流速洗脱1BV；富集，选取40％，60％和80％乙醇浓度，分别以1BV/h的流速洗脱1BV，得到3组洗脱馏分，分别减压浓缩至恒重，得到3组皂苷的精细富集粉末；
步骤4，高速逆流色谱分离：选取上述皂苷的精细富集粉末2组，分别采用高速逆流色谱分离，采用的溶剂系统分别为乙酸乙酯-正丁醇-水(3:2:4,v:v:v)和乙酸乙酯-正丁醇-水(3:1:3,v:v:v)，主机转速为900rpm，分离温度为25℃，流动相流速为1mL/min，采用“头-尾”或“尾-头”分离模式；采用蒸发光散射检测器ELSD检测，其中，雾化器温度为60℃，载气流速为2.5L/min；采用自制分流阀系统实现分馏，所述自制分流阀系统由三通阀和处于样品收集端的微调阀组成，其中样品收集端管径为1/4英寸，样品检测端管径为500μm；得到7种皂苷类化学对照品；UPLC-ELSD分析7个皂苷化学对照品的纯度均大于98％；
步骤5，结构鉴定：将所述7种皂苷类化学对照品通过1H-NMR、13C-NMR进行结构鉴定，其中，6种已知皂苷分别为：Hederacholichiside F；Tanguticoside B；Tauroside St-H1；Hederoside H1；kalopanaxsaponin G；Hederasaponin B；1种新皂苷为3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyrano syl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester，对新皂苷进一步采用HMBC and NOESY确认；经结构鉴定出的7种皂苷类化学对照品为结构类似的齐墩果烷型皂苷类化合物。
本发明所制备的皂苷类化学对照品对肿瘤细胞具有抑制活性，对正常上皮细胞均无毒性，可作为有效成分应用于抗肿瘤药物中；尤其作为有效成分应用于抗胃癌、宫颈癌或卵巢癌的抗肿瘤药物中。
实施例6
唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将唐古特铁线莲全草干燥粉碎，以1g：25mL的比例用体积浓度为85％的乙醇，在提取温度为75℃的条件下进行加热回流提取，其中，提取次数2次、每次3h，合并提取液，减压浓缩冷冻干燥，得到粗提物；
步骤2，正丁醇粗富集：将上述粗提物混悬于纯水中，首先采用石油醚、乙酸乙酯分别萃取至上相无颜色，然后再用4倍体积的正丁醇萃取3次，收集所有正丁醇萃取液，减压浓缩，冷冻干燥，得到粗皂苷提取物；
步骤3，大孔树脂精细富集：上样，将上述粗皂苷提取物用纯水配置成7.5mg/mL的溶液，以2BV/h的流速上大孔树脂柱HPD-450，流出液反复上柱4次，静置4h；除杂，采用10％乙醇以3BV/h的流速洗脱3BV；富集，选取50％和70％乙醇浓度，分别以3BV/h的流速洗脱3BV，得到2组洗脱馏分，分别减压浓缩至恒重，得到2组皂苷的精细富集粉末；
步骤4，高速逆流色谱分离：选取上述皂苷的精细富集粉末2组，分别采用高速逆流色谱分离，采用的溶剂系统分别为乙酸乙酯-正丁醇-水(1:1:3,v:v:v)和乙酸乙酯-正丁醇-水(2:2:1,v:v:v)，主机转速为600rpm，分离温度为30℃，流动相流速为1mL/min，采用“头-尾”或“尾-头”分离模式；采用蒸发光散射检测器ELSD检测，其中，雾化器温度为70℃，载气流速为2.5L/min；采用自制分流阀系统实现分馏，所述自制分流阀系统由三通阀和处于样品收集端的微调阀组成，其中样品收集端管径为1/16英寸，样品检测端管径为100μm；得到7种皂苷类化学对照品；UPLC-ELSD分析7个皂苷化学对照品的纯度均大于98％；
步骤5，结构鉴定：将所述7种皂苷类化学对照品通过1H-NMR、13C-NMR进行结构鉴定，其中，6种已知皂苷分别为：Hederacholichiside F；Tanguticoside B；Tauroside St-H1；Hederoside H1；kalopanaxsaponin G；Hederasaponin B；1种新皂苷为3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyrano syl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester，对新皂苷进一步采用HMBC and NOESY确认；经结构鉴定出的7种皂苷类化学对照品为结构类似的齐墩果烷型皂苷类化合物。
本发明所制备的皂苷类化学对照品对肿瘤细胞具有抑制活性，对正常上皮细胞均无毒性，可作为有效成分应用于抗肿瘤药物中；尤其作为有效成分应用于抗胃癌、宫颈癌或卵巢癌的抗肿瘤药物中。
实施例7
唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将唐古特铁线莲全草干燥粉碎，以1g：15mL的比例用体积浓度为65％的乙醇，在提取温度为65℃的条件下进行加热回流提取，其中，提取次数4次、每次1h，合并提取液，减压浓缩冷冻干燥，得到粗提物；
步骤2，正丁醇粗富集：将上述粗提物混悬于纯水中，首先采用石油醚、乙酸乙酯分别萃取至上相无颜色，然后再用3倍体积的正丁醇萃取4次，收集所有正丁醇萃取液，减压浓缩，冷冻干燥，得到粗皂苷提取物；
步骤3，大孔树脂精细富集：上样，将上述粗皂苷提取物用纯水配置成15mg/mL的溶液，以2BV/h的流速上大孔树脂柱HPD-100，流出液反复上柱1次，静置8h；除杂，采用40％乙醇以2BV/h的流速洗脱2BV；富集，选取40％，60％和80％乙醇浓度，分别以2BV/h的流速洗脱2BV，得到3组洗脱馏分，分别减压浓缩至恒重，得到3组皂苷的精细富集粉末；
步骤4，高速逆流色谱分离：选取上述皂苷的精细富集粉末2组，分别采用高速逆流色谱分离，采用的溶剂系统分别为乙酸乙酯-正丁醇-水(4:1:4,v:v:v)和乙酸乙酯-正丁醇-水(2:1:2,v:v:v)，主机转速为600rpm，分离温度为30℃，流动相流速为3mL/min，采用“头-尾”或“尾-头”分离模式；采用蒸发光散射检测器ELSD检测，其中，雾化器温度为80℃，载气流速为2.5L/min；采用自制分流阀系统实现分馏，所述自制分流阀系统由三通阀和处于样品收集端的微调阀组成，其中样品收集端管径为1/8英寸，样品检测端管径为250μm；得到7种皂苷类化学对照品；UPLC-ELSD分析7个皂苷化学对照品的纯度均大于98％；
步骤5，结构鉴定：将所述7种皂苷类化学对照品通过1H-NMR、13C-NMR进行结构鉴定，其中，6种已知皂苷分别为：Hederacholichiside F；Tanguticoside B；Tauroside St-H1；Hederoside H1；kalopanaxsaponin G；Hederasaponin B；1种新皂苷为3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyrano syl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester，对新皂苷进一步采用HMBC and NOESY确认；经结构鉴定出的7种皂苷类化学对照品为结构类似的齐墩果烷型皂苷类化合物。
本发明所制备的皂苷类化学对照品对肿瘤细胞具有抑制活性，对正常上皮细胞均无毒性，可作为有效成分应用于抗肿瘤药物中；尤其作为有效成分应用于抗胃癌、宫颈癌或卵巢癌的抗肿瘤药物中。
实施例8
唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将唐古特铁线莲全草干燥粉碎，以1g：30mL的比例用体积浓度为75％的乙醇，在提取温度为70℃的条件下进行加热回流提取，其中，提取次数3次、每次3h，合并提取液，减压浓缩冷冻干燥，得到粗提物；
步骤2，正丁醇粗富集：将上述粗提物混悬于纯水中，首先采用石油醚、乙酸乙酯分别萃取至上相无颜色，然后再用4倍体积的正丁醇萃取2次，收集所有正丁醇萃取液，减压浓缩，冷冻干燥，得到粗皂苷提取物；
步骤3，大孔树脂精细富集：上样，将上述粗皂苷提取物用纯水配置成15mg/mL的溶液，以1BV/h的流速上大孔树脂柱ADS-7，流出液反复上柱2次，静置6h；除杂，采用20％乙醇以2BV/h的流速洗脱8BV；富集，选取50％和70％乙醇浓度，分别以2BV/h的流速洗脱6BV，得到2组洗脱馏分，分别减压浓缩至恒重，得到2组皂苷的精细富集粉末；
步骤4，高速逆流色谱分离：选取上述皂苷的精细富集粉末2组，分别采用高速逆流色谱分离，采用的溶剂系统分别为乙酸乙酯-正丁醇-水(3:2:4,v:v:v)和乙酸乙酯-正丁醇-水(1:2:2,v:v:v)，主机转速为700rpm，分离温度为35℃，流动相流速为4mL/min，采用“头-尾”或“尾-头”分离模式；采用蒸发光散射检测器ELSD检测，其中，雾化器温度为60℃，载气流速为2.5L/min；采用自制分流阀系统实现分馏，所述自制分流阀系统由三通阀和处于样品收集端的微调阀组成，其中样品收集端管径为1/4英寸，样品检测端管径为500μm；得到7种皂苷类化学对照品；UPLC-ELSD分析7个皂苷化学对照品的纯度均大于98％；
步骤5，结构鉴定：将所述7种皂苷类化学对照品通过1H-NMR、13C-NMR进行结构鉴定，其中，6种已知皂苷分别为：Hederacholichiside F；Tanguticoside B；Tauroside St-H1；Hederoside H1；kalopanaxsaponin G；Hederasaponin B；1种新皂苷为3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester，对新皂苷进一步采用HMBC and NOESY确认；经结构鉴定出的7种皂苷类化学对照品为结构类似的齐墩果烷型皂苷类化合物。
本发明所制备的皂苷类化学对照品对肿瘤细胞具有抑制活性，对正常上皮细胞均无毒性，可作为有效成分应用于抗肿瘤药物中；尤其作为有效成分应用于抗胃癌、宫颈癌或卵巢癌的抗肿瘤药物中。
实施例9
取实施例1-8所制备的唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品进行肿瘤细胞株(胃癌MGC-803和HGC-27，卵巢癌SK-OV-3，宫颈癌Hela)抑制活性试验和对正常胃黏膜上皮细胞GES-1细胞株毒性实验。
1、试验过程
(1)细胞的体外培养、传代及计数
细胞用含10％FBS及1％青链霉素的1640完全培养基，在37℃、5％CO2湿润培养箱中培养。当细胞融合度达到80％以上时，对细胞按照1:5传代。使用血球计数板进行细胞计数，血球计数板存在H形凹槽，形成2块高0.1mm的计数池，每个计数池中包含9个大方格，细胞计数区域为四角的4个大方格。细胞个数＝4个大方格中细胞总数/4×104×稀释倍数。细胞个数确定后可根据实验需要，调整细胞密度。
(2)所制备的唐古特铁线莲皂苷类化学对照品对胃癌细胞株MGC-803和HGC-27、卵巢癌细胞株SK-OV-3、宫颈癌Hela和正常胃黏膜上皮细胞GES-1的影响实验。其中，胃癌细胞HGC-27、宫颈癌细胞Hela、卵巢癌细胞SK-OV-3购买自武汉普诺赛生命科技有限公司，胃癌细胞MGC-803和正常胃黏膜上皮细胞GES-1购买自北纳生物细胞库。
2、实验方法
(1)选择对数生长期的细胞，调整细胞悬液浓度接种于96孔培养板，每孔100μL，使37℃、5％CO2湿润培养箱中培养24h时细胞融合率达到80％。
(2)吸去原有培养基，PBS洗涤一次，然后加入含有不同浓度(10，45，80，115，150μM)唐古特铁线莲皂苷类化学对照品的培养基，每孔100μL，37℃、5％CO2湿润培养箱中作用48h。顺铂作为阳性对照。每组设5孔作为平行。
(3)每孔加入20μL新鲜配置的MTT溶液(5mg/mL)，避光培养4h。
(4)小心吸去上清液终止培养，每孔加入DMSO150μL，置于摇床上低速震荡15min，使结晶物充分溶解，用酶标仪于540nm处测定每孔吸光度值(OD)。计算细胞生长抑制率，结果用平均值±SD(标准差)表示。GraphPad软件用于IC50值的拟合。
细胞生长抑制率＝(1-OD实验组/OD空白对照)×100％
3、实验结果
所制备的唐古特铁线莲皂苷类化学对照品对5种细胞株的影响结果详见表1。其中，新皂苷类化学对照品3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester和皂苷Hederacholichiside F对胃癌细胞HGC-27具有选择抑制活性，IC50值分别为20.17和66.18μM，表明齐墩果烷型三萜皂苷C-3位取代基上存在D-阿洛糖或分支糖链可能增强对肿瘤细胞的抑制活性。皂苷Hederasaponin B对胃癌细胞HGC-27、宫颈癌细胞Hela和卵巢癌细胞SK-OV-3具有广谱抑制作用(IC50分别为16.4，71.3，64.4μM)，而皂苷Hederoside H1在所测浓度下对四种肿瘤细胞株(胃癌细胞株MGC-803和HGC-27、卵巢癌细胞株SK-OV-3及宫颈癌Hela)均没有表现出明显的抑制活性。皂苷Hederoside H1与Hederasaponin B结构的唯一区别在于前者C-4位为-CH3和-OH取代，而后者C-4位为两个-CH3取代，这表明在C-4处存在两个-CH3可以显著增加肿瘤细胞抑制活性。此外，皂苷Tauroside St-H1对卵巢癌细胞株SK-OV-3表现出选择性抑制活性，IC50值为48.70μM。所有分离的皂苷对正常胃黏膜上皮细胞GES-1均无毒性(IC50>150μM)。
表1 唐古特铁线莲皂苷类化学对照品的抗肿瘤细胞活性
Figure BDA0003182078540000261
Figure BDA0003182078540000271
实施例10
1、唐古特铁线莲中皂苷类成分的富集工艺的优化实验
(1)静态吸附实验选择大孔吸附树脂
取预处理好的6种树脂(HPD-100、X-5、HPD-400、AB-8、HPD-450和ADS-7，相当于干重1g)，分别置于100mL具塞三角烧瓶中，各加入30mg/mL唐古特铁线莲粗皂苷溶液25mL，塞紧瓶塞，另取不加树脂的25mL唐古特铁线莲粗皂苷溶液作为对照，置于恒温振荡器中震荡12h充分吸附后，取每组溶液测定皂苷含量。将各瓶中混合液进行过滤，除去溶液，将吸附了样品的树脂置于锥形瓶中，加入95％乙醇-水25mL，塞紧瓶塞，置于振荡器中振荡2h，测定每种树脂解析液中的皂苷含量。每组设置3个平行。按照公式①和②分别计算吸附量和吸附率。
Figure BDA0003182078540000272
Figure BDA0003182078540000273
式中，Ae为干树脂吸附量(mg/g)；C0和C1分别表示样品溶液总皂苷的初始浓度和吸附平衡浓度(mg/mL)；V1为样品溶液体积(mL)；Dd为解吸率(％)；C2为解吸液总皂苷浓度(mg/mL)；V2为解吸液的体积(mL)。
(2)动态吸附和解吸附实验
采用预处理后的水合树脂(5g干树脂)，湿法填充玻璃柱(2.5cm×45cm)，进行动态吸附和解吸附试验。柱体积约30mL。
①上样溶液浓度的优化
分别采用浓度为7.5、15、30、45、60mg/mL的唐古特铁线莲粗皂苷溶液上样，改变上样体积(240-30mL)以保证上样量相同。吸附相同时间后，用纯水去除多余样品，用70％乙醇洗脱，洗脱体积为5BV，收集洗脱液，测定不同上样浓度时洗脱液中总皂苷浓度，选择上样的最佳初始浓度。
②洗脱液浓度的选择
将70mL的30mg/mL唐古特铁线莲粗皂苷溶液加载到树脂柱上，依次用纯水、10％、20％、30％、40％、50％、60％和70％乙醇洗涤，洗脱体积为5BV。收集不同浓度乙醇的洗脱液，浓缩干燥称重。并测定不同洗脱部位总皂苷的纯度(％，mg/mg)，即质量浓度，按照公式③计算不同洗脱部位总皂苷的重量。
Y＝m×P③
其中Y(mg)是不同洗脱部位总皂苷的重量；m(mg)是不同部位的重量；P(％，mg/mg)是不同部位总皂苷的纯度。
③洗脱液体积的优化
将70mL的唐古特铁线莲粗皂苷溶液(30mg/mL，相当于总皂苷8.74mg/mL)加载到树脂柱上，首先用5BV的纯水去除未吸附的样品，然后分别采用不同洗脱体积(1，2，3，4，5，6，7，8BV)的30％和70％乙醇进行研究。浓缩不同洗脱部位，测定不同部位总皂苷的重量，选择最佳的洗脱液体积。
2、唐古特铁线莲中皂苷类成分的富集工艺的优化结果
(1)筛选合适的树脂
选择具有强吸附和解吸性能的大孔树脂是有效富集目标化合物的关键步骤。唐古特铁线莲皂苷类化合物通常由非极性的苷元和极性的糖链组成，这表明非极性树脂、弱极性树脂和极性大孔树脂均可用于唐古特铁线莲皂苷成分的富集。本发明研究了六种皂苷(HPD-100、X-5、HPD-400、AB-86、HPD-450和ADS-7)对目标皂苷化合物的吸附能力和解吸率，结果如附图14所示。结果表明，非极性HPD-100(91.5mg/g，91.6％)和极性ADS-7(91.3mg/g，87.9％)比其他树脂具有更高的吸附能力和解吸率。推测是由于唐古特铁线莲皂苷的非极性苷元和极性糖链在树脂吸附过程中起了重要作用。考虑到HPD-100的价格相对较低，最终选择HPD-100进行后续实验。
(2)初始上样浓度的影响
如附图15所示，当样品上样浓度由7.5mg/mL增加至30mg/mL过程中，树脂对唐古特铁线莲总皂苷的吸附能力逐渐增强，当样品溶液浓度为30mg/mL时达到最大。但随着上样浓度的进一步增加，树脂对总皂苷的吸附能力反而略有下降。这种现象可以解释为当上样浓度过低时，需要较大的上样体积和较长的上样时间，该过程中容易造成样品的损耗；当上样浓度过高时，树脂对杂质的吸附也可能造成对目标皂苷成分的吸附能力变弱。因此，最终选择唐古特铁线莲皂苷的上样浓度30mg/mL进行后续富集纯化过程。
(3)乙醇浓度对富集效果的影响结果
不同乙醇浓度洗脱液浓缩物的质量、总皂苷的纯度和含量测定结果如图16所示。总皂苷的纯度和含量随乙醇浓度的增加而显著增加，当乙醇浓度为40％、50％、60％时达到最高，其总皂苷纯度分别为63.6％、70.7％和63.3％，含量分别为542.5、227.1和130.4mg，然后以70％和80％乙醇洗脱时，总皂苷纯度和含量均有所下降。总皂苷10％、20％、30％和80％乙醇洗脱液浓缩物的质量分别为122.3、160.2、216.1和14.2mg，但其总皂苷的含量只有6.9、10.2、19.8和3.7mg。因此，从高效富集和节省试剂的角度出发，选择先用30％乙醇作为除杂试剂去除非皂苷类杂质，然后用70％乙醇作为洗脱溶剂富集总皂苷。
(4)洗脱体积的影响结果
上样结束吸附完全后，依次用30％和70％乙醇进行除杂和洗脱，考察洗脱体积分别为1、2、3、4、5、6、7和8BV对富集效果的影响。首先，用30％乙醇去除非皂苷类杂质。如图17所示，当30％乙醇洗脱液用量为1-4BV时，洗脱液干燥产物的质量分别为63.0、164.6、83.8、43.3mg，纯度分别为4.85％、7.80％、7.13％和7.70％。继续洗脱达5-8BV时，每个柱体积洗脱产物中总皂苷纯度分别为17.9％、6.9％、15.6％和15.9％。因此，出于最大限度去除非皂苷杂质，同时避免目标皂苷类成分的损失的目的，选择4BV的30％乙醇作为最佳除杂试剂。第二步，考察不同体积70％乙醇对于富集效果的影响。当采用1-2BV的洗脱体积的70％乙醇洗脱时，分别获得了436.2mg和468mg的洗脱产物，同时，其中所含总皂苷纯度分别为61.3％和63.7％。当洗脱体积为3-4BV时，产物质量为76.3mg和78.2mg，皂苷纯度分别为63.9％和53.1％。当洗脱体积由5BV至8BV时，分别得到49.1、38.2、32.7和17.7mg样品，纯度均低于25％。因此，出于节省试剂和富集高纯度高产率皂苷样品的角度，最终选择4BV的70％乙醇作为最佳洗脱体积。
实施例11
实施例1-8所制备的唐古特铁线莲中皂苷类成分的HSCCC分离体系的优化实验
通过分析目标化合物在两相溶剂体系中的分配系数(K)，对乙酸乙酯/正丁醇/水组成的溶剂体系进行了优化。将适量的样品粉末溶解到一系列不同比例的两相溶剂体系中，剧烈摇动，使样品在两相之间达到完全平衡。取相同体积的上、下相，蒸干溶剂，将残留物溶于2mL甲醇，进行HPLC-ELSD分析。K＝A上相/A下相，其中A上相和A下相分别代表目标化合物在上相和下相的峰面积。目标化合物在不同比例乙酸乙酯/正丁醇/水体系中的K值如表2所示。若K值太小，化合物会被迅速洗脱，多个化合物重叠，而K值过大会显著延长洗脱时间，峰形更宽。一般来说，K值应在0.2-5范围内，两种化合物的分离因子(α＝K2/K1，K2>K1)应大于1.5，以实现较好的分离效果和合适的分离时间。7个皂苷类对照品在不同两相溶剂体系中的分配情况见表2。最终选择乙酸乙酯/正丁醇/水(v/v/v，2:2:4)和乙酸乙酯/正丁醇/水(v/v/v，4:1:4)作为分离40％和60％乙醇洗脱部位三萜皂苷的最佳溶剂体系。
表2 目标化合物的K值
Figure BDA0003182078540000311
Figure BDA0003182078540000321
实施例12
新化合物的结构鉴定数据如下：
白色粉末；m.p.220.3-221.2℃；
Figure BDA0003182078540000323
UV(H2O)：λmax＝191nm；IR(KBr)：νmax＝3382，2930，1729，1637，1450，1381，1365，1256，1232，1028cm-1；HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 1381.6624[M-H]-(计算值为1381.6628)，示分子式为C65H106O31。其在氘代吡啶中的1H and 13C核磁数据如表3所示。其HMBC和NOSEY结果如附图12所示。
表3 新化合物在氘代吡啶中的1H and 13C核磁数据
Figure BDA0003182078540000322
Figure BDA0003182078540000331
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺，其特征在于，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将唐古特铁线莲全草干燥粉碎，以1g：5～30mL的比例用体积浓度为60～95％的乙醇，在提取温度为60～90℃的条件下进行加热回流提取，其中，提取次数1～4次、每次1～4h，合并提取液，减压浓缩冷冻干燥，得到粗提物；
步骤2，正丁醇粗富集：将上述粗提物混悬于纯水中，首先采用石油醚、乙酸乙酯分别萃取至上相无颜色，然后再用1～5倍体积的正丁醇萃取1～5次，收集所有正丁醇萃取液，减压浓缩，冷冻干燥，得到粗皂苷提取物；
步骤3，大孔树脂精细富集：上样，将上述粗皂苷提取物用纯水配置成7.5～60mg/mL的溶液，以1～5BV/h的流速上大孔树脂柱，流出液反复上柱1～5次，静置2～12h；除杂，采用0～40％乙醇以1～5BV/h的流速洗脱1～8BV；富集，在30～90％乙醇中，选取2～4种乙醇浓度，分别以1～5BV/h的流速洗脱1～8BV，得到2～4组洗脱馏分，分别减压浓缩至恒重，得到2～4组皂苷的精细富集粉末；
步骤4，高速逆流色谱分离：选取上述皂苷的精细富集粉末2组，分别采用高速逆流色谱分离，得到7种皂苷类化学对照品；UPLC-ELSD分析7个皂苷化学对照品的纯度均大于98％；
步骤5，结构鉴定：将所述7种皂苷类化学对照品通过1H-NMR、13C-NMR进行结构鉴定，其中，6种已知皂苷分别为：Hederacholichiside F；Tanguticoside B；Tauroside St-H1；Hederoside H1；kalopanaxsaponin G和Hederasaponin B；1种新皂苷为3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyrano syl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester，对新皂苷进一步采用HMBC and NOESY确认；经结构鉴定出的7种皂苷类化学对照品为结构类似的齐墩果烷型皂苷类化合物；上述7种皂苷类化学对照品的化学结构式依次如下：
Figure FDA0003623442510000021
Hederacholichiside F
Figure FDA0003623442510000022
Tanguticoside B
Figure FDA0003623442510000031
Tauroside St-H1
Figure FDA0003623442510000032
Hederoside H1
Figure FDA0003623442510000033
kalopanaxsaponin G
Figure FDA0003623442510000041
Hederasaponin B
Figure FDA0003623442510000042
3-O-β-D-allopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopy ranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester。
2.根据权利要求1所述的唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺，其特征在于，步骤3所述的大孔树脂为HPD-100，X-5，HPD-400，AB-8，HPD-450和ADS-7中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺，其特征在于，步骤4所述高速逆流色谱分离中，采用的溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水＝1～4:1～4:1～4，v:v:v，主机转速为600～1000rpm，分离温度为25～40℃，流动相流速为1～4mL/min，采用“头-尾”或“尾-头”分离模式。
4.根据权利要求1所述的唐古特铁线莲中皂苷类化学对照品的分离制备工艺，其特征在于，步骤4所述高速逆流色谱分离步骤中，采用蒸发光散射检测器ELSD检测，其中，雾化器温度为60～90℃，载气流速为2.5L/min；采用自制分流阀系统实现分馏，所述自制分流阀系统由三通阀和处于样品收集端的微调阀组成，其中样品收集端管径为1/16～1/4英寸，样品检测端管径为100～500μm。
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