CN110074113B - 大球盖菇多糖的应用、植物免疫诱抗剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大球盖菇多糖的新应用、以大球盖菇多糖为有效成分的植物免疫诱抗剂及应用。(1)本发明通过株高、干重、叶龄、叶绿素含量、根系活力、等指标有效证明了大球盖菇多糖能促进水稻生长、提高秧苗素质。(2)本发明的植物免疫诱抗剂可增加每穗粒数和结实率，从而实现水稻增产。(3)本发明的植物免疫诱抗剂对于水稻纹枯病和穗腐病的防治效果好，且在处理浓度下对水稻安全。

Description

大球盖菇多糖的应用、植物免疫诱抗剂及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种大球盖菇多糖的应用、植物免疫诱抗剂及应用。

背景技术

水稻纹枯病是由立枯丝核菌感染引起的真菌性病害，在我国普遍发生。发病后，水稻叶片枯死，结实率下降，千粒重减轻，秕谷较多，一般减产10-30％，严重时减产50％。目前已成为我国水稻发生面积最大的病害。

对于该病的防控，多采用井冈霉素、丙环唑、烯唑醇、己唑醇等进行防治，但井冈霉素持效时间不长，且高质量浓度毒性较大，可能对土壤微生物造成不可恢复的影响。烯唑醇、丙环唑等唑类杀菌剂对水稻体内的赤霉素形成有影响，能抑制水稻茎节拔长。但这些杀菌农药在水稻上部3个拔长节间拔长期使用，特别是超量使用，可能影响这些节间的拔长，严重的可造成水稻抽穗不良，出现包颈现象，其中烯唑醇等药制的抑制作用更为明显。

水稻穗腐病是一种真菌性病害，致病菌为多种真菌，其中，优势致病菌主要为镰刀菌、细交链孢菌、平脐孺孢菌和新月弯孢菌。水稻感染该病后其结实率降低，谷粒变色、腐坏、畸形，降低稻米的品质；病原菌产生的毒素影响农产品的质量安全。近年来，我国一些水稻产区的穗腐病发生日趋严重，且有效防治药剂较少。

植物免疫诱抗剂又称植物疫苗，能够激活植物体内分子免疫系统，使植物自身产生抗菌物质，提高植物抗病性，同时还能激发植物体内的一系列代谢调控系统，具有促进植物生长和增加作物产量的作用。植物天然免疫具有预防性、系统性、稳定性、相对性、安全性等一系列优点，可以解决化学防治存在的病原菌抗药性、环境污染和对人畜副作用的问题，实现农产品无害化生产和农业可持续发展。

食用菌多糖是一类具有高度生理活性植物免疫诱抗剂，可诱导寄主植株活性氧的释放和植保素的合成，产生诱导抗性而达到抑制病害作用。同时，食用菌多糖对植物体的蛋白质合成具有促进作用，使作物更加健壮，抗病性显著增强。

目前我国实现商品化的食用菌源生物农药仅有香菇多糖和菇类蛋白多糖，能够防治水稻、西瓜、辣椒、番茄、茄子、烟草、马铃薯等作物的病毒病，但在植物真菌性和细菌性病害防治上应用不多。

大球盖菇又名酒红色球盖菇、皱环球盖菇，属于担子菌门球盖菇属。其抗杂和抗逆能力较强，适应温度范围广，对纤维素、木质素降解能力强，可以在林地和农闲田进行栽培。近年来，大球盖菇在我国部分省市栽培面积不断扩大，福建、江西、四川、浙江等地均有大规模栽培。目前对大球盖菇生物学特性和栽培技术方面的研究比较成熟，此外发现其含有多糖、留醇、黄酮、酚类物质、凝集素等生物活性成分，具有抗氧化、抑菌、抑制肿瘤、降血糖等药理作用。现有研究成果表明，大球盖菇多糖能增强动物肌体免疫功能，具有抗肿瘤、抗氧化、缓解疲劳等功效，但对其在诱导植物抗性方面的功能研究尚未见报道。因此，有必要对大球盖菇多糖的功能做进一步地深入探究。

发明内容

本发明提供了一种大球盖菇多糖的新应用，以及有效成分为大球盖菇多糖的植物免疫诱抗剂及该植物免疫诱导剂的应用。

本发明提供了大球盖菇多糖在促进水稻幼苗生长或提高水稻秧苗素质中的应用。大球盖菇多糖处理下水稻的株高、根长、干重、较对照显著增加，幼苗的叶龄也有所增加，这说明：大球盖菇多糖对水稻幼苗具有显著的促生长作用。同时，经大球盖菇多糖处理后的水稻幼苗叶绿素含量和根系活力显著高于对照，说明大球盖菇多糖能提高秧苗的素质。

其中，所述大球盖菇多糖的制备方法包括以下步骤：

(1)将大球盖菇子实体磨粉后加水混合均匀；

(2)加入木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶进行酶解；

(3)酶解产物去除固体物质获得多糖提取液；

(4)将多糖提取液去蛋白，再用乙醇沉淀多糖获得大球盖菇多糖。

其中，步骤(2)中木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶按质量比2∶1∶1混合制成混合酶。酶解最合适的温度为55℃。步骤(4)中使用Sevag法除蛋白。

本发明又提供了一种植物免疫诱抗剂，有效成分为大球盖菇多糖。优选的，所述的植物免疫诱抗剂，，包括质量浓度为100～150ppm的大球盖菇多糖，质量浓度为0.001～0.02％的表面活性剂，质量浓度为0.0006～0.002％的防腐剂。更优选的，所述表面活性剂为Tween-20，所述防腐剂为山梨酸钾。

所述的植物免疫诱抗剂，其中，所述大球盖菇多糖的制备方法包括以下步骤：

(1)将大球盖菇子实体磨粉后加水混合均匀；

(2)加入木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶进行酶解；

(3)酶解产物去除固体物质获得多糖提取液；

(4)将多糖提取液去蛋白，再用乙醇沉淀多糖获得大球盖菇多糖。

其中，步骤(2)中木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶按质量比2∶1∶1混合制成混合酶。酶解最合适的温度为55℃。步骤(4)中使用Sevag法除蛋白。

本发明又提供了所述的植物免疫诱抗剂在通过增加水稻每穗粒数和结实率从而增加水稻产量中的应用。

本发明又提供了所述的植物免疫诱抗剂在防治水稻纹枯病或穗腐病中的应用。

本发明还提供了一种水稻幼苗的培养方法，包括：将水稻种子放入含有大球盖菇多糖的水溶液中进行浸渍，取出后，清洗干净，再进行种子催芽，得到水稻幼苗。优选的，所述大球盖菇多糖的浓度为100～150ppm；浸渍的时间为20～30h，温度为25～30℃。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过株高、干重、叶龄、叶绿素含量、根系活力、等指标有效证明了大球盖菇多糖能促进水稻生长、提高秧苗素质。

(2)本发明的植物免疫诱抗剂可增加每穗粒数和结实率，从而实现水稻增产。

(3)本发明的植物免疫诱抗剂对于水稻纹枯病和穗腐病的防治效果好，且在处理浓度下对水稻安全。

具体实施方式

实施例1

大球盖菇多糖制备，采用复合酶法提取大球盖菇多糖，具体步骤如下：

1.将大球盖菇子实体洗净，烘干，磨粉，过80目网筛获得大球盖菇菌粉；

2.称取过筛的大球盖菇菌粉20g，放到烧杯中，加蒸馏水580mL混合均匀后置于55℃水浴锅中预热；

3.将木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶按质量比2∶1∶1比例混合得到混合酶，称取0.12g混合酶，用5mL蒸馏水溶解后加入预热的大球盖菇菌粉水溶液；

4.经55℃水浴2h；

5.反应结束后将三角瓶放到沸水锅中，沸水浴10分钟以灭活酶，再冷却至室温获得提取液；

6.将提取液放入离心管中，4000转/分钟离心，取上清液，即得到酶提取多糖上清液；

7.用旋转蒸发仪浓缩上清液至1/4体积；

8.Sevag法除蛋白，30mL上清液加入5mL Sevag溶液(体积比4∶1的氯仿∶正丁醇溶液)，震荡20分钟，5000r/min离心10分钟，留取上清；重复抽提5-6次，直至蛋白去除干净；

9.取上清，加入3倍体积无水乙醇沉淀过夜，8000rpm离心；去上清，干燥沉淀，得大球盖菇多糖。

对上述提取得到的大球盖菇多糖进行成分及含量检测。

大球盖菇多糖的单糖组分分析：

通过液相色谱法分析了大球盖菇多糖的单糖组成，结果见表1。大球盖菇多糖主要由甘露糖、核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖等单糖组成，其中葡萄糖组分含量最高，为111.83μg/mg。

表1大球盖菇多糖的单糖组成分析

单糖种类	含量(μg/mg)
		甘露糖	28.56
核糖	16.08
		鼠李糖	31.38
阿拉伯糖	1.51
		木糖	5.65
葡萄糖	111.83
		半乳糖	37.72

大球盖菇多糖分子量分布测定：

利用角度激光光散射仪测定大球盖菇多糖的分子量分布，结果如表2所示。

表2大球盖菇多糖的分子量分布

大球盖菇多糖抗氧化活性测定：

以DPPH自由基(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)清除率和ABTS自由基清除率为指标测定了大球盖菇多糖体外抗氧化活性。结果表明，在1mg/mL浓度下大球盖菇多糖对DPPH自由基清除清除率为43％；对ABTS自由基清除率为51.6％。因此该多糖具有抗氧化活性。

实施例2

大球盖菇多糖处理水稻幼苗。

实验用杂交水稻品种：‘中浙优1号’，由浙江勿忘农种业有限公司提供。

具体方法如下：

1.称取10g‘中浙优1号’水稻种子，在水稻培养盒中倒入200mL超纯水，放入30℃水稻培养箱浸种一天；

2.倒掉上层水以及上浮的不合格种子，清洗种子两遍，将纱布润湿，铺在种子表面，放入30℃培养箱中催芽一天；

3.配制0.35％琼脂溶液，放在电磁炉上煮沸10分钟至无明显固体颗粒；

4.待温度降低到40℃时，加入实施例1制备的大球盖菇多糖，配制成含有100ppm多糖的水稻琼脂培养基，再倒入专用发芽盒(13×19×12cm)中，每个发芽盒加入300mL琼脂培养基，每个处理3次重复；

5.挑选已经露白的水稻种子，用镊子将种子插入琼脂培养基中，每个发芽盒插入50粒种子，注意将露白一面朝上，不要将已经长出的芽头弄断，不要插入太深，埋入琼脂1/2即可；随后再往发芽盒中缓缓注入35℃左右的空白0.35％琼脂溶液50mL，覆盖多糖琼脂表面即可，可以防止细菌污染；

6.放入培养室中培养，培养条件为27℃，湿度70％，光照时间18小时，培养10天测量指标，当水稻长到快顶到瓶口时，掀开薄膜，向每瓶中加入等量的纯水。

7.播种后21天取具代表性秧苗考察株高、叶龄、干重、叶绿素含量及根系活力等性状，比较大球盖菇多糖处理对水稻幼苗生长和素质的影响。

结果分析：从表3中可以看出，大球盖菇多糖处理下株高、根长、干重、较对照显著增加，幼苗的叶龄也有所增加。这说明：大球盖菇多糖对水稻幼苗具有显著的促生长作用。同时，经大球盖菇多糖处理后的水稻幼苗叶绿素含量和根系活力显著高于对照，说明大球盖菇多糖能提高秧苗的素质。

表3、大球盖菇多糖对水稻幼苗生长和素质的影响

注：每列数字后面的字母不同，表示上下两组数据有显著差异，小写字母表示5％显著水平下的差异，大写字母表示1％极显著水平下的差异。

实施例3

一、试验材料

杂交水稻品种：‘中浙优1号’，由浙江勿忘农种业有限公司提供。

一种植物免疫诱抗剂：以总重量1千克计，各组分的用量为：

Tween-20 0.01g；

大球盖菇多糖 0.1～0.15g；

山梨酸钾 0.006g；

余量为水。

本实施例中大球盖菇多糖的制备方法与实施例1相同。

二、免疫诱抗剂施用方式

2018年6月上旬开始，在中国水稻研究所富阳水稻试验基地进行田间试验。大田种植规格为30厘米×18厘米，每处理10平方，3个重复。拔节期后，叶面喷施免疫诱抗剂，每周一次，至抽穗后停止喷施，共喷4次。同时设置化学农药及清水对照。在水稻生长到黄熟期，在每个小区取具代表性植株30丛，考查有效穗数并测产，取代表性植株3株考种，测定穗粒结构。

三、结果分析

结果如表4所示，比较大球盖菇多糖植物免疫诱抗剂对水稻产量及穗粒结构的影响，经处理后产量达660.41kg/亩，与化学农药对照和清水对照比较产量均达显著差异，其中比化学农药对照增产达53.57kg/亩，增产幅度为8.83％。分析该制剂对产量构成因素的影响，结果表明，其可增加每穗粒数和结实率，从而实现增产。

表4大球盖菇多糖对水稻产量及穗粒结构的影响

注：每列数字后面的字母不同，表示上下两组数据有显著差异，大写字母表示1％极显著水平下的差异。

实施例4

一、试验材料

水稻品种：感纹枯病杂交稻品种‘甬优12’，感稻穗腐病优质常规粳稻嘉58。

一种植物免疫诱抗剂：以总重量1千克计，各组分的用量为：

Tween-20 0.01g；

大球盖菇多糖 0.1～0.15g；

山梨酸钾 0.006g；

余量为水。

本实施例中大球盖菇多糖的制备方法与实施例1相同。

二、免疫诱抗剂施用方式

2018年6月上旬开始，在中国水稻研究所富阳水稻试验基地进行田间试验。大田种植规格为30厘米×18厘米，每处理10平方，3个重复。纹枯病防治为7月15日，7月25日和8月1日各喷一次(8月1日喷对照药剂)；穗腐病防治时间为为拔节期后，叶面喷施免疫诱抗剂，每周一次，至抽穗后停止喷施，共喷4次，同时设置化学农药及清水对照。

纹枯病病情在末次施药10天和17天，即8月11日和8月18日两次调查；穗腐病病情在成熟前进行调查。

三、结果分析

对水稻纹枯病的防效：对病情调查后再进行统计分析，植物免疫诱抗剂对纹枯病病害的防效结果见表5。从第一次调查的结果来看，免疫诱抗剂的防效达到了83.57％，显著优于对照药剂井冈霉素的72.18％，和对照药剂噻呋酰胺的86.34％的防效相当。从第二次调查的结果来看，免疫诱抗剂的防效仍能达到73.74％，和井冈霉素69.19％的防效相当，但不及对照药剂噻呋酰胺的86.83％。从两次调查结果来看，免疫诱抗剂对水稻纹枯病表现出优异的防控效果，虽然尚不及对照药剂噻呋酰胺，但优于对照生物农药井冈霉素。

表5试验设计及各处理对水稻纹枯病的防控效果

注：数据显著性分析结果一栏中，大写字母表示1％极显著水平下的差异，小写字母为5％显著水平下的差异。

对水稻穗腐病的防效：调查结果见表6，表明免疫诱抗剂处理对嘉58穗腐病有一定的防冶效果，病级指数和病情指数显著低于清水对照，防冶效果达44.8％，略优于化学农药，但差异不显著。

表6复合免疫诱抗剂和多糖处理对嘉58穗腐病的防冶效果

处理	病级指数	病情指数	防效	防效差异
					清水对照	3.2	35.7	/	/
化学农药	1.9	20.9	41.5	A a
					免疫诱抗剂	1.8	19.7	44.8	A a

安全性调查：通过施药后观察发现，免疫诱抗剂处理过的水稻抽穗齐整，均无包穗现象，水稻叶色、叶片大小、株高、幼穗分化、开花和结实等其它生长发育性状未见明显差异，未观察到药害的发生。因此，免疫诱抗剂在处理浓度下对水稻安全。

Claims (9)

1.大球盖菇多糖在促进水稻幼苗生长或提高水稻秧苗素质中的应用，

所述大球盖菇多糖的制备方法包括以下步骤：

(1)将大球盖菇子实体磨粉后加水混合均匀；

(2)加入木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶进行酶解；

(3)酶解产物去除固体物质获得多糖提取液；

(4)将多糖提取液去蛋白，再用乙醇沉淀多糖获得大球盖菇多糖。

2.植物免疫诱抗剂在通过增加水稻每穗粒数和结实率从而增加水稻产量中的应用，所述植物免疫诱抗剂的有效成分为大球盖菇多糖，

所述大球盖菇多糖的制备方法包括以下步骤：

(1)将大球盖菇子实体磨粉后加水混合均匀；

(2)加入木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶进行酶解；

(3)酶解产物去除固体物质获得多糖提取液；

(4)将多糖提取液去蛋白，再用乙醇沉淀多糖获得大球盖菇多糖。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物免疫诱抗剂包括质量浓度为100～150ppm的大球盖菇多糖，质量浓度为0.001～0.02％的表面活性剂，质量浓度为0.0006～0.002％的防腐剂。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述表面活性剂为Tween-20，所述防腐剂为山梨酸钾。

5.植物免疫诱抗剂在防治水稻纹枯病或穗腐病中的应用，所述植物免疫诱抗剂的有效成分为大球盖菇多糖，

所述大球盖菇多糖的制备方法包括以下步骤：

(1)将大球盖菇子实体磨粉后加水混合均匀；

(2)加入木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶进行酶解；

(3)酶解产物去除固体物质获得多糖提取液；

(4)将多糖提取液去蛋白，再用乙醇沉淀多糖获得大球盖菇多糖。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物免疫诱抗剂包括质量浓度为100～150ppm的大球盖菇多糖，质量浓度为0.001～0.02％的表面活性剂，质量浓度为0.0006～0.002％的防腐剂。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述表面活性剂为Tween-20，所述防腐剂为山梨酸钾。

8.一种水稻幼苗的培养方法，其特征在于，包括：将水稻种子放入含有大球盖菇多糖的水溶液中进行浸渍，取出后，清洗干净，再进行种子催芽，得到水稻幼苗，

所述大球盖菇多糖的制备方法包括以下步骤：

(1)将大球盖菇子实体磨粉后加水混合均匀；

(2)加入木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶进行酶解；

(3)酶解产物去除固体物质获得多糖提取液；

(4)将多糖提取液去蛋白，再用乙醇沉淀多糖获得大球盖菇多糖。

9.如权利要求8所述水稻幼苗的培养方法，其特征在于，所述大球盖菇多糖的浓度为100～150ppm；浸渍的时间为20～30h，温度为25～30℃。