CN103655769A - 东北铁线莲皂苷提取物的制备及其抗肿瘤应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种东北铁线莲皂苷类为主的提取物及其制备方法与应用，东北铁线莲药材经10倍(药材/溶媒:g/L)50%乙醇回流提取，每次2h，共3次；提取液合并浓缩去醇后，加入氢氧化钠溶液调到pH10-13，加热沸腾4-10小时，每30-60分钟测pH，保持在pH10-13，放冷，加盐酸溶液，调pH5-7，即得东北铁线莲皂苷提取物水解液，上大孔吸附树脂，依次用水-乙醇梯度洗脱，收集乙醇浓度为50~95%之间的洗脱液，合并，真空干燥，即得本发明的提取物，其总酚类提取物的UV含量可达50%以上。药理实验显示其对肝癌、胃癌、胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、白血病、结肠癌、淋巴癌瘤株细胞具有明显的抑制作用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种东北铁线莲皂苷提取物的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用，该提取物具有显著的抗肿瘤活性，可以用来制备抗肿瘤或肿瘤辅助治疗的药物。
背景技术
东北铁线莲(Clematis manshurica Rupr.)为临床上药材东北铁线莲的主要来源之一，2000年版《中华人民共和国药典》将威灵仙(Clematis chinensis Osbeck)、东北铁线莲(Clematis manshurica Rupr.)和棉团铁线莲(Clematis hexapetala Pall.)三种植物的根及根茎作为东北铁线莲的正品药材应用。其中东北铁线莲Clematis chinensis Osbeck.主要分布于我国长江以南省区，如湖南、湖北、江西、江苏、浙江、福建、广东、广西、四川等地区；东北铁线莲Clematis manshurica Rpur.主要分布于内蒙和东北地区；棉团铁线莲Clematis hexapetala Pall.主要分布于内蒙东部、黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、山西等北方地区。主要用于治疗风湿痹痛、关节不利等证。现代药理研究表明东北铁线莲有很好的抗炎、镇痛、抗肿瘤等活性。
有关该属植物的化学成分研究也越来越深入，国内外已对铁线莲属的近20 种植物进行过化学成分的研究，从中分离得到了150 多个单体化合物。包括多种结构类型，主要有皂苷、黄酮、木脂素、香豆素、生物碱等成分。其中皂苷是最主要的一类成分，占分离化合物总数的一半以上，这些化合物苷元均为齐墩果烷型五环三萜，主要有齐墩果酸和常春藤型皂苷元两种类型。
药理实验和临床研究表明该属植物具有多种生理活性，具有较高的研究价值和开发前景，现代药理学研究不仅显示出与该属药用植物传统功效相吻合的抗菌，抗炎、镇痛作用，而且在抗肿瘤、及心血管系统方面显示了新的活性。
目前有关东北铁线莲总皂苷提取物在抗肿瘤方面的生物活性和临床研究的文献较少。虽然文献报道东北铁线莲总皂苷具有抗肿瘤作用，并且不会抑制免疫功能和造血系统，但是文献报道的东北铁线莲总皂苷提取物的抗肿瘤活性也较弱，与现在肿瘤临床治疗用药具有比较明显的差距，如：文献报道东北铁线莲总皂苷对HeP-GZ、SMMC-7721和Hela细胞有一定的抑制作用，IC50基本在0.195mg/ml以上。文献明确了东北铁线莲的抗肿瘤作用，但未能全面的反映其作为肿瘤药的研究开发价值。
发明内容
在文献调研基础上，本发明通过对东北铁线莲总皂苷的提取工艺进行改进后，使其抗肿瘤活性得到显著的提高，总皂苷对对SGC-7901、U251、Bel-7402、SMMC-7721 等肿瘤细胞的IC50均小于25ug/ml。并且提取物中总皂苷类成分的UV含量大于50%。
本发明的特征在于提取物中总皂苷类成分的UV含量大于50%。
本发明的提取物通过以下步骤制备：
1）东北铁线莲药材经10倍(药材/溶媒:g/L)50%乙醇回流提取，每次2 h，共3次；提取液合并浓缩去醇后，即得东北铁线莲皂苷类成分总提取物。
2）在总提取物中加入氢氧化钠溶液调到pH10-13，加热沸腾4-10小时，每30 min测一次pH，保持pH在10-13，放冷，加盐酸溶液，调pH 5-7，即得东北铁线莲皂苷类成分总提取物的水解物。
3）将总皂苷类成分水解物上大孔吸附树脂，依次用水-乙醇梯度洗脱，收集乙醇浓度为50 ~95%之间的洗脱液，合并，真空干燥，即得本发明的提取物。
本发明的东北铁线莲总皂苷类提取物的制备方法，其特征在于制备步骤1)所述的乙醇浓度为50%。
本发明的东北铁线莲总皂苷类提取物的制备方法，其特征在于制备步骤2)所述的碱水解的pH保持在10-13。
本发明的东北铁线莲总皂苷类提取物的制备方法，其特征在于制备步骤3)所述的大孔吸附树脂可以是D4020型、NKA-9型、AB-8型、HPD-450、ZTC型、D101型、D101C型及ADS-F8型吸附树脂中的一种或两种以上。
本发明的东北铁线莲总皂苷类提取物的制备方法，其特征在于大孔吸附树脂可以是优选D101型和D101C型。
本发明的东北铁线莲总皂苷类提取物，其特征在于该提取物对SGC-7901、BGC-823、NCI-H460、U251、Bel-7402、SMMC-7721、SK-OV-3、A549、PC-3、HT-29、HCT-116、K562细胞均有较好的抑制活性，IC50均小于25ug/ml。
本发明的东北铁线莲总皂苷类提取物，其特征在于：该东北铁线莲总皂苷类提取物可在制备抗胃癌、肺癌、胶质瘤、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、白血病药物中的应用。
本发明的东北铁线莲总皂苷类提取物制成的制剂，其特征在于：该东北铁线莲总皂苷类提取物与药物辅料配制成药剂学上的各种制剂。
本发明的东北铁线莲总皂苷类提取物制成的制剂，其特征在于：制剂的给药途径可以是口服、注射和局部给药。
为了比较真实的反映东北铁线莲药材抗肿瘤作用，本发明的东北铁线莲提取物制备工艺采用活性引导分级分离方法，并结合紫外分光光度法跟踪检测，对东北铁线莲提取物进行碱水解和大孔吸附树脂富集，避免了抗肿瘤活性成分的流失，同时使其体外抗肿瘤作用得到大幅度的提高，比文献报道的体外活性提高约10倍。具体表现在：本发明东北铁线莲提取物经紫外分光光度计检测皂苷类成分含量约50%，对SGC-7901、U251、Bel-7402、SMMC-7721 等肿瘤细胞的IC50均小于25ug/ml。
因而，本发明的东北铁线莲皂苷类提取工艺在药材利用率、提高疗效等方面具有明显的优势。
附图说明
图1 东北铁线莲总皂苷提取物含量测定标准曲线图
图2 东北铁线莲总皂苷提取物HPLC图
具体实施方式
（1）东北铁线莲提取物中皂苷类成分含量测定
1）对照品溶液的制备：取齐墩果酸对照品适量，加甲醇溶解并稀释至0.1mg/mL。
2）齐墩果酸苷元最大吸收波长的确定
精密吸取对照品溶液1ml，2份（一份做空白，一份做显色），加入标号的干燥的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇匀，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200～700nm波长范围内进行扫描。结果供试品溶液与对照品溶液在310nm波长处有最大吸收，故确定测定波长为310nm。
3）标准曲线的绘制
精密移取对照品溶液0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8 mL各2份（一份做空白，一份做显色），转移至10mL的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇匀，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200-500nm波长扫描，在310nm波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标, 常春藤皂苷元对照品浓度为横坐标,绘制标准曲线,以吸收度A对浓度C作最小二乘法回归，得标准曲线方程为：C=4.1446A+0.0362, R2=0.999（n=4），线性范围为7.0～34.3 g/mL，质量浓度与吸收度值的线性关系良好。。
样品测定与对照品的测定方法相同。
（2）东北铁线莲提取物HPLC检测
仪器：Agilent 1100型高效液相色谱仪
色谱柱：COSMOSIL C18色谱柱(4.6 mm×250 mm)；柱温：25℃；流速：1.0 mL·min-1 ；进样量：20 μL；流动相：甲醇-水（83:17），ELSD检测。
（3）东北铁线莲提取物抗肿瘤活性实验
1）细胞培养：取12种SGC-7901（胃癌）、BGC-823（胃癌）、NCI-H460（肺癌）、U251（胶质瘤）、Bel-7402（肝癌）、SMMC-7721（肝癌）SK-OV-3（卵巢癌）、A549（肺癌）、PC-3（前列腺癌）、HT-29（结肠癌）、HCT-116(结肠癌)、K562（白血病）人肿瘤细胞，用含10%胎牛血清的相应培养基在37℃，5%CO2条件下培养，传3代后，取对数生长期细胞用于实验。
2）受试药物的配制：电子天平称取少量受试药物（1~3mg），用少量DMSO溶解后（0.1%以内），用相应培养基配制成浓度为200、100、50、25、12.5μg/ml的药液，首浓度0.22μm过滤后，后面的浓度对半稀释配制，备用；
3）细胞增殖抑制实验：取对数生长期细胞，调整密度为8×104个/mL，接种于96孔板中，每孔100μl，24h后加入不同浓度含药培养基100μl，对照组每孔加培养基100μl，对照组与药物组均设3个复孔，另设2个空白对照孔，不加细胞只加培养基的作为对照组调零。将96孔板置5%CO2培养箱(37℃) 培养48 h，加入5 mg/ml MTT 20μl，继续培养4 h后，弃上清，加入DMSO150μl，振荡溶解10min，酶标仪于490 nm处测定OD值。
按寇氏改良法公式：X50=Xm-i(ΣP-0.5)则LD50=log-1 X50（Xm：最大剂量组剂量的对数值；i：相邻两组剂量（d）对数值之差，或相邻两组高剂量与低剂量之比的对数；P：各组动物的死亡率，用小数表示；ΣP：为各组动物死亡率的总和），计算IC50。
实施案例1
取1 Kg东北铁线莲药材粗粉，经10倍(药材/溶媒:g/L)50 %乙醇回流提取，每次2 h，共3次；提取液合并浓缩去醇后，即得东北铁线莲皂苷类成分总提取物。在总提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到pH10-13，加热沸腾4小时，每30 min测一次pH，保持pH在10-13，放冷，加盐酸溶液，调pH 5-7，即得东北铁线莲皂苷类成分总提取物的水解物。将总皂苷类成分水解物上大孔吸附树脂D101，依次用4BV的去离子水、2BV10%、6BV50%乙醇溶液以3mLmin-1的流速进行洗脱，收集50%乙醇洗脱物，经真空干燥，即得东北铁线莲总皂苷提取物11g，其UV含量55%。MTT法药理活性实验结果显示，总皂苷提取物对12种肿瘤细胞的IC50均小于25ug/ml。
表1 东北铁线莲总皂苷提取物对12种人肿瘤细胞的活性
| 受试细胞株 | IC50(μg/ml) |
| SGC-7901（胃癌） | 23.37 |
| BGC-823（胃癌） | 16.81 |
| NCI-H460（肺癌） | 14.48 |
| U251（胶质瘤） | 15.68 |
| Bel-7402（肝癌） | 21.72 |
| SMMC-7721（肝癌） | 18.67 |
| SK-OV-3（卵巢癌） | 15.32 |
| A549（肺癌） | 20.74 |
| PC-3（前列腺癌） | 15.45 |
| HT-29（结肠癌） | 16.33 |
| HCT-116(结肠癌) | 16.47 |
| K562（白血病） | 14.12 |
实施案例2
取1 Kg东北铁线莲药材粗粉，经10倍(药材/溶媒:g/L)50 %乙醇回流提取，每次2 h，共3次；提取液合并浓缩去醇后，即得东北铁线莲皂苷类成分总提取物。在总提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到pH10-13，加热沸腾4小时，每30 min测一次pH，保持pH在10-13，放冷，加盐酸溶液，调pH 5-7，即得东北铁线莲皂苷类成分总提取物的水解物。将总皂苷类成分水解物上大孔吸附树脂D101，依次用4BV的去离子水、2BV10%、4BV70%乙醇溶液以3mLmin-1的流速进行洗脱，收集70%乙醇洗脱物，经真空干燥，即得东北铁线莲总皂苷提取物11g，其UV含量53%。MTT法药理活性实验结果显示，总皂苷提取物对12种肿瘤细胞的IC50均小于25ug/ml。
表2 东北铁线莲总皂苷提取物对12种人肿瘤细胞的活性
| 受试细胞株 | IC50(μg/ml) |
| SGC-7901（胃癌） | 24.71 |
| BGC-823（胃癌） | 18.61 |
| NCI-H460（肺癌） | 18.48 |
| U251（胶质瘤） | 16.58 |
| Bel-7402（肝癌） | 20.1 |
| SMMC-7721（肝癌） | 17.18 |
| SK-OV-3（卵巢癌） | 16.2 |
| A549（肺癌） | 19.47 |
| PC-3（前列腺癌） | 16.32 |
| HT-29（结肠癌） | 15.12 |
| HCT-116(结肠癌) | 15.52 |
| K562（白血病） | 14.21 |
实施案例3
取1 Kg东北铁线莲药材粗粉，经10倍(药材/溶媒:g/L)50 %乙醇回流提取，每次2 h，共3次；提取液合并浓缩去醇后，即得东北铁线莲皂苷类成分总提取物。在总提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到pH10-13，加热沸腾4小时，每30 min测一次pH，保持pH在10-13，放冷，加盐酸溶液，调pH 5-7，即得东北铁线莲皂苷类成分总提取物的水解物。将总皂苷类成分水解物上大孔吸附树脂D101，依次用4BV的去离子水、2BV10%、3BV95%乙醇溶液以3mLmin-1的流速进行洗脱，收集50%乙醇洗脱物，经真空干燥，即得东北铁线莲总皂苷提取物11g，其UV含量51%。MTT法药理活性实验结果显示，总皂苷提取物对12种肿瘤细胞的IC50均小于25ug/ml。
表3 东北铁线莲总皂苷提取物对12种人肿瘤细胞的活性
| 受试细胞株 | IC50(μg/ml) |
| SGC-7901（胃癌） | 21.39 |
| BGC-823（胃癌） | 16.32 |
| NCI-H460（肺癌） | 16.24 |
| U251（胶质瘤） | 12.61 |
| Bel-7402（肝癌） | 16.59 |
| SMMC-7721（肝癌） | 15.36 |
| SK-OV-3（卵巢癌） | 14.83 |
| A549（肺癌） | 17.78 |
| PC-3（前列腺癌） | 14.65 |
| HT-29（结肠癌） | 13.18 |
| HCT-116(结肠癌) | 13.22 |
| K562（白血病） | 12.34 |
Claims (10)
1.东北铁线莲总皂苷类成分提取物，其特征在于提取物中总皂苷类成分的UV含量大于50%。
2.权利要求1所述东北铁线莲总皂苷类成分提取物的制备方法，其特征是所述提取物通过以下步骤制备：
1）东北铁线莲药材经10倍(药材/溶媒:g/L)50%乙醇回流提取，每次2 h，共3次；提取液合并浓缩去醇后，即得东北铁线莲皂苷类成分总提取物
2）在总提取物中加入氢氧化钠溶液调到pH10-13，加热沸腾4-10小时，每30 min测一次pH，保持pH在10-13，放冷，加盐酸溶液，调pH 5-7，即得东北铁线莲皂苷类成分总提取物的水解物
3）将总皂苷类成分水解物上大孔吸附树脂，依次用水-乙醇梯度洗脱，收集乙醇浓度为50 ~95%之间的洗脱液，合并，真空干燥，即得本发明的提取物。
3.根据权利要求2所述的东北铁线莲总皂苷类提取物的制备方法，其特征在于步骤1)所述的乙醇浓度为50%。
4.根据权利要求2所述的东北铁线莲总皂苷类提取物的制备方法，其特征在于步骤2)所述的碱水解的pH保持在10-13。
5.根据权利要求2所述的东北铁线莲总皂苷类提取物的制备方法，其特征在于步骤3)所述的大孔吸附树脂可以是D4020型、NKA-9型、AB-8型、HPD-450、ZTC型、D101型、D101C型及ADS-F8型吸附树脂中的任何一种。
6.根据权利要求2或5所述的东北铁线莲总皂苷类提取物的制备方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂优选D101型和D101C型大孔吸附树脂。
7.根据权利要求1所述东北铁线莲总皂苷类提取物，其特征在于该提取物对SGC-7901、BGC-823、NCI-H460、U251、Bel-7402、SMMC-7721、SK-OV-3、A549、PC-3、HT-29、HCT-116、K562细胞均有较好的抑制活性，IC50均小于25ug/ml。
8.根据权利要求1所述东北铁线莲总皂苷类提取物，其特征在于：该东北铁线莲总皂苷类提取物可在制备抗胃癌、肺癌、胶质瘤、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、白血病药物中的应用。
9.根据权利要求1所述东北铁线莲总皂苷类提取物制成的制剂，其特征在于：该东北铁线莲总皂苷类提取物与药物辅料配制成药剂学上的各种制剂。
10.根据权利要求1所述东北铁线莲总皂苷类提取物制成的制剂，其特征在于：制剂的给药途径可以是口服、注射和局部给药。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140326 |