CN114365751A - 一种烟草内源抗烟草花叶病毒提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种烟草内源抗烟草花叶病毒提取物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种烟草内源抗烟草花叶病毒提取物及其制备方法和应用，包括：步骤1，提取：取晾干的烟草根茎粉碎，多次浸煮后蒸馏得到浸膏；步骤2，纯化：将所得浸膏依次经过浓缩、上色谱柱、洗脱、蒸馏得到浓缩液；步骤3，干燥：将浓缩液干燥并粉碎过100目筛后收集分装。本发明采用烟田废弃物，经溶剂提取、色谱分离的方法形成烟草内源抗病毒组份规模化生产工艺和质量控制方法，并对其使用方法和范围进行了明确，为利用进一步系统研究烟草内源抗烟草病毒病提供物质基础和科学依据，开创了一种田间病毒病防治新渠道，有效保证了烟草内源抗烟草花叶病毒组份制备过程的有序性和连贯性的同时也有效祛除了烟碱对目标产物的干扰，方法简单，可操作性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种烟草内源抗烟草花叶病毒提取物及其制备方法和应用，主 要是用于田间烟草花叶病毒防治，属于烟草病毒控制技术领域。
背景技术
烟草病毒病是全世界烟草栽培区发生最普遍、危害最严重、防治最困难的 病害，又称烟草癌症，严重危害了烟叶的产量和质量，给烟农造成了巨大的经 济损失。
由于植物病毒对寄主细胞具有绝对寄生性，病毒传播方式具有多样性，而 植物缺乏完整的免疫系统，因而高效抗病毒剂的开发存在极大困难，至今尚未 有理想的防治药剂。目前，采用的农业防治措施存在较大的局限性，化学防治 则易引发环保问题。
因此，急需进行抗TMV天然产物的研究与开发是解决上述技术问题的关键 所在。
发明内容
针对上述背景技术中存在的诸多缺陷与不足，本发明对此进行了改进和创 新，目的在于提供一种对烟草花叶病毒具有较好防效的烟草内源提取物。
本发明另一个发明目的是提供一种该提取物规模化制备方法，该方法采用 密度控制的方法对浓缩物进行质量控制，有效保证了烟草内源抗烟草花叶病毒 组份制备过程的有序性和连贯性。
本发明的还一个发明目的在于提供利用烟田废弃物的提取物在防治作物病 毒病上的用途。有效祛除了烟碱对目标产物的干扰，方法简单，可操作性强， 为利用进一步系统研究烟草内源抗烟草病毒病提供物质基础和科学依据，开创 了一种田间病毒病防治新渠道。
为解决上述问题并达到上述的发明目的，本发明烟草内源抗烟草花叶病毒 组份制备方法和应用是通过采用下列的设计结构以及采用下列的技术方案来实 现的：
一种烟草内源抗烟草花叶病毒提取物的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
步骤1，提取：取晾干的烟草根茎粉碎，多次浸煮后蒸馏得到浸膏；
步骤2，纯化：将所得浸膏依次经过浓缩、洗脱、蒸馏得到浓缩液；
步骤3，干燥：将浓缩液干燥并粉碎过100目筛后收集分装。
优选的，所述步骤1中的浸煮方式为：先用20倍重量的70％甲醇-0.025 mol/L盐酸溶液浸泡10h，再40℃煎煮，提取2次得到提取液，每次200min， 提取液减压蒸馏至20℃时，密度为1.05～1.10g/cm3为止，得到浸膏。
优选的，所述步骤2中的纯化方式为：将所得浸膏以2mL/min*柱直径(cm) /1.5的流速上样至6倍量浓缩液重量的大孔吸附树脂D-101柱，纯水冲洗2BV，然 后3BV30％乙醇溶液以2mL/min*柱直径(cm)/1.5的流速冲洗杂质；步骤2中的洗 脱式为：以3.4BV的80％乙醇2mL/min*柱直径(cm)/1.5的流速洗脱得到洗脱液。
优选的，所述步骤3中的浓缩式为：把洗脱液减压蒸馏至相对密度达1.10～1.105g/cm3，温度达20℃时，得到浓缩液。
优选的，所述步骤3中的干燥式为：设定进风温度为170℃～190℃,出风温 度为90℃～92℃，离心喷雾干燥。
优选的，所述提取物的有效成分含量＝(A样/A标)*100％，以Nkolbisine为 标准品，烟草内源抗烟草花叶病毒组份有效成分含量≥80％。
优选的，提取物在烟草作物病毒病防治上的应用。
本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：
1、本发明利用烟田废弃物，经溶剂提取、色谱分离的方法形成了烟草内源 抗病毒组份规模化生产工艺和质量控制方法，并对其使用方法和范围进行了明 确，为利用进一步系统研究烟草内源抗烟草病毒病提供物质基础和科学依据， 开创了一种田间病毒病防治新渠道。
2、本发明利用醇浓度控制的方法有效祛除了烟碱对目标产物的干扰，方法 简单，可操作性强。
3、本发明采用密度控制的方法对浓缩物进行质量控制，有效保证了烟草内 源抗烟草花叶病毒组份制备过程的有序性和连贯性。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创造特征、达成目的与功效易于明白了解， 下面结合以及具体实施方式对本发明的技术方案作更进一步详细的说明，需要 说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互 组合。下面将参考并结合实施例来详细说明本发明。
一种烟草内源抗烟草花叶病毒提取物的制备方法，该制备方法包括如下步 骤：
步骤1，提取：取晾干的烟草根茎粉碎，多次浸煮后蒸馏得到浸膏；
步骤2，纯化：将所得浸膏依次经过浓缩、洗脱、蒸馏得到浓缩液；
步骤3，干燥：将浓缩液干燥并粉碎过100目筛后收集分装。
进一步的，所述步骤1中的浸煮方式为：先用20倍重量的70％甲醇-0.025 mol/L盐酸溶液浸泡10h，再40℃煎煮，提取2次得到提取液，每次200min， 提取液减压蒸馏至20℃时，密度为1.05～1.10g/cm3为止，得到浸膏。
进一步的，所述步骤2中的纯化方式为：将所得浸膏以2mL/min*柱直径(cm) /1.5的流速上样至6倍量浓缩液重量的大孔吸附树脂D-101柱，纯水冲洗2BV，然 后3BV30％乙醇溶液以2mL/min*柱直径(cm)/1.5的流速冲洗杂质；步骤2中的洗 脱式为：以3.4BV的80％乙醇2mL/min*柱直径(cm)/1.5的流速洗脱得到洗脱液。
进一步的，所述步骤3中的浓缩式为：把洗脱液减压蒸馏至相对密度达1.10～1.105g/cm3，温度达20℃时，得到浓缩液。
进一步的，所述步骤3中的干燥式为：设定进风温度为170℃～190℃,出风 温度为90℃～92℃，离心喷雾干燥。
进一步的，所述提取物的有效成分含量＝(A样/A标)*100％，以Nkolbisine 为标准品，烟草内源抗烟草花叶病毒组份有效成分含量≥80％。
进一步的，提取物在烟草作物病毒病防治上的应用。
综上所述，本发明更为具体的实施方式是：
本发明用于田间各作物病毒病防治(保护烟草内源抗病毒组份直接防治作 物病毒病或以烟草内源抗病毒组份为有效成分形成的制剂用于田间作物病毒病 防治)：
实施例1(烟草样品来源于卷烟工业生产过程中的废弃物，包括烟梗，不适用 烟叶)
烟草样品来源于卷烟工业生产过程中的废弃物，包括烟梗，不适用烟叶。 将烟草取样50kg粉碎以70％甲醇-0.025mol/L盐酸溶液提取2次，每次提取3h， 提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏5kg。浸膏用氨水调PH值为10， 以(2mL/min*柱直径(cm)/1.5)的流速上样至6倍量浓缩液重量的大孔吸附 树脂D-101柱，纯水冲洗2BV，然后3BV30％乙醇溶液(2mL/min*柱直径(cm) /1.5)的流速冲洗杂质，最后3.4BV的80％乙醇(2mL/min*柱直径(cm)/1.5) 的流速洗脱，洗脱液减压蒸馏至20℃时，密度1.10～1.105g/cm3为止。将浓 缩液用离心喷雾干燥机进行干燥，设定进风温度为170℃～190℃,出风温度 90℃～92℃，根据设备参数调整进风量和液体流量，进行喷雾干燥。干燥后 的提取物粉碎过100目筛，即得该烟草内源抗病毒组份(34g)。
实施例2(烟草样品来源于烟田废弃物，包括烟杆，烟根、烟花、烟杈、不适 用鲜烟叶)
烟草样品来源于烟田废弃物，包括烟杆，烟根、烟花、烟杈、不适用鲜烟 叶。将烟草烟田废弃物晾干，取样50kg粉碎以70％甲醇-0.025mol/L盐酸溶液 提取2次，每次提取3h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏5kg。 浸膏用氨水调PH值为10，以(2mL/min*柱直径(cm)/1.5)的流速上样至6 倍量浓缩液重量的大孔吸附树脂D-101柱，纯水冲洗2BV，然后3BV30％乙醇溶 液(2mL/min*柱直径(cm)/1.5)的流速冲洗杂质，最后3.4BV的80％乙醇(2 mL/min*柱直径(cm)/1.5)的流速洗脱，洗脱液减压蒸馏至20℃时，密度1.10～ 1.105g/cm3为止。将浓缩液用离心喷雾干燥机进行干燥，设定进风温度为 170℃～190℃,出风温度为90℃～92℃，根据设备参数调整进风量和液体流 量，进行喷雾干燥。干燥后的提取物粉碎过100目筛，即得该烟草内源抗病毒 组份(34g)。
实施例3(烟草内源抗病毒组份的含量测定)
取实施例1-2制备的烟草内源抗病毒组份，上述方法制备得到的烟草内源 抗病毒组份的含量通过以下方法进行测定。本发明烟草内源抗病毒组份为黄褐 色粉末状物；每批随机取0.5克粉末，以1mg/mlNkolbisine甲醇溶液为标准液， 1mg/ml的样品甲醇溶液为样品液，紫外分光光度计测定三次取平均值为标准液 和检测液吸光度(A)，根据测定吸光度按以下公式计算有效成分含量。
有效成分含量＝(A样/A标)*100％
烟草内源抗病毒组份有效成分含量≥80％。
实施例4(烟草内源抗病毒组份的组分鉴定)
取实施例1-2制备的烟草内源抗病毒组份，进行LC-MS分析，色谱条件为： 色谱柱为X-charge C18(4.6mm﹡250mm,5gm)；流速为0.1mL/min，柱温 30℃，进样量10uL；流动相为：A为乙腈，B为水；梯度洗脱程序：0-30min， A为5％，B为95％；30-50min，A为15％,B为85％；50-60min,A为75％,B 为25％。ESI离子源；正离子扫描检测模式；雾化气为氮气；干燥温度350℃； 干燥气流量10L/min；雾化气压40PSI；毛细管电压4000V；扫描范围50-2000 m/z。表1为本发明的组分鉴定情况。
表1
Tab.1 Component identification
由表1可知，根据高效液相质谱图谱中出峰时间和MS所测定的[M+H]+值， 确定烟草内源抗病毒组份所含8种活性生物碱： (S)-Nkolbisine-β-D-glucoside，(R)-Nkolbisine-β-D-glucoside， Lepabisine A,Methylevoxine，Nkolbisine，Skimmiamine，Myrtifoline， Evoxoidine。
实施例5
取实施例1-2制备的烟草内源抗病毒组份进行抗烟草花叶病毒活性试验， 试验情况如下：
采用半叶法，在22±1℃室温下进行，以健康、生长旺盛的5～6叶期心叶 烟供试。
钝化试验中，左半叶接种供试药剂与病毒等体积混合液，右半叶接种蒸馏 水与病毒等体积混合液(对照)。烟草内源抗病毒组份和宁南霉素均稀释50倍， 钝化时间分别为0.5、1和2h，共6个处理。每处理接种6片叶子，重复3 次，3d后统计枯斑数，按下公式计算枯斑抑制率。
抑制TMV初侵染和增殖作用试验中，烟草内源抗病毒组份的供试浓度分别 为100、300和500倍稀释液，以宁南霉素500倍稀释液为对照。初侵染试验 中，各处理分别在施药24h后接种病毒；增殖试验中，均在接种病毒后施药。 施药方式为涂抹法，左半叶涂抹供试药剂，右半叶为清水对照。每处理接种6片 叶子，重复3次，3d后统计枯斑数，按下公式计算枯斑抑制率。
枯斑抑制率(％)＝(对照枯斑数－处理枯斑数)/对照枯斑数×100
表2为烟草内源抗病毒组份对TMV的体外钝化作用情况。
表2
Tab.2 Inactivation of it to TMV in tobacco at different treatingtimes in vitro
注：表中数据均为3次重复的平均值，同列数据后不同小写字母表示经LSD多重比较在P＝0.05水平上有显著差异。下同。Note：Data in the table were the average ofthree replicates,different letters in each column indicated significantlydifferent at P＝0.05by LSD’s multiple comparison.The same as below.
由表2可知，烟草内源抗病毒组份对TMV病毒粒子具有强烈的体外钝化 活性，且随钝化时间的延长，钝化效果逐渐增强，50倍稀释液钝化5、30和 60min后，抑制率分别为82.77％、95.93％和100％，均显著高于相同钝化时间 下对照药剂宁南霉素。
表3为烟草内源抗病毒组份对TMV初侵染的抑制作用情况。
表3
Tab.3Inhibiting infectivity of TMV in N.glutinosa by extraction fortobacco
由表3可知，烟草内源抗病毒组份对TMV初侵染表现出明显的抑制作用， 施药24h后接种，在100、300和500倍稀释液处理后，对TMV的抑制率分 别达到了69.80％、62.70％和57.85％，抑制率显著高于同等稀释倍数的对照药剂 宁南霉素。
表4为本发明的烟草内源抗病毒组份对TMV复制增殖的抑制作用情况。
表4
Tab.4 Inhibiting multipl ication of TMV in N.glutinosa by extractionfor tobacco
由表4可知，烟草内源抗病毒组份对TMV的复制增殖具有较好的抑制作用。 接种24h后施药，在100、300和500倍剂量下，对TMV的抑制率分别为54.07％、 49.21％和45.29％，随着稀释倍数逐渐增大，对TMV的抑制率逐渐降低，但抑制 率显著高于同等稀释倍数的对照药剂8％宁南霉素水剂500倍液处理。
实施例6
取实施例1-2制备的烟草内源抗病毒组份进行抗烟草花叶病毒活性盆栽试验， 试验情况如下：
选择5-6叶期，长势一致、健壮的普通烟供试。试验设预防组(第3次施 药24h后接种TMV)、治疗组(接种TMV 24h后施药3次)和对照组(只接 种不施药)。分别用烟草内源抗病毒组份500倍液及宁南霉素500倍液喷雾处理， 每5d施药一次，共施药三次。TMV接种浓度为1：20(W/V)。施药结束后7d检 查发病情况，按下述公式统计病情指数及防治效果。每处理60株烟苗，试验重复 3次。
病情指数＝∑(病级数×病株数)/(最高病级×处理总株数)×100
预防效果＝(对照病指—处理病指)/对照病指×100％
治疗效果＝[1-(对照区药前病指×处理区药后病指)/(对照区药后病指×处理区药前病指)]×100％。
表5为本发明的烟草内源抗病毒组份防治烟草花叶病毒病的盆栽试验结果。
表5
Tab.5 Effect of IT against tobacco mosaic disease in pot experimen
由表5可知，烟草内源抗病毒组份对TMV的侵染表现出较好的预防作用，防 效达到70.23％，显著高于对照药剂8％宁南霉素；在治疗试验中，药效相对一般， 防效仅为35.70％，但显著高于对照药剂8％宁南霉素。
实施例7
取实施例1-2制备的烟草内源抗病毒组份进行抗烟草花叶病毒活性盆栽试验， 试验情况如下：
小区药效试验地选择连续3年种植烟草、病毒病常年发生严重的田块进行， 烟草品种为K326，烟田肥力较为均匀。烟苗4月中下旬移栽，生长健壮，长势 均匀，自然发病。试验分为预防试验和治疗试验。预防试验在烟苗移栽后尚 未发病时进行，设烟草内源抗病毒组份的100倍液、300倍液和500倍液3个剂量， 常量喷雾处理，以8％的宁南霉素500倍液为对照，并设清水对照，共7个处理， 每处理重复3次，每隔7d施药1次，3次施药7d后调查病情，共调查3次。治 疗试验在烟苗发病初期时进行，设烟草内源抗病毒组份的100倍液、300倍液2 个剂量处理，以8％的宁南霉素500倍液为对照，并设清水对照，共5个处理，每 处理重复3次，施药前调查病情指数，施药后7天(7月16日)调查病情，每隔7d 施药1次，共2次。小区面积为20m2，采用随机排列，处理间设立保护行。
田间调查病情分级标准为：0级，全株无病；1级，心叶明脉或轻微花叶， 病株无明显矮化；3级，1/3叶片花叶但不变形，或病株矮化为正常株高的3/4 以上；5级，1/3-1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或病株矮化为 正常株高2/3-3/4；7级，1/2-2/3叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或病株 矮化为正常株高的1/2-2/3；9级，全株叶片花叶，严重变形或坏死，或株矮化 为正常株高的1/2以上。
病情指数＝∑(病级数×病株数)/(最高病级×处理总株数)×100
预防效果＝(对照病指—处理病指)/对照病指×100％
治疗效果＝[1-(对照区药前病指×处理区药后病指)/(对照区药后病指×处理区药前病指)]×100％。
表6为本发明的烟草内源抗病毒组份对烟草病毒病的保护作用情况。
表6
Tab.6 Protection effect of it against tobacco mosaic disease in fieldtrial
由表6可知，烟草内源抗病毒组份各浓度处理对烟草病毒病均具有良好的 预防作用，其100倍液对烟草病毒病的效果最好，药后7d、14d和21d的防效 分别达56.03％、55.17％和50.23％，显著高于对照药剂宁南霉素。
表7为本发明的烟草内源抗病毒组份对烟草病毒病的治疗作用情况
表7
Tab.4-6 Remedial effect of it against tobacco mosaic disease in fieldtrial
由表7可知，烟草内源抗病毒组份对烟草病毒病表现出较好的治疗效果。烟 草内源抗病毒组份400倍液药后14d的治疗效果仍达49.20％，显著高于同剂量 的宁南霉素400倍液处理。
表8为各处理大田烟株经济性状比较情况。
表8
注：每亩按1000株折算。单位：公斤
由表8可知，烟草源抗病毒制剂处理可有效提高烤烟产值量。在产量方面， 烟草源抗病毒制剂处理平均提升20公斤烟叶亩产，提升效果优于宁南霉素处理； 在产值方面，烟草源抗病毒制剂处理亩均产值提升700.00元以上，经济效益显著。
最后需要说明的是，以上已结合实施例和对本发明的构思、具体结构及产生 的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。 显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本 发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实 施例，均属于本发明保护的范围。另外，文中所提到的所有联接、连接关系，并 非单指构件直接相接，而是指可根据具体实施情况，通过添加或减少联接辅件， 来组成更优的联接结构。本发明创造中的各个技术特征，在不互相矛盾冲突的前 提下可以交互组合。
Claims (7)
1.一种烟草内源抗烟草花叶病毒提取物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：
步骤1，提取：取晾干的烟草根茎粉碎，多次浸煮后蒸馏得到浸膏；
步骤2，纯化：将所得浸膏依次经过浓缩、洗脱、蒸馏得到浓缩液；
步骤3，干燥：将浓缩液干燥并粉碎过100目筛后收集分装。
2.根据权利要求1所述的一种烟草内源抗烟草花叶病毒提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的浸煮方式为：先用20倍重量的70％甲醇-0.025mol/L盐酸溶液浸泡10h，再40℃煎煮，提取2次得到提取液，每次200min，提取液减压蒸馏至20℃时，密度为1.05～1.10g/cm3为止，得到浸膏。
3.根据权利要求1所述的一种烟草内源抗烟草花叶病毒提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的纯化方式为：将所得浸膏以2mL/min*柱直径(cm)/1.5的流速上样至6倍量浓缩液重量的大孔吸附树脂D-101柱，纯水冲洗2BV，然后3BV30％乙醇溶液以2mL/min*柱直径(cm)/1.5的流速冲洗杂质；步骤2中的洗脱式为：以3.4BV的80％乙醇2mL/min*柱直径(cm)/1.5的流速洗脱得到洗脱液。
4.根据权利要求1所述的一种烟草内源抗烟草花叶病毒提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的浓缩式为：把洗脱液减压蒸馏至相对密度达1.10～1.105g/cm3，温度达20℃时，得到浓缩液。
5.根据权利要求1所述的烟草内源抗烟草花叶病毒组份提取物的制备方法其特征在于，所述步骤3中的干燥式为：设定进风温度为170℃～190℃,出风温度为90℃～92℃，离心喷雾干燥。
6.一种权利要求1～5任一项所述的烟草内源抗烟草花叶病毒提取物，其特征在于，所述提取物的有效成分含量＝(A样/A标)*100％，以Nkolbisine为标准品，烟草内源抗烟草花叶病毒组份有效成分含量≥80％。
7.一种权利要求1～6任一项所述的烟草内源抗烟草花叶病毒提取物，其特征在于，提取物在烟草作物病毒病防治上的应用。
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